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방법 논문

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

7.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56631

⸱

2018년 1월 26일

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

이 논문에서

요약

우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.

초록

두뇌 개발 transcriptional 프로그램과 다른 morphogens의 기울기로 영역 공간 방식으로 제어 되는 복잡 한 과정 이다. 또한, 히스톤 메 틸 화 처럼 epigenetic chromatin 수정 설치 하 고이 프로세스에서 특정 세포 운명을 유지에 대 한 중요 한 역할이 있다. 대부분 히스톤 메 틸 화는 히스톤 한정자, 지우개, 및 히스톤 리더 단백질 유연한 히스톤 꼬리에 발생 합니다. 대조적으로, H3K79 메 틸 화는 히스톤 3의 구형 도메인에 있으며 다른 발달 기능에 연루. H3K79 메 틸 화 봤을 보존 하 고 찾을 수 있습니다 다양 한 종에서에서 호모 사피엔스 에서 Saccharomyces cerevisiae. 수정 신경 창시자를 포함 한 유기 체 내의 다른 세포 인구에서 발생 합니다. 히스톤 3의 구형 도메인에서 H3K79 메 틸 화의 위치는 평가 하기 어려운 있습니다. 여기, 우리가 격리 하는 방법을 제시 하 고 문화 대뇌 피 질의 조상 세포 (Cpc) 배아 대뇌 피 질의 뇌 조직 (E11.5-E14.5) 또는 소 뇌과 립 상 신경 창시자 (CGNPs)에서 출생 후 조직 (P5-P7), 그리고 효율적으로 immunoprecipitate에서 정량 PCR (정량) 및 게놈 넓은 시퀀싱에 대 한 H3K79me2.

서론

두뇌의 감각, 모터, 및 인식 함수는 매우 복잡 하 고 물리적, 환경 변화에 취약 합니다. 깊이 연결 되는 3 개의 일반적인 부품은 뒷 다리-, 중간-및 개, 두뇌에 의하여 이루어져 있다. 개, 내는 telencephalon 등 telencephalon (DT)와 복 부 telencephalon (VT)으로 나눌 수 있습니다. 6 대뇌 피 질의 레이어 E11.5와 E18.5 사이 "내부-아웃" 방식으로1에서 형성 되는 쥐의 DT에 의하여 이루어져 있다. 버몬트 나중 형성 기초 중추2,3개발에 절 정령을 포함 합니다. 여러 종류 나눌 수 있다 신경, 이다, 또는 oligodendrocytes4같은 포유류 중추에서5영역 공간으로에서 발전 하는. 첫째, 신경 조상 세포 (Npc)에 게 상승 다른 종류의 뉴런, 버몬트, 및 프로젝션 뉴런 수 DT에서 그리고 glial 세포 (예를 들면, 이다6) 나중에. 대뇌 피 질의 개발, 가장 표면 층 (전 층), 먼저 형성 된다 Cajal Retzius 셀 포함. 다음, E12.5 및 E14.5, 사이 NPCs 더 깊은 신경 층 (VI, V) 동안 14.5, 16.5, 창시자 줄 상승 상위 레이어 (4-II) 신경7,8사이 생성합니다. 신경 정체성 다른 morphogen 유발 영역 공간 transcriptional 프로그램 및 또한 epigenetic 프로그램2에 의해 지정 됩니다.

모터 조정에 연루는, 소 뇌는 hindbrain에 있으며, 쥐9E10 사이 대략 P20 개발. 그것은 소 뇌 피 질과 소 뇌 핵10포함 되어 있습니다. 3 레이어, 가장 뒤쪽 분자 층, Purkinje 세포 층 그리고 포함 하는 세부적인 신경10안쪽 세분화 된 계층 성인 소 뇌 피 질에 의하여 이루어져 있다. 소 뇌과 립 세포 작은 신경 이며11척 추가 있는 두뇌 모든 뉴런의 약 80%를 나타냅니다. 그들은 선구자 외부 새싹 영역에서 개발 하 고 그들의 대상12Purkinje 세포 층을 통해 이동. 처럼 telencephalon에서 소 뇌의 개발은 몇 가지 중요 한 morphogens에 의해 규제 됩니다, 어떤 특정 시간 및 공간 종속 기능을가지고 시작 정의 transcriptional 프로그램10.

대뇌와 소 뇌 레이어의 개발 특정 morphogens의 transcriptional 식으로 하 고, 따라서, DNA의 염색 질 상태에 의해 제어 됩니다. 단순화 된 보기에서 chromatin 상태 transcriptionally 활성화로 euchromatin와 섬으로 transcriptionally 자동 영역으로 나눌 수 있습니다. Chromatin의 기본 단위로 nucleosome의 복사본 두 개가 각 코어 히스톤 H2A, H2B, H3, H4, 둘러싸인 147 기본적인 쌍 DNA13의 포함 되어 있습니다. 히스톤 메 틸 화, acetylation, 인 산화, ubiquitination, sumoylation, ADP ribosylation, 탈, 그리고 프롤린 isomerization14,15post-translationally 높은 수정 됩니다. 히스톤 lysine 메 틸 화 녹음 방송, 복제, 재결합16, DNA 손상 응답17및 게놈 각 인18제어 하는 가장 안정적인 히스톤 수정 될 여겨진다. Lysines 모노, 디, 또는 트라이 갠19 하 고 액세스할 수 히스톤 꼬리에 뿐만 아니라 히스톤20의 구형 도메인 내의 표시 수 있습니다. H3K4 및 H3K36에 특정 methylations euchromatin와 주로 관련 된, 모든 잔류물은 히스톤 꼬리14, 내에 있는 특정 methylations H3K9, H3K27, 또는 H4K20에 주로 heterochromatic 지구에서 발견은 19,21. H3K79 메 틸 화는 히스톤 구형 도메인 내에 있는 이며 transcriptional 활동, 뿐만 아니라 transcriptionally 불활성 게놈 지역22와 연결 되었습니다. 수정이 효 모, 송아지 흉 선, 닭, 및 인간의23에서 관찰 되었습니다 때문에 진화론 보존 됩니다. H3K79 모노, 디, 및 trimethylation (H3K79me1, me2, me3) 히스톤 methyltransferases DOT1L,2425 와26핵 설정된 도메인에 포함 된 단백질 2 (Nsd2) 의해 촉매 된다. DOT1L 확산, DNA 수리, 및27reprograming 휴대에 연루 이다. 쥐에서 Dot1l 의 손실 발달 단계 E10.5,2829주위 태아 죽음에 이르게. 심장 개발 및 myocardiocyte 차별화, DOT1L 유전자 표현 규칙30에 대 한 필수적입니다. 중앙 신 경계에 DOT1L 기능 신경 튜브 개발31에 연루 수 있습니다, 그것은 Tbr1억제에 관여-개 개발32, 중 식 그리고 ER 스트레스의 규정에서 작동 수 있습니다 응답 유전자33. 부분적으로 이해 하는32만 맞는 활성화 또는 억압 작업과 H3K79me의 특히 중앙 신경 시스템의 개발 같은 경우 vivo에서 날짜입니다. H3K79 메 틸 화는 히스톤 3의 구형 도메인에 위치 하 고 있습니다, 이후 그것은 sterically 유연한 히스톤 꼬리23에 수정에 비해 액세스. H3K79 메 틸 화의 기능을 이해 하려면 그것의 위치 및 게놈 환경 결정을 신뢰성과 재현성 분석 방법 필요 합니다. 이 방법 종이에서는 다른 신경 창시자 (피 질에 대 한 Cpc) 및 소 뇌에 대 한 CGNPs, 효과적인 DOT1L 억제제 치료, 및 칩 메서드 분석 정량 또는 다른 시간에 시퀀싱을 통해 메 틸 H3K79를의 격리 방법 소개 대뇌와 소 뇌 개발 하는 동안 포인트입니다. 에 대 한 프로토콜 및 그것의 가능성의, 그림 1을 참조 하십시오.

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프로토콜

프라이부르크 대학교와 지방 자치 단체의 동물 복지 위원회 승인 다음 프로토콜에서 언급 된 모든 동물 실험 (G12/13, G16/11).

1입니다. 준비

  1. Cpc 격리에 대 한 준비
    1. 타임 (E11.5 E14.5 사이) 피 질 개발의 다른 단계에서 배아를 짝짓기를 설정 합니다. 적어도 8 주 오래 되는 스트레인 NMRI (해군 의학 연구소)의 마우스를 사용 합니다. 짝짓기 후 E0.5에서 긍정적인 질 플러그를 고려 하십시오.
    2. 충분 한 물자가 E12.5 또는 E14.5의 외피가에서 한 H3K79me2 칩에 대 한 NMRI 쥐의 한 쓰레기를 사용 합니다. 배아 단계 나중에 대 한 더 많은 칩 분석에 대 한 한 쓰레기를 사용 (평균 담가 크기 NMRI: 10 배아).
    3. 쿨 Hank´s 균형 소금 솔루션 (HBSS) 및 4 ° c (RT에서 장기 저장) 인산 염 버퍼 염 (PBS).
    4. Equilibrate 4 ° C 저장 트립 신-EDTA (0.05 %w / v) 37 ° c
    5. 준비 대뇌 피 질의 세포 매체 (CCM): 2% (v/v) B-27 보충, 5 µ g/mL Apo 올려진다, 1 µ g/mL 티, 0.5 m m L-글루타민, 0.8 µ g/mL Superoxide dismutase, 및 1% (v/v)의 최종 농도와 신경 ( 재료의 표참조)에 대 한 매체를 보충 페니실린 스 네오 마이 신 항생제 혼합입니다. 4 ° c.에 그것을 저장합니다 실험에 대 한 equilibrate 매체를 37 ° c.
    6. 녹여 송아지 태아 혈 청 (FCS), aliquot (50 mL 각), 그것 고 37 ° C (-20 ° C에서 장기 저장)을 한 약 수를 equilibrate.
    7. 세포 배양에 대 한 H2O DNAse 1 (10mg/mL)의 주식을 준비 합니다. -20 ° c.에 aliquots 저장
    8. 필요한 경우, 분해는 특정 DOT1L 억제제 EPZ-5676 또는 DMSO에 SGC0946 100 m m의 재고 농도에. 0에서 1-5 µ M의 최종 농도 있는 셀에 적용 하 고는 억제제에 다시 매 2 일 적용.
    9. CPC 재배, 코트 세포 배양 배지 (6 잘 또는 12 잘) RT에서 적어도 1 시간에 대 한 폴 리-L-ornithine hydrobromide (150 m m 붕 소의 산 성 ph 8.4 1 mg/mL)와 함께 이후에 laminin (1 mg/mL) 37 ° C에서 CCM 매체에서 하룻밤.
  2. CGNP 절연에 대 한 준비
    1. 소 뇌 (칩과 조건 당 3-5 동물)의 분리에 대 한 P5-P7 동물을 생성 하는 쥐의 적절 한 짝짓기를 구성 합니다.
    2. HBSS 버퍼에 포도 당 6 mg/mL을 추가 하 여 HBSS/포도 당을 준비 합니다.
    3. 1% (v/v) n 2 보충, 1% (v/v) 페니실린-스-네오 마이 신, 25 m m KCl과 10% FCS DMEM-f 12를 추가 하 여 CGNP 세포 배양 매체 (CGM)를 준비 합니다. CGNP 재배에 대 한 FCS 하지만 0.6 µ g/mL 소닉 더 헤지호그 (SHH) (CGM-쉬)를 포함 하 여 없이 CGM 매체를 준비 하 고 필요할 때 37 ° C에 equilibrate.
    4. 코트와 100 µ g/mL 폴 리-D-lysine 명과 셀 제거를 위한 RT에 1-2 h 6-잘 세포 배양 배지. 이후에 살 균 ddH2O와 두 번 세척 하 고 건조 접시를 보자. 4 ° c.에 최대 1 주일에 대 한 판 저장
    5. CGNPs 코트 6-잘 세포 배양 배지 폴 리-L-ornithine (0.1 mg/mL) 4 ° C에서의 재배에 대 한 하룻밤. 이후에 H2O 세포 배양에 대 한 두 번 씻어 버리고 건조 접시.
      참고: 번호판은 4 ° c.에 최대 1 주일 동안 저장 될 수 있다
    6. HBSS/포도 당에서 0.025 %trypsin (w/v)을 준비 하 고 필요할 때 37 ° C에 equilibrate.
  3. H3K79me2의 칩에 대 한 준비
    1. 가교 chromatin 전에 갓 PFA (PBS, pH 8의 1%)를 준비 합니다. PFA 열 최대 65 ° c.에 전자 레인지에 50 mL PBS 준비 지속적인 교 반 중 0.5 mg PFA는 PBS에 추가 합니다. 다음 50 µ L을 추가 10 M NaOH와 PFA 해산 때까지 기다립니다. 이후에, 추가 42.5 µ L HCl (37 %v / v) 8의 pH를 얻을. PH를 다시 확인 하 고 하자 1 %PFA 솔루션 실시간에 도달
    2. 주식 준비 RNase (1 mg/mL)와 가수분해 K (20 µ g / µ L)에서 별도로 살 균 ddH2오-20 ° c.에 aliquots 저장
    3. 다음 버퍼 및 시 약 준비: 0.02%를 포함 하는 PBS 트윈, 세포의 용 해 버퍼, 글리신, 희석 버퍼, 버퍼 1, 칩 버퍼 2, 칩 버퍼 3, 및 테 버퍼 칩 및 4 ° c.에서 그들을 저장 차입 버퍼 준비 갓 각 시간.
      1. 0.02%를 포함 하는 PBS 준비 트윈. 대부분 1 주일에서 4 ° c.에 대 한 저장소
      2. PH 8.0, 10 mM EDTA, 1% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 프로 테아 제 억제제 x 1에서 50mm 트리 스를 사용 하 여 세포의 용 해 버퍼를 준비 합니다.
      3. 2.5 M 글리신을 준비 합니다.
      4. 희석 사용 하 여 버퍼 20 mM Tris pH 8.0, 150 m NaCl, 2 mM EDTA, m에서 1% (v/v) 트라이 톤 X-100 0.25% (w/v) SDS, Protease 억제제 x 1를 준비 합니다.
      5. 칩 버퍼 1에서 사용 하 여 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) 트라이 톤 X-100 그리고 0.2% (w/v) SDS 준비 합니다.
      6. 칩 버퍼 2 사용 하 여 20 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) 트라이 톤 X-100 그리고 0.2% (w/v) SDS 준비 합니다.
      7. 칩 버퍼 3 사용 하 여 20 mM Tris pH 8.0, 250mm LiCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) NP-40, 및 1% (w/v) SDS 준비 합니다.
      8. 20 mM Tris pH 8.0와 2 mM EDTA를 사용 하 여 테 버퍼를 준비 합니다.
      9. 포함 하는 1% (w/v) SDS, 100 mM NaHCO3신선한 차입 버퍼를 준비 합니다.

2. 신경 조상 고립 뇌 조직의

  1. 절연 및 Cpc의 선택적 재배
    1. 자 궁 경부 전위에 의해 임신 동물을 안락사 하 고 차가운 HBSS 배아 전송.
    2. 가 위 두개골을 제거 그리고 뇌를 분리 제거 meninges, 작은 집게와 격리 외피가 (전체, DT, 또는 VT) 작은 집게를 사용 하 여 쌍 안 범위에서 모든 다른 뇌 부분을 제거 하 여 두 반구의 해당 하는 경우, 경우 필요한, 작은 위입니다. 절연된 외피가 15 mL 튜브에서 4 ° C에서 5 mL HBSS 버퍼에 저장 합니다.
    3. 1000 x g와 4 ° C에서 5 분에 대 한 격리 된 뇌 자료 원심
    4. 5 mL와 외피가 씻고 차가운 HBSS 아래로 pipetting으로 그들을 1 mL 피 펫 팁 균질 하 고. 필요한 경우, 피 펫 팁의 끝을 잘라.
    5. 1000 x g와 4 ° C에서 5 분을 위한 무 균된 샘플을 원심 HBSS는 제거 합니다.
    6. 3 mL 트립 신을 추가 하 고 37 ° c.에 5 분에 대 한 샘플을 품 어
    7. 샘플을 1 mL FCS, 5 mL CCM, 그리고 DNase 1의 30 µ L을 추가 하 고 신중 하 게 여기저기 pipetting으로 5 mL 유리 피 펫과 샘플을 균질.
    8. 1000 x g와 4 ° C에서 5 분에 대 한 격리 된 세포를 원심 상쾌한 삭제 5 mL CCM, 추가 하 고 샘플을 다시 균질.
    9. 샘플의 약 수를 희석 하 고 Neubauer 계산 챔버와 그것을 계산. 4.5 태아 당 106 세포 x의 평균 금액으로 예상 된다. 격리 된 Cpc의 재배 단계 2.1.10 진행. 칩, 3 단계 진행 즉시.
    10. 재배, 플레이트 폴 리-L-ornithine (0.1 mg/mL)와 laminin (1 mg/mL) 코팅에 Cpc 밀도 2.5 × 10와 8 x 104 사이5 셀/cm2 CCM 매체에 요리 하 고 37 ° C, 5% CO2, 그리고 100% 상대 습도에서 그들을 품 어.
    11. 이후는 Cpc (약 4 일 후) 세포 배양에서 신경 세포로 분화를 시작, 하루에서 시험관에 0 (0 일)로 절 개 날짜를 고려 하십시오. 경작의 더 긴 기간에 대 한 매체의 절반을 신선한 CCM 매체와 4 매일 변경 합니다.
    12. 1-5 µ M 적용 SGC0946 또는 EPZ5676 0 (세포 격리 후 4-5 h)에서 DMSO에 녹이 고 두 번째 매일 새로 고칩니다. DMSO를 사용 하 여 제어 치료로. 필요한 경우 표준 immunoblot 방법을 통해 억제제 치료의 효율성을 테스트 합니다.
  2. 절연 및 CGNPs의 선택적 재배
    1. 가 위를 사용 하 여 잘린 여 P5-7 동물을 안락사. 두 피 피부를 제거 하 고 두개골을 열고 뇌 작은 위와 집게를 사용 하 여 제거. 소 뇌를 분리 하 고 차가운 HBSS/포도 당에 그것을 전송. 모든 meninges과 혈관을 제거 하 고 가득 찬 HBSS/포도 당 15 mL 튜브에는 cerebella를 전송.
    2. 세 번 10 mL와 함께 cerebella를 씻어 얼음 HBSS/포도 당 (4 ° C에서 5 분 동안 650 x g에서 원심 분리 하 여 그들을 수집) 1 mL 피 펫으로 부드럽게 위아래로 pipetting으로 연속적으로 cerebella를 균질 하 고 (최대 2-3 시간) 0.5-1 m m3 파편.
    3. HBSS/포도 당에서 0.025 %trypsin 5 mL을 추가 및 CGM의 5 mL을 추가 하 여 15 분 중지 소화에 대 한 37 ° C 물 욕조에 일정 한 감동에서 조직을 품 어와 4 ° c.에서 5 분 동안 650 x g에서 원심 분리 하 여 조직 수집
    4. 제거는 상쾌한 고 1 ml CGM 1 mL 피펫으로 팁 조직 triturate 새로운 15 mL 튜브에 그것을 전송.
      참고: 공기 방울을 피하기 위해 중요 하다.
      1. 5 mL CGM을 추가 하 고 조직의 잔재를 해결 하기 위해 얼음에 2 분을 위한 혼합물을 품 어. 새로운 15 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 합니다. 잔여 조직에 2 mL CGM을 추가 하 고 분쇄 절차를 반복 합니다.
    5. (조직 잔해, 총에서 약 10 mL) 없이 supernatants 수영장 그리고 소 뇌 세포 수집 하 4 ° C에서 5 분 동안 650 x g에서 원심. 10 mL CGM에에서 펠 릿을 resuspend.
    6. 때문에 이다 폴 리-D-리 신 CGNPs 보다 빠르고 강한 준수, 100 µ g/mL 폴 리-D-리 코팅된 6-잘-접시에 셀 접시 (잘 당 최대 4 mL) 및 제거는 이다 37 ° C에서 20 분 동안 품 어.
    7. 접시를 동요 하 고는 상쾌한을 수집 합니다. 다음 15 mL 튜브에서 4 ° C에서 5 분 동안 650 x g에서 원심. 10 mL CGM에에서 펠 릿을 resuspend 하 고 챔버 세 Neubauer 셀 셀.
      참고: CGNPs는 작은, 라운드, 그리고 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 군데 후광을 표시.
    8. 경우 필요한, 씨앗 37 ° C에서 셀 미리 CGM 폴 리 L ornithine 코팅 접시 (6-잘 당 3 x 106 셀)에 예 열 하 고 37 ° C, 5% CO2 와 100% 상대 습도에서 그들을 품 어.
      참고: 시드 수행 되지 않습니다, 단계 3.1에 계속.
      1. 후 6-12 h, CGM 쉿 하 매체를 교환 합니다. 격리 된 CGNPs 6 h 치료 (또는 변경할 때 CGM 쉿) DOT1L 억제제와 DMSO 격리 후 제어 하 고 두 번째 매일 (2.1.12 비교) 갱신. 필요한 경우 표준 immunoblot 방법을 통해 억제제 치료의 효율성을 테스트 합니다. 칩, 단계 3.3 진행.
        참고: 접시에 (그리고 그 FBS) CGM을 떠나 소 뇌과 립 상 신경 (CGNs)에 CGNPs의 차별화에 발생 합니다.

3. 셀과 Chromatin의 전단의 고정

참고: 셀 교양 하지 경우 3.1 및 3.2 단계를 수행, 만약 그들이 3.3 단계로 진행 합니다.

  1. 1000 x g에서 4 분 동안 원심 분리 하 여 세포를 수집 하 고 1.3 mL PBS를 추가. 1.5 mL 튜브에 샘플을 전송. 4 분 4 ° c.에 1000 x g에서 원심 분리기 1.3 mL PBS로 두 번 샘플을 씻으십시오.
  2. 중요 한 단계: 추가 350 µ L 1% 샘플에는 PFA 및 22 ° c.에 5 분 동안 품 어 반응을 중지, 18.4 µ L 글리신, 고 1 mL PBS를 추가 합니다. 1000 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 샘플을 원심
    1. 얼음 처럼 차가운 PBS로 두 번 샘플을 씻으십시오. 1000 x g 5 분 및 4 ° c.에 대 한 원심 분리에 의해 고정된 세포 수집 이제 얼음 샘플을 유지.
      참고: 고정 시간 최적의 결과 얻으려면 정확 하 게 5 분 이어야 합니다. 다른 핸드폰 번호 적응 시간이 필요할 수 있습니다.
  3. 중요 한 단계: CGNPs 교양 (또는 Cpc), 추가 1 mL를 1 %PFA 셀 문화 판 우물에 직접. 22 ° C에서 5 분 외피 후 글리신 및 PBS의 적절 한 금액을 추가 하 고 셀 셀 스 크레이 퍼와 수확.
    1. 1.5 mL 튜브에 세포를 전송 하 고 1000 x g와 4 ° C에서 5 분에 대 한 샘플을 원심 얼음 처럼 차가운 PBS로 두 번 샘플을 씻으십시오. 고정된 셀 5 minat 1000 x g 4 ° c.에 대 한 원심 분리에 의해 수집 이제 얼음 샘플을 유지.
  4. 중요 한 단계: 세포의 용 해 버퍼 (+ protease 억제제)의 700 µ L을 추가 하 고 4 ° c.에서 15 분에 대 한 샘플을 품 어 소용돌이 샘플 5 분 마다 최대 전력에서 sonicator (30 s 펄스, 30 s 일시 중지)에 3 x 10 분 lysed 세포의 염색 질 전단.
    1. 볼륨 튜브 당 350 µ L를 초과 하지 않는 확인 하십시오. 소용돌이 샘플 10 분 마다 확인 단계 대조 현미경으로 나머지 핵에 대 한 lysate.
      참고: 그것은 나중에 분석을 위한 최적의 전단 결과 ( 그림 1B와비교)을 얻는 것이 중요입니다. 다른 방법을 사용 하 여 기울이기는 chromatin, 경우 염색 질 조각을 200-500 bp 사이 크기의 전단 최적화.
  5. 작은 셀 나머지 10 분, 13000 x g, 4 ° c.에 대 한 5.2 preclearing 단계는 상쾌한을 사용 합니다. 필요한 경우 나중에 사용,-20 ° C에서 샘플을 동결.

4입니다. 구슬 및 Preclearing의 준비

  1. 씻고 45 µ L 단백질 A 자석 구슬/칩 20 µ L 자석 구슬/샘플 1 mL 얼음 처럼 차가운 PBS 0.02% 포함으로 트윈 세 번 자기 스탠드를 사용 하 여. 그런 다음 구슬에 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL를 추가 합니다.
  2. 1 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS와 45 µ L 구슬/칩, 항 체/칩 (H3K79me2 또는 토끼 IgG)의 3 µ g을 추가 합니다. 구슬에 항 체를 바인딩할 회전에 4 ° C에서 2 시간에 대 한 샘플을 품 어. 항 체에 따라 ~ 3 µ g 항 체/칩을 사용 합니다.
  3. 1 mL 얼음 처럼 차가운 PBS 0.02% 포함 된 항 체 바인딩 구슬 세 번 씻어 트윈. 씻어 항 체-결합-구슬에 얼음 처럼 차가운 PBS의 적절 한 비드 볼륨 (볼륨 사용 자석 구슬의 시작)를 추가 합니다.
  4. (총 볼륨 1,320 µ L) preclearing에 대 한 샘플을 희석 버퍼의 600 µ L 및 세척된 자석 구슬의 20 µ L을 추가 하 고는 회전에 4 ° C에서 2 시간에 대 한 품 어. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 구슬을 제거 합니다. -20 ° c.에서 그들을 멈추게 하 고 입력된 샘플으로 lysates의 5% (33 µ L)

5. 염색 질 Immunoprecipitation

  1. 2 개의 튜브 (약 643.5 µ L) precleared 추출 나눌, 희석 버퍼와 항 체 바인딩 구슬 (45 µ L/샘플; 동일한 볼륨 추가 H3K79me2 또는 토끼 IgG)입니다. 회전자에 하룻밤 4 ° C에서 샘플을 품 어.
  2. 회전자에 4 ° C에서 얼음 처럼 차가운 칩 버퍼 1, 칩 버퍼 2, 및 칩 버퍼 3 10 분 동안 구슬을 씻어. 이후, 테 버퍼는 회전에 4 ° C에서 5 분 동안 세 번 씻어.
  3. 실 온에서 통에 1400 rpm에서 1 h에 대 한 차입 버퍼와 구슬 elute
  4. 입력 샘플 10 µ g RNase 칩 샘플 당 (1 mg/mL) 및 5 µ g을 추가 하 고 37 ° C (1400 rpm)에서 30 분에 대 한 샘플을 품 어.
  5. 추가 100 µ 가수분해 K g (20 µ g / µ L) 당 칩 샘플 및 입력 당 50 µ g 및 1400 rpm에서 65 ° C에서 밤새 품 어.

6입니다. 칩 샘플의 정화

  1. 칩과 DNA 정화 입력된 샘플 정화 ( 재료의 표참조) 키트 설명서에 따라. 정화 열을 사용 하 여 5 개 이상의 µ g의 DNA의 예상 되는 경우. 샘플 키트에 제공 된 DNA 차입 버퍼의 2 x 15 µ L와 함께 elute
  2. 머릿속 fluorophore는 fluorospectrometer를 사용 하 여 (를 사용 하 여 1 µ L) 샘플의 정량화를 수행 ( 재료의 표참조).

7입니다. 정량 통해 칩 샘플의 분석

  1. 뇌관 디자인을 위해, 정량 분석을 위한 통합 게놈 뷰어 (IGV) 브라우저34에서 관심의 게놈 시퀀스를 검색 합니다. H3K79me2 거기 위치할 것 이므로, 유전자의 transcriptional 시작 사이트 (TSS) 뇌관 디자인. 컨트롤, 고려 비 코딩 게놈 지역 또는 지역 상류 약 10 Kb TSS 또는 transcriptional 끝의 하류 10 Kb (TES) 사이트.
    1. Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 70 및 200 bp 및 최적의 온도 사이 제품 크기를 60 ° c.의 사전 설정을 사용 하 여 뇌관을 생성 시험 목적을 위해 뇌관을 사용 하 여 게놈 지역 Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, 및 Npm1 표 1에 나열 된에 대 한.
  2. 다음 정량 프로그램, 믹스 마스터, 58 ° C와 63 ° C, 사이 어 닐 링 온도 기울기와 새롭게 설계 된 뇌관을 테스트 하 고 최고의 제품 수량 및 품질을 어 닐 링 온도 선택 합니다.
    1. 예상된 제품 크기를 제어 DNA 젤 전기 이동 법을 적용 합니다. 정량 분석에 대 한 실시간 PCR 탐지 시스템 사용 ( 재료의 표참조).
    2. 10 µ L DNA 중 합 효소 마스터 믹스, 0.5 µ L 뇌관 앞으로 (10 µ M), 0.5 µ L 뇌관 역 (10 µ M), 4 µ L nuclease 무료 물, 그리고 5 µ L DNA를 사용 하 여 마스터 혼합 준비 (1 ng / µ L).
    3. 다음과 같이 2 단계 정량 프로그램을 사용 하 여: 95 ° C에서 5 분, 50 x (30 95 ° C, 30에서 s s 58 ° C-63 ° C에서), 및 4 ° c.에 끊임없이 변성 그라데이션
  3. 게놈, 전단, 순화 된 DNA 샘플 (2 ng / µ L, 1 ng / µ L, 0.5 ng / µ L, 0.25 ng / µ L, 및 0.125 ng / µ L)의 희석 시리즈 만들고 정량 Pcr를 사용 하 여 효율 테스트에 대 한 5 µ L을 사용 합니다. 표준 곡선의 기울기를 확인 하 고 다음 공식에 의해 뇌관 효율을 계산:
    효율 (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. 프라이 머를 사용 하 여 105%는 이상적인 경우에, 또는에서 90% 사이 효율성으로 115%와 85% 사이 효율성으로 적어도.
  4. 칩 및 입력된 샘플 분석, 0.1-1 적용 칩 DNA의 ng 혼합 각각 앞으로 및 역방향 뇌관, nuclease 무료 물, 그리고 DNA 중 합 효소 마스터 각 정량 반응에 대 한 20 µ L의 최종 볼륨에 혼합.
  5. 칩 및 입력된 샘플의 주기 (Ct) 임계값을 결정 하 고 농축 (% 입력) 다음 수식으로 계산 하는 입력의 Ct 값 샘플 Ct 를 정상화. IgG 배경 레벨을 컨트롤에서 가져온 사용 Ct 값입니다.
    % 입력 = 100-2^(norm. 입력된 − 규범. 칩)
    규범입니다. 입력 = C −t (입력) 로그2(희석 요인)
    규범입니다. 칩 = C −t (칩) 로그2(희석 요인)
    참고: 정상. = 정규화

8입니다. 시퀀싱을 통해 칩 샘플의 분석

  1. 시퀀싱 시설 칩 샘플 (입력 및 immunoprecipitated DNA 샘플)를 전송 합니다.
  2. 입력 DNA의 ng와 다음 세대에 대 한 인덱싱된 라이브러리로 immunoprecipitated DNA의 모든 다중화 시퀀싱에 적절 한 라이브러리 준비 키트 ( 재료의 표참조) 및 변환 2 라이브러리 미리, 사용 준비는 플랫폼을 표시 ( 재료의 표참조).
  3. 중요 한 단계: 키트의 지침에 따라 수리 고 다 꼬리 DNA 파편 끝 (15 µ M의 작업 농도)와 시퀀싱 어댑터를 선. 시퀀싱 어댑터 및 PCR 뇌관 적절 한 oligos ( 재료의 표참조)를 사용 합니다. 이 양의 입력 DNA에 대 한 어댑터 출혈 DNA 파편을 풍부 하 게 6-9 PCR 주기를 사용 합니다.
    참고: 일반적으로, 그것 아니다 어댑터 출혈 DNA의 크기 선택을 수행 하는 데 필요한. 그것은, 가능한 적은 PCR 주기를 사용 하 여 PCR 중복에 많은 PCR 확대 주기 결과 높은 GC 바이어스 이후 최고의.
  4. 마지막 도서관 확인에 대 한 적절 한 장치에 크기 분포를 시각화 하는 분석에 대 한 총 반응의 0.5 µ L 걸릴 ( 재료의 표참조). 정량화, 머릿속 염료는 fluorospectrometer 또는 다른 방법 ( 재료의 표참조)와 함께 사용 합니다.
  5. H3K79me2 더 큰 게놈 영역에 걸쳐 광범위 하 게는, 히스톤 수정 될 것으로 보인다 이후 순서는 샘플 쌍 간 읽기 길이의 50 bp와 75 미 오 읽기의 시퀀싱 깊이.
  6. 갤럭시/유 니 프라이부르크 서버 (galaxy.uni-freiburg.de)와 칩 seq 데이터를 분석 합니다.
  7. 취득된 ChIPseq FastQC와 함께 품질 관리를 수행 하 고, 적절 한 경우 Bowtie2 버전 2.2.035 또는 트리밍 없이 직접적으로 그들을 지도. 참고로 게놈 어셈블리 사용 mm9 또는 최신 버전 mm10; 그리고 참조 주석 합 FTP로 79 출시.
  8. 선택 사항: 제거 피크 호출 하기 전에 중복 피 카 MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard)를 사용 하 여 읽기.
  9. H3K79me2에 대 한 '광범위 한' 옵션을 사용 하 여 MACS2 버전 2.1.036 와 봉우리를 호출 합니다.
  10. 칩 및 입력된 샘플, 읽기의 읽기 수의 로그2 사이 로그2 비율을 얻기 위해 두 샘플의 BamCoverage 및 BamCompare를 사용 합니다.
  11. 모든 다른 깊이 있는 칩 seq 특정 분석, 적용 deepTools2 버전 2.3.5 또는 2.4.137, 즉 파일을 생성 범위 트랙 (칩, 칩의 입력을 비교에 대 한 bamCompare에 대 한 bamCoverage), 칩을 추정 하 성능 plotFingerprint을 사용 하 고 생성 하는 일반적인 개요 사용 computeMatrix, plotHeatmap. K-평균 computeMatrix 과정에서 클러스터링 클러스터 H3K79me2 배포에 따라 게놈 영역을 선택 합니다.
  12. H3K79me2의 E14.5 DT 시험 목적 NCBI에서 입금으로 칩 seq 데이터를 출판 사용 (승인 번호: SRP057733).

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결과

신경 조상 격리, 재배, H3K79me2 칩과 칩 분석 방법의 일반적인 계획: 그림 1 H3K79me2 칩 또는 소 뇌과 립 상 신경 창시자의 미 발달 두뇌 개발 하는 동안 다른 시간 지점에서 대뇌 피 질의 조상 세포의 출생 후 단계에서 수행 하는 순서도 보여 줍니다. 첫 번째 단계로 뇌 격리 하 고 telencephalon (E11.5 E14.5 사이) 또는 소 뇌 (P5-P7)을 검색할 수 있다. DT는 VT로 나누어는 telencephalon의 다른 지구를 분석 가능 이후에 조직 균질 것 이다 고 신경 창시자 차별. 지금, 그것은 뿌리 세포 문화 DOT1L 억제제와 그들을 치료 하입니다. 또 다른 가능성은 창시자를 직접 수정 하 여 칩 절차 그들의 대상이입니다. 칩,는 chromatin 200-500 bp의 조각으로 전단 고 H3K79me2에 대 한 자석 구슬 결합 항 체로 그 후 ...

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토론

히스톤 수정, 녹음 방송 요인, 히스톤 코드 독자, 작가, 또는 지우개의 게놈 인 검출 하기 chromatin immunoprecipitation를 수행 하기 위해 두 가지 주요 방법이 있다. 하나는 nuclease 소화, immunoprecipitation에 대 한 네이티브 chromatin를 사용 하 여 네이티브 칩 방법 이며 다른 PFA 고정, 전단 chromatin, 있는 nucleosomes와 다른 DNA 연결 단백질 covalently에 바인딩된 DNA를 사용 하 여 제시 방법 39. 네이티브 칩의 높은 항 체 탐지 레이트와 히스톤 메 틸 화는 염색 질부터 적용 해야 및 히스톤 methylations는 칩에 걸쳐 상대적으로 안정적인. 하지만 시작 물자의 다량이 필요 하 고, 그것에 적용 되지 않습니다 대뇌 나 소 뇌 개발 공부 마우스 두뇌 세포의 수는 일반적으로 제한. 우리는 항 체는 특별히 감소 H3K79me2 신호 칩 정량 분석 및 immunoblots (

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공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심 선언

감사의 글

우리 감사 Henriette Bertemes 실험실 내 CGN 재배 프로토콜을 설정 하는 데 도움. 이 방법은 종이 DFG 투자 CRC992 의료 Epigenetics tv 자금으로 지원 했다. 저자 인정 프라이부르크 갤럭시 팀의 지원: Pavankumar Videm, 비 Grüning와 교수 Rolf Backofen, 생물 정보학, Freiburg의 대학, 독일 공동 연구 센터 992 의료 Epigenetics (DFG 부여 SFB 992/1 2012)에 의해 투자 독일 연방 교육부의 교육 및 연구 (BMBF 그랜트 031 A538A 로얄 (드. NBI))입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Anti-GAPDHAbcamab8245Category: 항체
약어/코멘트: Immunoblot 희석 1:5000
Anti-H3Abcamab1791Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2DiagenodepAb-051-050Category: 항체
약어/코멘트: ChIP 항체
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050카테고리: 항체
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgGDiagenodeC15410206분류: 항체
약어/논평: ChIP Ctrl 항체
Anti-Tubulin alphaAbcamab108629분류: 항체
약어/논평: Immunoblot 희석 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml)Sigma-AldrichT1147Category: Cell culture
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B27 Supplement (50x)Life Technologies17504044카테고리: 세포 배양
약어/코멘트: CCM
BioanalyzerAgilent technologiesG2940CA분류: ChIP
약어/논평: 전단 염색질
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001분류: ChIP
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붕산 pH 8.4시그마 알드리치B6768분류: 세포 배양
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Connect RT PCR 검출 시스템Bio-Rad1855201분류: ChIP 분석
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DMEM-F12Life Technologies11320-033검출 시스템분류: 세포 배양
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Dynabeads Protein AInvitrogen10001DCategory: ChIP
Abbreviation/Comment: 자성 비드, ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: 세포 배양에서 DOT1L 억제 에
틸렌디아민 테트라아세트산SERVA39760.01카테고리: ChIP
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EDTA 소 태아 혈청 10% (v/v)Gibco10082147Category: Cell culture
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포도당Sigma-AldrichG5767Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: CGNP 분리
글루타티온(1.25 mg/ml)Sigma-AldrichG4251분류: 세포 배양
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글리신Carl Roth3187분류: ChIP
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GoTaq mastermixPromegaA6002Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: qPCR 행크용 DNA 중합효소 마스터 믹스
' s Balanced Salt SolutionLife Technologies14025-100카테고리: 세포 배양
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L-글루타민 (200 mM)라이프 테크놀로지25030081카테고리: 세포 배양
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리튬Sigma-AldrichL4408카테고리: ChIP
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NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for IlluminaNEBE7645SCategory: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Library preparation Kit
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNEBE7335Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library
Neurobasal mediumGibco21103049Category: Cell culture
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NP-40 AlternativeCalbiochem492016Category: ChIP
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파라포름알데히드Carl Roth335Category: ChIP
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페니실린 - 스트렙토 마이신 - 네오 마이신 1 % (v / v)생명 기술15640055 카테고리 : < / strong> 세포 배양
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인산염 완충 식염수Life Technologies10010023Category: Cell culture
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PicoGreen KitThermo FisherP11496카테고리: ChIP 분석
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Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407Category: Cell culture
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Poly-L-ornithine hydrobromideSigma AldrichP3655카테고리: 세포 배양
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칼Thermo FisherAM9640G분류: 세포 배양
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프로테아제 억제제Roche4693159001카테고리: ChIP
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단백질 분해 효소 KSigma-Aldrich3115879001분류: ChIP
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ChIP Qiagen MinEluteQiagen28004분류: ChIP
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RNAseSigma-AldrichR6513분류: ChIP
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SGC0946SelleckchemS7079카테고리 : < / strong> DOT1L 억제
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탄산 나트륨Carl Roth8551.1 카테고리 : < strong> ChIP
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나트륨Carl Roth9265카테고리 : < / strong> ChIP< br / > 약어 / 코멘트 : < / strong> NaCl, ChIP 버퍼
나트륨 deoxycholate시그마 - 알드리치30970카테고리 : < / strong> ChIP
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나트륨 dodecylsulfateCarl Roth183카테고리 : < / strong> ChIP
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소닉 고슴도치 (SHH)시그마 - 알드리치SRP6004< 강한> 카테고리 : < / strong> 세포 배양
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용 Superoxide dismutase (1mg / ml)시그마 알드리치S7571분류: 세포 배양
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Tris(hydroxymethyl)aminomethaneCarl Roth9090카테고리: ChIP
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Triton X-100Carl RothX100Category: ChIP
Abbreviation/Comment: ChIP 버퍼
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v)Sigma Aldrich59417CCategory: Cell culture
Abbreviation/Comment: CPC 격리
Tween20Carl Roth28320Category: ChIP
Abbreviation/Comment: 비드 준비용
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CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP 세포 배양 배지
의 분석을 위해 스 preparation 염화륨 중액 염화

참고문헌

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