소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes

두뇌에 고르기가 아닌 셀 참조, glial 세포 중앙 신경 시스템 (CNS)에 주요 셀 유형입니다. 이전, glial 세포는 시 냅 스 속성과 기저 신경 생존 유지에 수동 역할 주로 단순한 지원 세포로 간주 되었다. 그러나, glial 세포 신경 생물학, 뇌 항상성, 중재 시 냅 스 형성^1,2,3 , 시 냅 스를 유지 하는 등의 다양 한 측면에서 보다 적극적인 역할을 재생할 계시는 증거를 신흥 제거^4,5, 그리고 변조 시 냅 스가 소성^6,7. CNS에서 glial 세포는 이다, microglia, 및 oligodendrocytes 포함 됩니다. 이러한 세포, 이다와 microglia 보였다 시 냅 스^4,5, apoptotic 세포⁸, 신경 파편⁹, 그리고 병원 성 단백질, 녹말 체 beta 등을 덮어 여 phagocytic 역할을 플 라크^10,11. 개발 두뇌에서 이다 MERTK 및 MEGF10 종속 먹어서⁴등 측면 geniculate 핵 (dLGN)에서 시 냅 스를 제거합니다. 마찬가지로, microglia 또한 C1q 코팅 시 냅 스 클래식 보완 캐스케이드⁵발달 단계를 제거 합니다. 흥미롭게도, 그것은 결함 시 냅 스의 가지 치기에 여러 가지 신경 장애의 시작자 중 하나 될 수 있습니다 제안 되었습니다. 예를 들어 돌연변이 보완 구성 요소 4에서에서 (C4) microglia에 의해 보완-중재 시 냅 스의 가지 치기를 증가 인간¹²정신 분열 증의 보급에 강하게 연관 표시 되었습니다. 최근 종이 고아 한 보충 통로 hyperactivated 광고의 개시 단계에 하 고¹³이 질병에서 초기 냅 손실 유도도 표시 됩니다.

먹어서 microglia 중재와 비교, 덜 분명 하다 사이토 중재 먹어서 개시와 다양 한 신경 질환의 진행에 기여 하는 여부. 그러나, 최근 종이 이다 하 여 정상적인 시 냅 스 가지 치기의 속도 변경 하는 수 있습니다 두뇌 항상성 방해 요인과 광고 민감성과 병리학¹⁴을 나왔다. ApoE 이 성체, 광고 (ApoE2)에 대 한 보호 대립 유전자와 강하게 향상 속도 위험 대립 유전자 (ApoE4) 광고에 대 한 속도 크게 낮추는 이다에 의해 시 냅 스 가지 치기의 속도 강력 하 게 제어 됩니다. 또한, 유전자 변형 마우스 ApoE4 표현 제어 또는 ApoE2 마우스¹⁴보다 훨씬 더 많은 시 냅 스 C1q 축적. 이러한 데이터는 초기에 사이토 중재 먹어서 장애인 제안 광고 두뇌 활성화 보완-중재 microglial 먹어서, 시 냅 스 변성 운전 노화 C1q 코팅 시 냅 스/시 냅 스 파편의 축적을 유발 수 있습니다 . ApoE4 운반대에 이다의 장애인된 phagocytic 용량 또한 광고 영향을 두뇌에 베타 아 밀 로이드 플 라크의 통제 축적에 기여할 수 있습니다.

또한, 그것은 세 초파리 뇌에 glial 세포 드레이퍼, Megf10 이다 phagocytosing 시 냅 스를 사용 하는의 체의 감소 번역으로 인해 그들의 phagocytic 용량을 잃게 표시 되었습니다. 효율적으로 비슷한 정도 젊은 뇌를 노화 유도 나타내는 세 뇌에 손상된 axonal 파편 삭제 glial 세포의 phagocytic 용량 구조 드레이퍼 수준을 회복의 phagocytic 용량 변경 이다 두뇌 항상성¹⁵의 파괴에 기여할 수 있습니다.

이러한 새로운 발견을 바탕으로, 이다의 phagocytic 용량 변조 수 방지 하 고 다양 한 신경 질환을 치료 하는 매력적인 치료 전략. 이와 관련, 산 성 나노¹⁶ 리소좀의 산성화를 유발 및 녹음 방송 요인 EB (TFEB), 향상 시킬 수 있는 overexpressing 이다, 예를 들어의 phagocytic 능력을 향상 시키는 몇 가지 시도 되었습니다. 리소좀 속¹⁷. 이러한 시도도 불구 하 고 그것은 여전히 확실치있지 않습니다 어떻게 이다 및 microglial 셀 phagocytic 그들의 활동에 다 우리가 해야 증가 여부 등 다양 한 질병에 그들의 phagocytic 용량 감소.

이 논문에서는, 소설 체 외에서 분석 결과 실시간으로 이다의 phagocytic 용량을 탐지 하기 위한 선물이. 데이터 이다에 microglia engulfment과 저하의 다른 활동을 보여줍니다. 사이토 조절 매체 (ACM), 포함 이다에서 분 비 요인, 이다와 microglia의 효과적인 먹어서 필수적입니다. 또한, Megf10, 이다에 Ced-1 과 드레이퍼, 체 phagocytic 수용 체 중재 하는 사이토 먹어서^8,18에 중요 한 역할을 재생 합니다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 한국 고급 연구소의 과학 및 기술 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC), KA2016-08에 의해 승인 되었습니다.

1. synaptosome 정화

참고:이 절차는 이전에 게시 종이¹⁹ 순화 synaptosomes (그림 1)의 수확량을 개선 하기 위해 몇 가지 수정 적응.

1. 불연속 밀도 그라데이션 미디어를 준비 합니다.
   1. 얼음에 다음 장소: 그라데이션 버퍼에 3%, 10%, 그리고 23% 밀도 그라데이션 솔루션 (자당의 109.54 g, 트라이앵글, 606 mg와 0.2 M EDTA, pH 7.4의 5 mL 물 250 mL를가지고); 균질 화 버퍼 (추가 그라데이션 버퍼 x 4의 25 mL 및 물 74.5 mL로 50 m m DTT의 500 µ L); 균질 화기 박격포와 유 봉
      참고: 밀도 그라데이션 솔루션 및 준비 표 1에 선물 된다. 3%, 10%와 23% 밀도 그라데이션 솔루션을 준비 하려면 원시 밀도 그라데이션 솔루션을 사용 합니다.
   2. 3 성인 쥐 당 6 매우 명확한 원심 분리기 튜브를 준비 합니다.
   3. 1 mL 피 펫 각 원심 분리기 튜브의 하단에 23% 밀도 그라데이션 솔루션의 3 mL를 추가 합니다. 다음, 천천히 레이어 목장 피 펫 및 1 mL 피 펫은 23% 밀도 그라데이션 솔루션의 위에 10% 밀도 그라데이션 솔루션의 3 mL를 확인 합니다. 마지막으로, 위에 3% 밀도 그라데이션 솔루션의 3 mL를 추가 합니다. 이 단계에서 소개 하는 거품을 피하기 위해 주의 사용 합니다.
   4. 원심 분리기 튜브 플라스틱 포장으로 커버 하 고 얼음에 튜브를 유지.
2. 고속 원심 분리기 및 4 ° c.에 ultracentrifuge 쿨
3. 70% 에탄올 (가 위, Castroviejo 봄이 위, 그리고 곡선된 겸 자 운영) 외과 장비를 소독. 얼음에 균질 화 버퍼의 25 mL와 함께 작은 유리 비 커를 준비 하 고 비 커의 무게.
4. 3 성인 (약 12 주 오래 된) 남자 쥐에서 두뇌를 추출 합니다.
   1. 자 궁 경부 척추 탈 구 그리고가 위 운영으로 목. 머리와 운영가 위 및 곡선된 겸 자 사용 하 여 중간에 따라 두개골의 피부를 벗기십시오. Castroviejo 봄이 위 후 각 전구 및 소 뇌를 삭제할.
5. 곡선된 겸 자 비 커에 넣어 나머지 두뇌와 두뇌 무게. 두뇌의 표면에 혈액을 제거 하 차가운 균질 화 버퍼와 여러 번 머리를 헹 굴.
   참고: 이전에 뇌 조직의 1 g을 균질 화 버퍼의 9 mL 권장 했다.
6. 균질 버퍼 및 뇌 조직의 균질 화기 박격포 1 g의 4 개 mL를 추가 합니다. 두뇌 조직, 하는 동안 추가 8 mL 최대 버퍼 조직.
7. 2 개의 50 mL 고속 원심 분리기 관으로는 homogenate를 나눕니다. 신선한 균질 화 버퍼의 1 mL와 박격포를 세척 하 고 관에 그것을 추가.
   주의: 가능한 한 빨리 1.3-1.7 단계를 진행 합니다. 20 분 미만 것이 좋습니다.
8. 느린 브레이크와 4 ° C에서 10 분 1000 x g에서 고속 원심 분리기 튜브에 homogenates 원심.
   참고: 때 감속의 최대 속도가 9 2 또는 3에서 감속 속도 (브레이크)를 설정 합니다.
9. 신중 하 게 새로운 50 mL 튜브에는 상쾌한 추가 고 균질 화 버퍼의 최대 12 mL를 추가 합니다.
10. 신중 하 고 천천히 1 mL 피 펫을 3% 밀도 그라데이션 솔루션을 통해 희석된 상쾌한의 2 개 mL를 플라스틱 하 고 얼음에 튜브를 놓습니다.
11. 4 ° C에서 5 분 동안 아무 브레이크와 함께 31000 x g에서 원심.
    참고: 하나 (0)에서 감속 속도 설정 또는 해안.
12. 얼음에 튜브를 놓고 50 mL 튜브에 23% 밀도 그라데이션 솔루션 10% 밀도 그라데이션 솔루션 2 mL 피 펫 사이 synaptosome 분수를 수집 합니다. 얼음 처럼 차가운 자당/EDTA를 추가 최대 80 mL를 버퍼링 하 고 4 50 mL 고속 원심 분리기 튜브로 나눕니다.
    주: 레이블이 지정 된 그라디언트 분류 한 synaptosomes에 대 한 그림 3 을 참조 하십시오.
13. 적은 휴식 4 ˚C에서 30 분 동안 20000 x g에서 원심.
    참고: 때 감속의 최대 속도가 9 2 또는 3에서 감속 속도 설정 합니다.
14. 조심 스럽게 제거 1 mL 피 펫과 상쾌한, isotonic 생리 버퍼 (140 mM NaCl, KCl 3mm, 1.2 m m MgCl₂, 1.2 m m NaH₂포₄, 10 mM HEPES, 그리고 10 mM 포도 당, pH 7.4)²⁰의 1 mL와 함께 synaptosome 펠 릿 resuspend. Isotonic 생리 버퍼에 10 %DMSO 1 mL을 추가 (DMSO의 최종 농도: 5%)는 synaptosomes 한 50 mL 고속 원심 분리기 튜브에 수집.
15. 1.5 mL 튜브에 aliquot 1 mL입니다. Bradford 분석 실험을 사용 하 여 synaptosomes의 단백질 농도 측정 합니다.
16. 신속 하 게 튜브를 고정 하 고 pH 지시자 활용까지-80 ° C 냉동에 튜브를 저장 합니다.

2입니다. pH 지표 활용

1. 1.5 mL 튜브 4 ° c.에 3-4 분 21,092 x g에서 synaptosomes 원심
2. 제거는 상쾌한, 잘 pipetting으로 0.1 m M 나₂CO₃ 및 혼합의 200 µ L를 추가 합니다.
   참고: 없음₂CO₃ 알칼리 pH에서 1 차 아민과 반응 하는 succinimidyl 에스테 르로 pH를 가장 효율적으로 마련 하기 위해 추가 되었습니다.
3. 튜브와 부드럽게 소용돌이를 pH 지시자의 2 µ L를 추가 합니다.
   주의: 1 µ L 당 0.3 m g synaptosome 솔루션의 pH 지시자의 사용.
4. 알루미늄 호 일 튜브를 취재 하 여 가벼운 노출을 최소화 하 고 실내 온도 (RT)에 1-2 시간 30 ~ 40 rpm에서 부드러운 동요와 트위스트 통에 그들을 품 어.
5. 동요를 중지 하 고 DPBS의 1 mL를 추가 합니다.
6. 1-2 분 21,092 x g에서 튜브 원심
7. 제거는 상쾌한 고 부드러운 pipetting으로 펠 릿을 resuspend 하는 DPBS의 1 mL를 추가 합니다.
8. 바인딩되지 않은 산도 표시기를 제거 하려면 단계 2.6-2.7 적어도 7 번을 반복 합니다.
9. 상쾌한을 제거 하 고 5 %DMSO DPBS의 200 µ L와 펠 릿을 resuspend.
   참고:이 시점에서, 모든 synaptosomes는 작동 하지 않습니다. 우리 그 phosphatidylserine (PS)으로 synaptosomes의 외부 막에 노출 되었습니다 확인 한 "먹고-나" 신호 (그림 4).

3. 이다 및 Microglia 정화

참고: 사이토 정화에 대 한이 프로토콜은 이전에 게시 종이²¹에서 적응. 이 프로토콜에서 쥐 이다 microglia의 정화를 설명 합니다. 마우스 이다 고 microglia 정화에 대 한 구체적인 절차는 또한 노트에 설명 됩니다.

1. 하루 전에 정화
   1. 미리 코팅된 셀 문화 요리와 솔루션을 준비 합니다.
   2. 50 mm Tris HCl (pH 9.5) 25 mL와 5 145 m m x 20 m m 접시를 준비 합니다. 페 트리 접시에 주 또는 보조 항 체 치료를 별도로 아래와 같이 배치 합니다. 밤새 냉동 실에 요리를 품 어.
      BSL-1 접시: 20 µ L 5 mg/ml BSL-1 (Griffonia simplicifolia lectin)
      2 차 전용 접시: 2.4 mg/mL 염소 반대로 마우스 IgG + IgM (H + L)의 60 µ L
      CD45 요리: 2.4 mg/mL 염소 반대로 마우스 IgG + IgM (H + L)의 60 µ L
      O4 요리: 2.4 mg/mL 염소 반대로 마우스 IgM (µ-체인 관련)의 60 µ L
      쥐 이다에 대 한 Itgb5 (β5 Integrin) 요리: 2.4 mg/mL 염소 반대로 마우스 IgG + IgM (H + L)의 60 µ L
      참고: 페 트리 접시의 소수 성 표면에 이차 항 체에 연결, 낮은 온도에서 천천히 첨부 것이 좋습니다. 그러나, 그것은 코트 2 h 37 ° c.에 대 한 2 차 항 체로 페 트리 요리 가능 사이토 팬에 대 한 항 체는 동물 종;에 따라 다르게 사용 되 고 마우스 이다에 대 한 예를 들어 HepaCAM 요리: 2.4 mg/mL 염소 반대로 마우스 IgG + IgM (H + L)의 60 µ L
2. 정화의 날
   1. Immunopanning에 대 한 준비.
   2. 50 mL 튜브를 준비 하 고 관에 주식을 추가 합니다. 자세한 재고 솔루션 준비는 표 1에 표시 됩니다.
      1. 준비 관 1 (효소): 효소 주식 22 mL (효소 주식: 얼의 균형 소금 솔루션 x 1 (EBSS)+0.46% D (+)-포도 당 + 26 m m NaHCO₃ 및_{0.5 mM EDTA).}
      2. 억제제 주식의 42 mL 튜브 2 (낮은 비켜) 준비: (억제제 주식: EBSS+0.46% D (+) x 1-포도 당 + 26 m m NaHCO₃).
      3. 튜브 3 (높은 비켜) 준비: 억제제 주식의 10 mL.
   3. CO₂ (95% O₂ 와 5% CO₂) 탱크에 연결 된 2 mL 펫의 팁 0.22 μ m 주사기 필터를 연결 합니다. 거품 CO₂ 튜브 1-3. 솔루션 설정 오렌지 버블링 중지 합니다.
   4. 솔루션을 완료 합니다.
      주의: 고 효소 활성화에 대 한 사용 하기 전에 15 분 동안 34 ° C에서 튜브 1에서 솔루션을 품 어.
      1. 준비 관 1 (효소): 효소 주식 + 180 U papain + 0.004 g L-시스테인의 22 mL.
      2. 튜브 2 (낮은 비켜) 준비: 42 mL 억제제 재고 + 낮은 비켜의 3 mL + DNase의 200 µ L.
      3. 튜브 3 (높은 비켜) 준비: 10 mL 억제제 재고 + 높은 비켜의 2 mL + DNase의 20 µ L.
      4. 튜브 4 (0.2 %BSA) 준비: 19 mL 1 X DPBS의 + 4 %BSA 1 mL + DNase의 8 µ L.
      5. 튜브 5 (0.02 %BSA) 준비: 1 X DPBS의 45 mL +의 5 mL 튜브 4 + 50 µ L DNase의.
   5. 34 ° c.에 물 목욕과 열 블록 예 열
3. 쥐 피를 추출 합니다.
   1. 70% 에탄올과 수술 장비를 소독 하 고 DPBS 100 mm 페 트리 요리를 준비.
   2. 아크릴 상자를 준비 합니다. 상자 아래에 직물의 2 ~ 3 층을 넣어 하 고 상자에 isoflurane의 1 mL를 추가 합니다.
   3. 강아지에 대 한 20-40 상자에서 anesthetize 고 anesthetization 발 핀치 집게와 함께 합니다. 심장²² 고 새끼 DPBS 10 mL 주사기를 사용 하 여 perfuse.
      참고: 관류 microglia 패닝 단계 혈액 세포 오염을 방지 하는 데 사용 됩니다.
   4. 강아지의 목의 위 자 궁 경부 라인 운영가 위로 잘라 고 중간 선 따라 머리 피부를 incise. 중간 선 따라 두개골에 절 개를 만들고 곡선된 겸 자와 두개골을 열고.
   5. Castroviejo 봄이 위 소 뇌를 삭제할. 나머지 뇌를 꺼내와 DPBS 가득 100 mm 페 트리 접시에 놓습니다.
   6. Castroviejo 봄이 위 현미경 midbrain 해 마 등 다른 지역 피 질에서 제거 합니다. Meninges 미세 집게로 제거 합니다.
   7. 새로운 60 mm 접시에는 피를 전송 하 고 접시에 나머지 DPBS를 제거 합니다. 10 번 블레이드와 함께 조직을 잘라.
4. 단일 셀 서 스 펜 션으로 피 질 해리
   1. 60 mm 접시에 필터링 된 튜브 1 솔루션을 부 어 고 DNase1의 50 µ L를 추가 합니다. 접시에 솔루션을 소용돌이 친다.
      참고: DNase 파열된 세포에서 DNA의 집계를 억제 하기 위해 사용 됩니다.
   2. 34 ° C 열 블록으로 접시를 놓고 중간에 구멍이 있는 뚜껑으로 커버 합니다. 60 mm 페 트리 접시의 뚜껑에 구멍을 납땜을 사용 합니다.
   3. 22-µ m 주사기 필터 CO₂ 탱크 튜브를 연결 하 고 필터 팁을 구멍에 넣습니다.
   4. 접시 마다 10 ~ 15 분에에서 솔루션 45 분 소용돌이에 34 ° C에서 접시를 품 어.
5. 패닝 요리 준비 완료.
   1. 패닝 요리 하루 미리 냉동 실에서 2 차 항 체로 코팅을 제거 합니다. BSL-1 접시와 실시간에 2 차 항 체 전용 접시
   2. 다른 요리 DPBS의 20 mL를 세 번 씻는 다.
   3. 요리에 0.02 %BSA 적절 한 금액을 붓는 다. 해당 요리에 기본 특정 항 체를 장소:
      CD45 요리: 0.02 %BSA + 0.5 mg/ml 쥐 반대로 마우스 CD45 20 µ L의 12 mL
      Itgb5 요리: 0.02 %BSA + 0.5 mg/mL Itgb5의 20 µ L의 12 mL
      O4 요리: 0.02 %BSA O4 항 체의 4 mL 8 mL
      참고: 마우스 immunopanning, 사용 마우스 반대로 쥐 CD45 (0.5 mg/mL) microglia 및 HepaCAM (0.5 mg/mL) 이다.
   4. 30%의 30 mL 준비 FBS neurobasal 미디어와 1 X EBSS의 10 mL. 34 ° C 물 욕조에 두 솔루션을 따뜻한.
6. Papain 반응 억제.
   1. 새로운 50 mL 튜브 papain 처리 조직 전송. 정착을 조직에 대 한 기다립니다. 흡입에 의해 액체를 발음.
   2. 튜브에 낮은 비켜 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 셀을 씻어 솔루션 소용돌이.
   3. 효소 반응을 중지 하 단계 3.6.1-3.6.2 세 번을 반복 합니다.
7. 피 질 조직 triturate
   1. 욕조의 낮은 비켜 6 mL를 추가 합니다. 발음을 5 mL 피 펫으로 신속 하 게 조직 합니다.
      주의: 거품을 소개 하지 않습니다.
   2. 새로운 50 mL 튜브를 준비 하 고 낮은 비켜의 5 mL을 추가. 새로운 관에 있는 단일 셀을 수집 합니다.
   3. 반복 단계 3.6.1-3.6.2 두 번 하 고 1 mL 피 펫을 5 mL 피 펫을 변경.
   4. 분쇄를 반복 하 여 직물의 95% 이상 표시 되지 않습니다.
   5. 해리 10 mL 피 펫 아래 낮은 비켜-포함 된 튜브 3 셀에서 높은 비켜 솔루션의 레이어를 확인 합니다.
   6. 몇 가지 브레이크와 함께 6 분 190 x g에서 원심.
      참고: 때 감속의 최대 속도가 9에서 하나 또는 두 개의 감속 속도 설정 합니다.
8. 여과 액 단일 셀입니다.
   1. 신중 하 게 흡입, 여는 상쾌한 발음 다음 0.02 %BSA 솔루션 1 mL 피 펫의 3 mL와 펠 릿을 resuspend.
   2. 0.02 %BSA 솔루션 추가 최대 9 mL.
   3. 새로운 50 mL 튜브와 튜브 위에 20 µ m 셀 스 트레이너를 준비 합니다. 젖은 0.02 %BSA 솔루션의 1 mL와 함께 셀 스 트레이너.
   4. 셀 스 트레이너로 단일 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 한 번에 1 mL를 필터링 합니다.
   5. 0.02 %BSA 솔루션의 3 mL와 함께 셀 여과기를 세척. 필터링 된 단일 셀 서 스 펜 션의 15 mL 이상 만들지 마십시오.
   6. 34 ° C 물 목욕 셀 복구를 위한 45-60 분에 튜브를 품 어. 셀 복구 단계 막에 세포 표면 단백질의 relocalization 수 있습니다.
9. 셀의 회전을 수행 합니다.
   1. CD45 패닝 접시 DPBS의 20 mL로 세 번 세척. 세 번 사용 직전 DPBS의 20 mL와 함께 모든 접시를 씻어.
   2. 단일 셀 현 탁 액은 CD45에 접시를 팬에 부 어. 28 분 동안 접시를 두고 14 분 접시를 흔들어. 하단에서 바인딩되지 않은 셀을 제거 하려면 신중 하 게 접시를 흔들.
   3. 2 차 전용 접시에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 20 분 동안 기다려야 하 고 신중 하 게 10 분 동안 요리를 흔들. CD45 접시에서 microglia를 얻으려면 3.9.2 단계로 이동 합니다.
   4. BSL-1 접시에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 10 ~ 12 분 동안 접시를 남겨 주세요.
   5. O4 접시에 전송 합니다. 20 분 동안 기다려와 10 분 동안 흔들어.
   6. Itgb5 요리에 전송 합니다. 40 분 동안 접시를 두고 부드럽게 흔들어 마다 10 분.
      참고: 마우스 이동에 대 한 HepaCAM 접시에 세포 현 탁 액을 전송.
10. 접시에서 세포를 분리 합니다.
    1. 믹스 400 µ L의 트립 신 (EBSS에서 30000 U/mL) 1 X EBSS의 preincubated 8 mL와 함께.
    2. 폐기물 통에 접시에서 분리 된 세포 현 탁 액을 부 어.
    3. 8 번 DPBS와 접시 세척.
    4. 접시에 트립 신으로 EBSS의 8 mL를 붓으십시오.
    5. 37 ° C 배양 기에서 5 ~ 10 분 요리를 품 어. CD45 요리 및 Itgb5 및 HepaCAM 요리에 대 일 분 10 분 동안 품 어.
    6. 접시를 누르고 접시 현미경으로 관찰 합니다.
       참고: 경우에 이다의 대부분을 분리 하지 했으면 넣고 접시 다시 다른 5 분 동안 인큐베이터.
    7. 30%의 10 mL를 붓고 trypsin 중화 요리에 FBS.
    8. 위쪽 및 아래쪽 이다 microglia를 분리 하려면 전체 접시에 플라스틱.
    9. 솔루션 50 mL 튜브로 전송 합니다.
    10. 30%의 10 mL을 추가 FBS 및 200 µ L DNase의 접시에. 셀을 다시 분리 합니다. DNase 파열된 세포에서 DNA의 집계 하는 데 사용 됩니다.
    11. 튜브에 솔루션을 전송 합니다. 세포는 접시에 남아 있으면 추가 30%의 또 다른 10 mL FBS 및 셀을 다시 분리.
11. 셀 접시
    1. 10 분 213 x g에서 튜브 원심
    2. 상쾌한 발음 하 고 미디어와 셀 펠 릿 resuspend.
       참고: microglia에 대 한 immunopanned 사이토 조절 미디어 (IP-ACM) 이다 및 망막 microglia 기본 미디어 (MBM) immunopanned 사이토 기본 미디어 (IP-ABM)를 사용 합니다. IP ABM 및 MBM 구성 재료의 테이블에에서 표시 됩니다.
    3. hemocytometer 셀을 계산 합니다.
    4. 이다와 PDL 코팅 판에 별도로 microglia 접시.
       참고: 사용 하기 전에 PDL 코팅 접시를 준비 합니다. PDL 코팅 접시를 준비 하려면 증류수 5 mL로 신의 1 mg/mL 폴 리-D-50 µ L을 추가 하 고 잘 플레이트/접시에 솔루션의 적절 한 금액을 부 어 30 분 세척 접시/접시 세 번 증류수와 함께 기다립니다.
    5. 접시를 품 어. 모든 이다 7 일 및 3 일 microglia 미디어의 절반을 변경 합니다.

4. IP ACM 수집

1. 때 이다 지나치게 confluent 100 mm 접시를 준비 합니다.
2. 미디어를 삭제 하 고 세 번 DPBS의 10 mL와 함께 접시를 씻어.
3. 접시에 낮은 단백질 미디어의 15 mL를 붓으십시오.
   참고: 낮은 단백질 미디어 구성 재료의 테이블에에서 표시 됩니다.
4. 37 ° C 배양 기에서 7 ~ 10 일 동안 접시를 품 어.
5. 수집 하 고 10 k 미디어 집중 (30 k) 원심 필터 튜브.
6. 4 ° c.에 851 x g에서 튜브 원심
   참고: 나머지 매체 1 mL 미만 때까지 튜브 원심.
7. 수집 집중된 미디어 (IP-ACM) 새로운 1.5 mL 튜브에.
8. 양적 분석을 사용 하 여 IP ACM의 농도 측정

5. 먹어서 라이브 이미징 분석 결과 (그림 2)

1. 이다 confluent에 24-잘 접시 (접시/접시는 라이브 영상에 대 한 준비)를 준비 (일반적으로, 부 화 후 정화는 세포를 안정화의 7 ~ 10 일).
2. 각 우물에서 미디어를 제거 하 고 세척 DPBS의 1 mL와 함께 우물 세 번. 공기 노출을 최소화 하기 위해 우물을 신속 하 게 세척.
3. PH 지시자 활용 된 synaptosomes 및 IP-ACM glial 세포 식 균 작용을 조절할 수 있는 등 추가적인 요인의 5 µ L로 IP-ABM의 300 µ L를 추가 합니다.
4. 40 분 CO₂ 인큐베이터에 접시를 품 어. 이 단계는 pH 표시기 활용 된 synaptosomes를 격판덮개의 바닥에 정착을 수 있습니다.
5. 언바운드 pH 지시자 활용 된 synaptosomes와 함께 미디어를 제거 하 고 각 잘 DPBS의 1 mL, 세 번 세척.
   주의: 가혹 하 게 씻지 않는. 공기 노출을 최소화 하기 위해 우물을 신속 하 게 세척.
6. 우물에 테스트를 추가 요소와 IP ABM의 500 µ L를 추가 합니다.
7. 라이브 이미징 악기에 접시를가지고 하 고 위치를 선택 합니다. 초점, 노출 시간, 밝기, 및 LED 전원 조정 합니다.
   참고: 노출 시간, 밝기, LED 전원에 대 한 설정은 형광 강도 따라 변수 및 실험의 목적입니다. 산도 표시기 활용 된 synaptosomes와 라이브 이미징 분석 결과, 우리가 일반적으로 그 값 다음과 같이 설정: 노출: ~ 150-200 ms, 밝기: 15, 그리고 LED 전원: 4-6.
8. 이미지 형식, 시간 간격, 그리고 라이브 이미징 사이클의 총 수를 설정 합니다. 1 시간 간격을 설정 하거나 얼마나 많은 위치에 따라 2 시간을 선택 합니다. 2 시간 간격으로 150 개 이상의 위치 라이브 이미징 선택 때 권장 됩니다.
9. 라이브 이미징 실험을 시작 합니다.
10. 데이터를 분석 합니다.
    1. 피지 프로그램을 엽니다.
    2. 이미지 시퀀스를 가져옵니다. 8 비트 회색조 이미지를 변환 합니다.
    3. 으로 50 픽셀의 반경을 바 배경 빼기를 수행 합니다.
    4. 시간 시리즈 분석기 V3 플러그인을 시작 합니다.
       참고: 시간 시리즈 분석기 V3 플러그인에 대 한 주소 테이블의 자료제공.
    5. 관심 (ROI) 클릭 하 고 이미지에서 영역을 드래그 하 여 ROI 관리자에 추가 합니다.
    6. 시계열 V3_0에서에서 "총 강도 얻을"을 클릭 합니다.
    7. 결과 저장 하 고 데이터 통합.

이 생체 외에서 먹어서 분석 결과 장기 라이브 이미징,에서는 사용 하는 ultracentrifugation (23% 그라데이션 솔루션 및 10% 그라데이션 솔루션 사이의 그라데이션 솔루션에서 분리 했다 성인 마우스 뇌 homogenates에서 synaptosomes 그림 3)입니다. 준비 후에, synaptosomes는 그들은 그들의 기능을 잃은 것 이다 및 microglia PS 수용 체에 의해 인식 될 수 있는 제안 하는 그들의 외부 막 (그림 4)에서 PS 노출. 그림 5에서 보듯이 pH 지시자 활용 synaptosomes 그들은 이다에 의해 잠겼습니다 했다 때 밝은 빨간색 형광 방출. Glial 세포의 engulfment 및 저하 용량의 실시간 비교 (보충 영화 1, 보충 영화 2) 마다 1 개 또는 2 h는 투자 수익의 여러 개의 이미지를 복용 하 여 가능 하다. 이 방법으로 우리는 사이토와 microglia 중재 먹어서 (그림 6)의 다른 활동을 시연 했다. 척도 glial 세포의 식 균 작용, 붉은 형광 신호 영역 (µ m2) 측정 했다는 그림 6B 에서 phagocytic index 라고 하 고 그림 7. 이다 많은 양의 산도 표시기 활용 된 synaptosomes phagocytosing에서 효율적으로 등장, microglia 덮어 및 synaptosomes (그림 6B) 저하에 더 빨리 했다. Microglia 보여주 최대 산도 표시기 강도 26 h에서 pH 지시자 활용 synaptosome 치료 후, 반면 이다 45 h에서 그들의 최대를 보였다 (p-값 < 0.05, 사이토 ACM X 1 1 X ACM와 microglia 사이 양방향 ANOVA). 마찬가지로, microglial 셀은 피크 포인트 후 이다는 같은 기간 동안 총 산도 표시기 강도에 17% 감소를 보여주었다 반면 총 산도 표시기 강도 40 h 20.7% 감소를 보여주었다. 흥미롭게도, 우리의 데이터를 보였다는 사이토 분 비 요인, ACM에 포함 된 두 사이토 microglia 중재 식 균 작용 (그림 6B) 증가에 필수적인. 이다 MFGE8, GAS6, 및 다리 및 phagocytic 수용 체 사이 상호 작용을 일으킬 수 있는 단백질 같은 브리징 분자 출시 표시 되었습니다 및 "먹고-나" PS23같은 신호. 위에서 설명 했 듯이, 이다 MERTK 및 MEGF10 경로4를 통해 시 냅 스를 제거 합니다. MEGF10는만 이다 두뇌에 의해 표현과 인식 통해 냅 engulfment 참가 "먹고-나" 알 수 없는 id 신호. 이전 연구 결과와 분석 결과 야생-타입 (WT) 마우스 이다, Megf10 녹아웃 (KO) 마우스 이다 보유 크게 장애인된 phagocytic 용량 (그림 7)와 비교 했다. 비해 WT 이다, Megf10 코 이다 보여주었다는 총 산도 표시기 강도 피크 지점 (31 h) (그림 7)에서 약 40% 감소.

그림 1입니다. 사이토 정화 immunopanning 방법을 사용 하 여의 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2입니다. 먹어서 라이브 이미징 분석 결과의 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3입니다. 대표적인 뇌 homogenate 분류 그라데이션 솔루션에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4입니다. PS 노출 synaptosomes의 대표 이미지. (A) A 이다 synaptosomes와의 이미지를 밝은 필드. Synaptosomes는 이다에 연결 됩니다. (B) 형광 이미지 tdTomato 표현 마우스에서 순화 된다 tdTomato-긍정적인 synaptosomes의 두뇌. (C) pSIVA PS, synaptosome의 외부 막에 노출 되 고 녹색 형광을 방출에 바인딩합니다. PSIVA (녹색)에 의해 감지 (D) PS tdTomato-긍정적인 synaptosomes (빨간색)와 함께 공동 지역화입니다. 눈금 막대: 20 µ m 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5. 대표적인 밝은 필드 및 두 개의 시간 지점에서 산도 표시기 활용 된 synaptosomes와 이다의 형광 이미지. 치료 (하단 패널) 후 11 h, pH 지시자 활용 된 synaptosomes 이다에 의해 잠겼습니다 하 고 그들은 치료 (위 패널) 후 1 시간에 하지 않습니다 반면 빨간색 형광을 방출. 눈금 막대: 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6. 쥐 이다 및 장기 라이브 이미징 통해 microglia 반응 하 속도 phagocytic 론 (A) A 시험관에서 먹어서 분석 결과의 순화 이다 pH 지시자 활용 된 synaptosomes 함께 microglia를 사용 하 여 회로도. 참고는 라이브 이미지는 촬영 전에 언바운드 synaptosomes는 멀리 세척 외피의 40 분 후. (B) 대표 그래프 이다 microglia의 engulfment과 저하 속도 보여주는. ACM, 사이토 분 비 요소를 포함 하는 크게 두 사이토 microglia 중재 synaptosome 이해를 향상 시킵니다. ACM 1 X와 함께 사이토: 사이토 제어 대 * * *, Tukey의 다중 비교 테스트. ACM 1 X와 함께 Microglia: Microglia 제어 대 * * *, Tukey의 다중 비교 테스트. 오차 막대 표시 S.E.M. *p ≤ 0.05, * * * p ≤ 0.0001, 양방향 ANOVA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 7입니다. Megf10 KO 마우스 이다 1의 감소 phagocytic 용량 X ACM WT 마우스 이다 1 X ACM와의 비교. Megf10 코 이다 1 X ACM와 대 WT * * *, 양방향 ANOVA. 오차 막대 표시 S.E.M. * p ≤ 0.05, * * p ≤ 0.01, * * * p ≤ 0.001 양방향 ANOVA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: 솔루션 조리법. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 1입니다. 대표 라이브 영상 비디오 보여주는 pH의 먹어서 표시기 활용 된 synaptosomes 이다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 2입니다. 대표 라이브 영상 동영상을 보여주는 먹어서 pH의 microglial 세포에 의해 지표 활용 synaptosomes. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

저자는 공개 없다.