이 프로토콜 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 이다 phagocytic 용량의 측정을 제공 합니다. Microglia 및 순화 된 쥐 이다 pH 지시자 활용 된 synaptosomes 함께 사용 됩니다. 이 방법은 실시간 engulfment과 저하 속도 검색할 수 있습니다 하 고 사이토 식 균 작용을 조절 하는 요소를 식별 하는 적합 한 심사 플랫폼을 제공 합니다.
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방법 논문
이 프로토콜 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 이다 phagocytic 용량의 측정을 제공 합니다. Microglia 및 순화 된 쥐 이다 pH 지시자 활용 된 synaptosomes 함께 사용 됩니다. 이 방법은 실시간 engulfment과 저하 속도 검색할 수 있습니다 하 고 사이토 식 균 작용을 조절 하는 요소를 식별 하는 적합 한 심사 플랫폼을 제공 합니다.
이다 두뇌에 있는 주요한 세포 유형 고 시 냅 스 및 혈관에 직접 문의. Microglial 세포는 주요 면역 세포와 뇌의 식 세포만 간주 되었습니다, 하지만 최근의 연구 이다 또한 개발 시 냅 스 제거 등의 다양 한 phagocytic 프로세스에 참여 Alzheimer의 질병 (광고)에서 베타 아 밀 로이드 플 라크. 이러한 결과도 불구 하 고 사이토 engulfment의 효율성 및 그들의 목표의 명확 하지 않다 microglia의와 비교. 정보의이 부족 있는 사이토 microglia 중재 먹어서의 활동은 쉽게 비교 분석 결과 시스템의 부족 때문에 주로 이다. 이 목표를 달성 하기 위해 장기 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 순화 이다와 microglia phagocytic 용량 평가를 개발 했습니다. 이 분석 결과에 engulfment과 저하의 실시간 탐지 표시기 활용 된 synaptosomes, 리소좀과 같은 산 성 세포에 밝은 적색 형광을 방출 하는 pH를 사용 하 여 가능 하다. 우리의 새로운 분석 결과 라이브 영상 통해 식 균 작용의 간단 하 고 효과적인 검색을 제공합니다. 또한, 화학 물질 및 향상 시킬 수 또는 이다의 phagocytic 용량을 억제 하는 화합물을 식별 하이 체 외에서 먹어서 분석 결과 심사 플랫폼으로 사용할 수 있습니다. 화학 물질 및 화합물 glial 세포의 phagocytic 용량을 조절 하는 다양 한 치료에 도움이 될 것으로 시 냅 스 가지 치기 오작동 및 병원 성 단백질 축적 정신 장애 또는 신경 퇴행 성 질환 원인 표시 되었습니다. 신경 장애입니다.
두뇌에 고르기가 아닌 셀 참조, glial 세포 중앙 신경 시스템 (CNS)에 주요 셀 유형입니다. 이전, glial 세포는 시 냅 스 속성과 기저 신경 생존 유지에 수동 역할 주로 단순한 지원 세포로 간주 되었다. 그러나, glial 세포 신경 생물학, 뇌 항상성, 중재 시 냅 스 형성1,2,3 , 시 냅 스를 유지 하는 등의 다양 한 측면에서 보다 적극적인 역할을 재생할 계시는 증거를 신흥 제거4,5, 그리고 변조 시 냅 스가 소성6,7. CNS에서 glial 세포는 이다, microglia, 및 oligodendrocytes 포함 됩니다. 이러한 세포, 이다와 microglia 보였다 시 냅 스4,5, apoptotic 세포8, 신경 파편
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여기에 설명 된 모든 메서드는 한국 고급 연구소의 과학 및 기술 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC), KA2016-08에 의해 승인 되었습니다.
1. synaptosome 정화
참고:이 절차는 이전에 게시 종이19 순화 synaptosomes (그림 1)의 수확량을 개선 하기 위해 몇 가지 수정 적응.
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이 생체 외에서 먹어서 분석 결과 장기 라이브 이미징,에서는 사용 하는 ultracentrifugation (23% 그라데이션 솔루션 및 10% 그라데이션 솔루션 사이의 그라데이션 솔루션에서 분리 했다 성인 마우스 뇌 homogenates에서 synaptosomes 그림 3)입니다. 준비 후에, synaptosomes는 그들은 그들의 기능을 잃은 것 이다 및 microglia PS 수용 체에 의해 인식 될 수 있는 제안 하는 그들의 외부 막 (그림 4)에서 PS 노출. 그림 5에서 보듯이 pH 지시자 활용 synaptosomes 그들은 이다에 의해 잠겼습니다 했다 때 밝은 빨간색 형광 방출. Glial 세포의 engulfment 및 저하 용량의 실시간 비교 (보충 영화 1
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이 문서에서 우리는 장기 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 정제 glial 세포 및 pH 지시자 활용 된 synaptosomes를 사용 하 여 위한 방법을 제시. 우리 microglia와 비교 하는 표시 이다 synaptosomes의 식 균 작용 동안 다른 engulfment 저하 용량을가지고. 또한, 우리의 데이터 사이토 분 비 요인, GAS6, 단백질, 및 MEGE8 같은 브리징 분자를 포함 하는 두뇌에 있는 glial 세포의 효율적인 PS 종속 먹어서 필수적입니다 것이 좋습니다. 또한, Megf10 코 이다 synaptosomes의 결함이 먹어서를 보여줍니다.
이 실험을 성공적으로 수행 하려면 미디어와 DPBS 세척 단계 (5) 교환 신중 하 게 해야 합니다. 기본 교양 이다 고 microglia, 특히 microglia, 공기 노출에 취약. 따라서 세척 단계 사이의 시간 간격을 줄이는 것은 라이브 세포를 유지 하기 위한 중요 한입.......
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저자는 공개 없다.
저자 감사 연-주 정 그녀의 실험적인 지원에 대 한 synaptosome 정화와 Jungjoo 공원 동안 PS 노출 synaptosomes의 이미지. 또한, 우리는 유용한 토론에 대 한 정의 실험실에서 모든 회원을 감사합니다. 이 작품은 한국 정부 (MSIP) (NRF 2016M3C7A1905391와 NRF-2016R1C1B3006969)에 의해 투자 하는 한국 (NRF) 부여의 국립 연구 재단에 의해 지원 되었다 (W. S. C)입니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| 퀵 스타트 Bradford 단백질 분석 키트 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH 지시약 접합 | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS 용액 | ||
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula 프로브 | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle' s 균형 잡힌 염 용액 (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| 소 혈청 알부민 | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| 염소 항-마우스 IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| 염소 항-마우스 IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| 헤파린 결합 표피 성장 인자 | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM 항체 | R& D 시스템 | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma superlabant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μ m | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| 정제 쥐 안티 마우스 CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| 정제 마우스 CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| 피루브산 나트륨 | Gibco | 11360-070 | |
| 아셀렌산나트륨 | 시그마 | S5261 | |
| 트랜스페린 | 시그마 | T1147 | |
| 트립신 | 시그마 | T9935 | |
| 트립신 억제제 | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | ||
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| 시계열 분석기 V3 플러그인 | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
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