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방법 논문

소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes

12K 조회수

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DOI:

10.3791/56647

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2018년 2월 5일

 , 

이 논문에서

요약

이 프로토콜 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 이다 phagocytic 용량의 측정을 제공 합니다. Microglia 및 순화 된 쥐 이다 pH 지시자 활용 된 synaptosomes 함께 사용 됩니다. 이 방법은 실시간 engulfment과 저하 속도 검색할 수 있습니다 하 고 사이토 식 균 작용을 조절 하는 요소를 식별 하는 적합 한 심사 플랫폼을 제공 합니다.

초록

이다 두뇌에 있는 주요한 세포 유형 고 시 냅 스 및 혈관에 직접 문의. Microglial 세포는 주요 면역 세포와 뇌의 식 세포만 간주 되었습니다, 하지만 최근의 연구 이다 또한 개발 시 냅 스 제거 등의 다양 한 phagocytic 프로세스에 참여 Alzheimer의 질병 (광고)에서 베타 아 밀 로이드 플 라크. 이러한 결과도 불구 하 고 사이토 engulfment의 효율성 및 그들의 목표의 명확 하지 않다 microglia의와 비교. 정보의이 부족 있는 사이토 microglia 중재 먹어서의 활동은 쉽게 비교 분석 결과 시스템의 부족 때문에 주로 이다. 이 목표를 달성 하기 위해 장기 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 순화 이다와 microglia phagocytic 용량 평가를 개발 했습니다. 이 분석 결과에 engulfment과 저하의 실시간 탐지 표시기 활용 된 synaptosomes, 리소좀과 같은 산 성 세포에 밝은 적색 형광을 방출 하는 pH를 사용 하 여 가능 하다. 우리의 새로운 분석 결과 라이브 영상 통해 식 균 작용의 간단 하 고 효과적인 검색을 제공합니다. 또한, 화학 물질 및 향상 시킬 수 또는 이다의 phagocytic 용량을 억제 하는 화합물을 식별 하이 체 외에서 먹어서 분석 결과 심사 플랫폼으로 사용할 수 있습니다. 화학 물질 및 화합물 glial 세포의 phagocytic 용량을 조절 하는 다양 한 치료에 도움이 될 것으로 시 냅 스 가지 치기 오작동 및 병원 성 단백질 축적 정신 장애 또는 신경 퇴행 성 질환 원인 표시 되었습니다. 신경 장애입니다.

서론

두뇌에 고르기가 아닌 셀 참조, glial 세포 중앙 신경 시스템 (CNS)에 주요 셀 유형입니다. 이전, glial 세포는 시 냅 스 속성과 기저 신경 생존 유지에 수동 역할 주로 단순한 지원 세포로 간주 되었다. 그러나, glial 세포 신경 생물학, 뇌 항상성, 중재 시 냅 스 형성1,2,3 , 시 냅 스를 유지 하는 등의 다양 한 측면에서 보다 적극적인 역할을 재생할 계시는 증거를 신흥 제거4,5, 그리고 변조 시 냅 스가 소성6,7. CNS에서 glial 세포는 이다, microglia, 및 oligodendrocytes 포함 됩니다. 이러한 세포, 이다와 microglia 보였다 시 냅 스4,5, apoptotic 세포8, 신경 파편

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 한국 고급 연구소의 과학 및 기술 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC), KA2016-08에 의해 승인 되었습니다.

1. synaptosome 정화

참고:이 절차는 이전에 게시 종이19 순화 synaptosomes (그림 1)의 수확량을 개선 하기 위해 몇 가지 수정 적응.

  1. 불연속 밀도 그라데이션 미디어를 준비 합니다.
    1. 얼음에 다음 장소: 그라데이션 버퍼에 3%, 10%, 그리고 23% 밀도 그라데이션 솔루션 (자당의 109.54 g, 트라이앵글, 606 mg와 0.2 M EDTA, pH 7.4의 5 mL 물 250 mL를가지고); 균질 화 버퍼 (추가 그라데이션 버퍼 x 4의 25 mL 및 물 74.5 mL로 50 m m DTT의 500 µ L); 균질 화기 박격포와 유 봉
      참고: 밀도 그라데이션 솔루션 및 준비 표 1에 선물 된다. 3%, 10%와 23% 밀도 그라데이션 솔루션을 준비 하려면 원시 밀도 그라데이션 솔루션을 사용 합니다.
    2. 3 성인 쥐 당 6 매우 명확한 원....

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결과

이 생체 외에서 먹어서 분석 결과 장기 라이브 이미징,에서는 사용 하는 ultracentrifugation (23% 그라데이션 솔루션 및 10% 그라데이션 솔루션 사이의 그라데이션 솔루션에서 분리 했다 성인 마우스 뇌 homogenates에서 synaptosomes 그림 3)입니다. 준비 후에, synaptosomes는 그들은 그들의 기능을 잃은 것 이다 및 microglia PS 수용 체에 의해 인식 될 수 있는 제안 하는 그들의 외부 막 (그림 4)에서 PS 노출. 그림 5에서 보듯이 pH 지시자 활용 synaptosomes 그들은 이다에 의해 잠겼습니다 했다 때 밝은 빨간색 형광 방출. Glial 세포의 engulfment 및 저하 용량의 실시간 비교 (보충 영화 1

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토론

이 문서에서 우리는 장기 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 정제 glial 세포 및 pH 지시자 활용 된 synaptosomes를 사용 하 여 위한 방법을 제시. 우리 microglia와 비교 하는 표시 이다 synaptosomes의 식 균 작용 동안 다른 engulfment 저하 용량을가지고. 또한, 우리의 데이터 사이토 분 비 요인, GAS6, 단백질, 및 MEGE8 같은 브리징 분자를 포함 하는 두뇌에 있는 glial 세포의 효율적인 PS 종속 먹어서 필수적입니다 것이 좋습니다. 또한, Megf10 코 이다 synaptosomes의 결함이 먹어서를 보여줍니다.

이 실험을 성공적으로 수행 하려면 미디어와 DPBS 세척 단계 (5) 교환 신중 하 게 해야 합니다. 기본 교양 이다 고 microglia, 특히 microglia, 공기 노출에 취약. 따라서 세척 단계 사이의 시간 간격을 줄이는 것은 라이브 세포를 유지 하기 위한 중요 한입.......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자 감사 연-주 정 그녀의 실험적인 지원에 대 한 synaptosome 정화와 Jungjoo 공원 동안 PS 노출 synaptosomes의 이미지. 또한, 우리는 유용한 토론에 대 한 정의 실험실에서 모든 회원을 감사합니다. 이 작품은 한국 정부 (MSIP) (NRF 2016M3C7A1905391와 NRF-2016R1C1B3006969)에 의해 투자 하는 한국 (NRF) 부여의 국립 연구 재단에 의해 지원 되었다 (W. S. C)입니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Synaptosome purification
PercollGE healthcare life sciences17-0891-01
퀵 스타트 Bradford 단백질 분석 키트 2BIO-RAD5000202
pH 지시약 접합
Dimethyl sulfoxide(DMSO)LPS 용액
pHrodo red, succinimidyl esterMolecula 프로브P36600
Immunopanning
10X Earle' s 균형 잡힌 염 용액 (EBSS)SigmaE7510
소 혈청 알부민BovogenBSA025
Deoxyrebonuclease 1 (DNase)WorthingtonIs002007
(DMEM)Gibco11960-044
(dPBS)WelgeneLB001-02
Fetal bovine serum (FBS)Gibco16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1)Vector LabsL-1100
염소 항-마우스 IgG+IgM(H+L)Jackson ImmunoResearch115-005-044
염소 항-마우스 IgM (μ-chain)Jackson ImmunoResearch115-005-020
헤파린 결합 표피 성장 인자SigmaE4643
Human HepaCAM 항체R& D 시스템MAB4108
Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52)eBioscience14-0497-82
L-cysteineSigmaC7880
L-glutamateGibco25030-081
N-acetly-L-cyteine (NAC)SigmaA8199
Neurobasal mediaGibco21103-049
O4 hybridoma superlabant(mouse IgM)Bansal et al.23
PapainWorthingtonIs003126
페니실린/스트렙토마이신Gibco15140-122
Pluristrainer 20 μ mPluriSelect43-50020-03
Poly-D-lysineSigmaP6407
ProgesteroneSigmaP8783
Putrescine dihydrochlorideSigmaP5780
정제 쥐 안티 마우스 CD45BD Pharmingen550539
정제 마우스 CD45BD Pharmingen554875
피루브산 나트륨Gibco11360-070
아셀렌산나트륨시그마S5261
트랜스페린시그마T1147
트립신시그마T9935
트립신 억제제WorthingtonLS003086
Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear)Beckman Coulter344059
Collect IP-ACM
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k)PALLMAP010C37
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k)PALL
Phagocytosis live imaging assay
Juli stageNanoEntek
시계열 분석기 V3 플러그인https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html
DMSO100 MAP030C37

참고문헌

  1. Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
  2. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via Gl....

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