해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사

요약

이 프로토콜 추적에 의해 모니터링 활력 매개 변수 및 저압 플라즈마 처리 후 새 균의 subtilis 포자를 되살리는에서 DNA 복구 프로세스의 관련성을 평가 하는 데 필요한 중요 한 연속 단계를 보여 줍니다. 형광 표시 DNA 복구 시간 해결 confocal 현미경 검사 법 및 전자 현미경 검사를 통해 단백질.

초록

플라즈마 살 균 산업, 임상, 및 spaceflight 목적으로 기존의 살 균 방법에 유망한 대안 이다. 저압 플라즈마 (LPP) 방전 급속 한 미생물 비활성화 이어질 활성 종의 광범위 한 스펙트럼을 포함. 효율성과 LPP에 의해 살 균의 메커니즘 연구, 우리는 기존의 살 균 절차에 대 한 그들의 특별 한 저항 때문에 새 균의 subtilis 테스트 기체의 포자를 사용 합니다. 우리는 B. subtilis 포자 monolayers, 이중 유도 결합된 플라즈마 반응 기, 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 포자 형태학의 특성에서에서 저압 플라즈마에 의해 살 균 과정의 생산을 설명 하 고는 발 아 및 라이브 셀 현미경으로 포자의 파생물의 분석. 플라즈마의 주요 대상 게놈 소재 (DNA) 이며 포자 부흥 시 플라즈마 유도 DNA 장애의 복구는 생물의 생존을 위해 중요 한. 여기, 우리는 포자의 발 아 능력을 연구 하 고 DNA의 역할 붙일 이라는 DNA 복구 단백질 (RecA) 시간 해결 공초점 형광 현미경 검사 법으로 추적 하 여 LPP와 치료 후 포자 발 아 및 파생물 복구 합니다. 치료 및 치료 포자 monolayers는 발 아에 대 한 활성화 개별 포자의 반응에 따라 시간이 지남에 거꾸로 confocal 라이브 셀 현미경으로 시각. 우리의 관측 공개 출 아 포자를 빨리 성장 하 고 일부 LPP 트리트먼트 120 s. RecA YFP (노란색 형광 단백질) 형광 몇 포자에만 감지 되 고 모두에 개발 되었다 후 최소에 도달의 기간에 따라 달라 집니다. LPP 취급 포자에 약간의 상승으로 빨리 성장 세포. 또한, 일부 식물 박테리아의 세포질에 있는 증가 보여주었다 LPP 취급 포자에서 파생 된 그리고 lyse 경향이. 개별 포자의 분석에 대 한 설명된 방법 포자 발 아 및 파생물의 다른 측면의 연구에 대 한 훌륭한 될 수 있습니다.

서론

우주 탐사의 주요 목표는 생명체와 다른 행성 몸과 우리의 태양계에 있는 달에 생체의 서명에 대 한 검색입니다. 미생물의 전송 또는 탐험의 중요 한 영역을 지구 근원의 생체 개발 및 생활 탐지 임무 화성과 유로 파¹등 행성의 시체의 무결성을 영향을 미칠 특정 위험입니다. 여는 위원회의 공간 연구 (COSPAR) 1967 년에에서 설립, 행성 보호의 국제 지침 다른 행성, 그들의 위성, 소행성, 및 다른 천체를 유인 하 고 로봇 임무에 대 한 엄격한 규제를 부과 하 고 규제는 청소 및 살 균 지상파 미생물 오염 제거 하 고 천체²의 교차 오염을 방지 하기 위하여 발사 하는 우주선과 이전 중요 한 하드웨어 구성 요소. 지난 10 년간 비 열 플라즈마의 응용 spaceflight 응용 프로그램^3,,45뿐만 아니라 생물 의학 및 영양 연구에 광범위 한 관심을 얻고 있다. 신속 하 고 효율적인 미생물 비활성화⁶을 민감한 부드러운 고 열 불안정 물질 동안 제공 플라즈마 살 균은 기존의 살 균 방법에 유망한 대안 ....

프로토콜

1. 새 균의 subtilis 포자 생산 및 정화

1. 포자 생산에 대 한 각각의 5 mL 하룻밤 문화 전송 B. subtilis 스트레인, 적절 한 항생제, 200 mL (당 리터 16 g 영양 국물, KCl 2 g, 0.5 g MgSO _{더블 강도 액체 쉐 퍼 포자 형성 매체를 보충 4}* 7 H₂O 2 mL 1 M Ca (₃)₂, 2 mL의 0.1 m M MnCl₂ * • 4 H₂O 2 mL 1 m m FeSO₄, 2 mL 50% (w/v) 포도 당¹⁸) 72 h 또는 문화 > 95%까지 37 ° C에서 활발 한 통 기 통풍으로 육성 sporulated는. 다음 변종 포자 사용 됩니다: B. subtilis PY79 (야생 유형) B. subtilis PY79ΔrecA:: 네오 (DNA 수 선 단백질 RecA의 결핍) B. subtilis PY79 recA yfp:: 고양이 (RecA 융합 노란색 형광 단백질 [YFP]¹⁹).
2. 5....

결과

플라즈마 처리 B. subtilis 의 생존 포자

B. subtilis 포자의 플라즈마 처리 사용이 연구 보기 생존 감소 (그림 2) 플라즈마 처리의 내구 증가 함께. RecA표현 스트레인의 포자-YFP 융합 유전자 유전 수정 세균 활력에 더 큰 영향을에 나타내는 야생 유형 긴장의 포자와 비슷한 생존 곡선을 보여주었다. RecA 불충분 한 긴장의 포자 RecA 유전자의 존재 활력의 플라즈마 유도 손실 감소는 보여주는 야생 유형 긴장의 포자에 비해 플라즈마 치료 향해 더 높은 감도 전시 한다. 특히 짧은 15의 플라즈마 처리 s (P <0.003) 30 s (P < 0.004) 야생 유형에 비해 RecA 불충분 한 긴장과 Rec.......

토론

낮은 온도 사용 하 여 표면 살 균, 저압 플라즈마는 이온화 방사선, 화학 치료 등 오히려 기존의 살 균 절차를 유망한 대안 (예: 가스 H₂O₂ 와 같은 또는 에틸렌 산화물) 또는 건조 하 고 습 한 열²³. 일반 살 균 방법을 주로 효과적인 살 균을 제공 하지만 그들은 치료 재료 영향 및 연산자에 대 한 잠재적인 위험을 나타내는 알려져 있습니다. 저압 플라즈마는 자외선 광자, 자유로운 전자, 이온 등 여러 구성 요소 구성을 사용 하 여 신속 하 고 동종 생물 비활성화를 제공 하 고 원자 또는 분자 (예: 선생님) 종료. 따라서, LPP 같은 열가 소성 고분자 임 플 란 트, 전자 기기 또는 복잡 한 3D-구조에 대 한 열 및 부식 민감한 재료에 적용할 수 있습니다. 현재 신문에서 우리는 테스트 시스템의 응용 프로그램, 스프레이 B. subtilis 의 어떤 monolayers 포자

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2개 물질 노즐(모델 970-8)	Schlick	14,404	230V, 50Hz, D, 4.484/8, 0.8mm 보어 직경
Luria Bertani Medium	Sigma Aldrich	70122-100G
튜브 커넥터	Festo	n/a	G 1/8
마그네트밸브 DO35-3/2NC-G018-230AC	Bosch Rexroth	820005100
PLN 폴리아미드 튜브	Festo	558206	D = 6 밀리미터
유리 슬라이드	VWR	48300-026
전기 타이머 550-2-C	Gefran	F000074	220 V
attofluor cell chamber	Menzel, Fisher Ref.	3406816	d=25mm, 원형
MgSO4*7 H2O	시그마 Aldrich	13152
Ca(NO3)2	Sigma Aldrich	202967
MnCl2 * 4 H2O	시그마 Aldrich	244589
FeSO4 * 7H2O	AppliChem	13446-34-9
포도	Merck	215422
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G
영양 육수 (NB)	Merck	105443
Luria-Bertani (LB)	Merck	110283
96-wellplate	ThermoFisher	243656
Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH		해당 사항 없음
Leo 1530 Gemini	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
ZEN 2 및 ZEN lite 2012 (소프트웨어)	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software)	Systat GmbH, Erkrath, Germany	n/a
Attofluor cell chamber	Invitrogen	A7816
µ-Dish 35 mm, high Grid-500 유리 바닥	ibidi	81168

, 당