발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 Oocytes의 신경 네트워크 기반 식별

Summary

여기, 선물이 oocyte 발달 능력 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포에서 분열 II 단계 동안 수행의 비-침략 적 평가 대 한 프로토콜. 이 방법은 입자 이미지 velocimetry (PIV)와 신경망 분석 시간 경과 영상을 결합합니다.

Abstract

불 임 클리닉 발달 유능한 대 무능 한 oocytes 전반적인 임신 결과 향상 비-침략 적 절차를 사용 하 여 선택 하는 기능에서 도움이 됩니다. 우리는 최근 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포 (GV)에서 세포질 움직임의 분석 이어서 분열 II 단계 동안 마우스 oocytes의 미세한 라이브 관측에 따라 분류 방법 개발 이 경과 기간 동안 발생 하는. 여기, 우리는이 절차의 상세한 프로토콜을 제시. Oocytes 가득 antral 낭에서 격리 되며 15 h 37 ° C, 5% CO₂시간 경과 분석 위해 현미경 내부에 대 한 교양. 사진은 8 분 간격으로 찍힌다. 이미지 각 oocyte 대 한 세포질 이동 속도 (CMVs) 문화 기간에 걸쳐 발생의 프로 파일을 계산 하는 입자 이미지 Velocimetry (PIV) 방법을 사용 하 여 분석 된다. 마지막으로, 각 단일 oocyte의 CMVs는 발달 관할 또는 91.03%의 정확도로 무능 한 배우자의 확률을 예측 수학 분류 도구 (피드 포워드 인공 신경 네트워크, FANN)를 통해 먹인 다. 이 프로토콜, 마우스에 대 한 설정 인간을 포함 한 다른 종의 oocytes에 지금은 테스트 수 있습니다.

Introduction

여성 불 임 여성의 증가 수에 영향을 주는 병 이다. 세계 보건 기구에 따르면 약 20% 커플의 되지 않습니다 비옥한, 여성 불 임 인 40%. 또한, 암 치료를 받고 여자의 1/3 (300000/년 및 30000/년 미국이 나 이탈리아, 각각) 조기 난소 실패를 개발.

암 환자에서 불 임 방지 하는 전략 (GV MII 전환) MII 단계로 GV oocytes 분리와 뒤 에서 체 외 성숙 (IVM) 종양학 치료 전 난소 낭의 cryopreservation입니다. 수정와 개발 프로세스와 전체 임신 성공^1,2oocyte 발달 능력의 비-침략 적 마커의 가용성 향상 것 이다.

Supravital 형광 색소 Hoechst 33342와 얼룩 후 관찰 그들의 염색 질 구성에 따라 가득 포유류 oocytes는 포위 핵소체 (SN) 또는 하지 포위 핵소체 (NSN)³로 분류 됩니다. 그들의 다른 chromatin 조직 외에 이러한 두 가지 유형의 oocytes 많은 형태학 상과 기능적인 차이^3,....

Protocol

동물 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 및 파 비아 대학에서 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 동물 22 ° C, 60% 공기 습도와 명암 주기 12:12 h의 조건 하에서 유지 되었다.

1. 난소 격리

1. Intraperitoneally 2 4-11 주 된 CD1 여성 쥐 10 U 여 포 호르몬을 자극 하는 살 균 1 mL 인슐린 주사기의 주사.
2. 46-48 h를 기다립니다.
3. Zoletil (Tiletamina, Zolazepan cloridrate)의 50 mg/kg의 근육 주사와 anesthetize 및 마우스 무게. 자 궁 경부 전위에 의해 안락사.
4. 피부 절 개 집게의 쌍을 사용 하 여 복 벽을 덮고 파악. 피부를 잘라 하 고 한 쌍의가 위와 풀으로 체 벽 집게와 절 개를 엽니다.
5. 핀셋의 쌍을 사용 하 여, 배 짱, 자 궁 뿔을 정확 하 고 그들의 말단에 난소를 지역화 이동 합니다.
6. 부드럽게 시계 집게를 사용 하 여 난소를 누른 자 궁에 그것의 인 대를 잘라가 위를 사용 합니다. 다른 난소와 반복.
7. 37 ° C, 5% CO₂ 공기에서에서 미리 예 열 하는 M2 절연 매체의 1 mL를 포....

Results

그림 2 는 각각 처음 (GV) 및 끝 (MII) IVM 절차의 대표적인 발달 유능 하 고 무능 한 oocyte를 보여준다. IVM 가득 마우스 oocytes의 15 h 문화 발생합니다. 시간 경과 관찰 감수 분열의 진행을 기록 하 고는 GVBD와 첫 번째 극 시체의 돌출을 포함 하 여 주요 meiotic 이벤트 감지.

분석 및 비교 무능 한 oocytes 발달 유능한 대 이상 2 백의 감수 분열의 진행에서 시간 차이 보였다. 특히, NSN oocytes에서 GVBD는 크게 지연 1-2 시간 경과 프레임, PB1 압출 15 프레임 지연으로 발생 하는 반면. 이러한 차이도 불구 하 고 가변성은 단일 oocyte 분류를 허용 하도록 너무 높다. 이 절차는 수학적 분류 도구 구현 되었습니다.

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Discussion

하나 마우스 oocytes 뿐만 아니라 다른 종족 들이 프로토콜을 수행 하는 동안 알아서 해야 합니다 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 일단 그들의 여 포에서 격리, oocytes 한다 즉시 전송 기록 방울에 동반자 적 운에서 분리 트리거 세포로 GV MII 전환 시작. 현재 프로토콜을 가능한 수정 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)의 추가 M2 매체 COCs 절연을 위해 사용 될 수 있습니다. IBMX GV MII 전환의 즉각적인 발생을 방지 하 고 oocytes의 전체 실험 그룹의 동기화 수 있습니다.

라이브 셀 심사 시스템 ( 재료의 표참조) 우리의 실험에 사용 된 4 방울, 따라서 실험 당 16 oocytes의 총 당 4 oocytes 성숙 상품의 수를 제한 합니다. 시스템 사용 하 여 다른 시간 경과 라이브 셀-상영, 상업적으로 사용 가능 하 고 여러 문화 챔버에 장착이 한계를 극복할 수 수 있습니다.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Folligon	Intervet	A201A02	호르몬 치료
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	난자 이질염색
세포 배양 페트리 디쉬 35 mm x 10 mm	코닝	430165	COCs 격리
EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red	Merck-Millipore	MR-015-D	COCs 격리
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax	Sigma-Aldrich	M4526	난자 세포
배양 페트리 디쉬 35 mm 유리 바닥	윌코	GWSt-3522	이미징 실험용
BioStation IM-LM	Nikon	MFA91001	라이브 셀 스크리닝 시스템
파스퇴르 피펫	Delchimica Scientific 유리 6709230		난포 조작용
미네랄 오일	Sigma-Aldrich	M8410	오염 및 매체 증발을 방지하기 위해
Penicillin / Streptomycin	Life Technologies	15070063	매체 오염을 방지하기 위해
소 태아 세럼 (FBS)	시그마-알드리치	ML16141079	메이크업 &알파; MEM 매체
L-글루타민	Life Technologies	25030	메이크업 & 알파; MEM 매체
타우린	시그마-알드리치	T0625	메이크업 &알파용; MEM 매체
소 혈청 알부민 (BSA)	시그마 - 알드리치	A3310	메이크업 α MEM 매체
나트륨 피루브산	시그마-알드리치	P4562	메이크업 &알파; MEM 미디어
Zoletil (Tiletamina 및 Zolazepan cloridrate)	Virbac Srl	QN01AX9	마우스 마취
Cell_PIV 소프트웨어용	영국 브리스톨 대학교의 Shane Windsor 박사가 친절하게 제공했습니다&	nbsp;                            -&	nbsp;                            -
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA	-	다중 패러다임 수치 컴퓨팅용