후에 쥐에 있는 정액 액의 측정 및 여성 재생산 지역에서 정액 짝짓기의 컬렉션

요약

정액 액 화는 정액 젤에서 해방 될 정자에 대 한 필요 합니다. 이 연구는 여성 재생산 지역 포스트 성교에서 정액을 수집 하 고 정액 액 화 시간을 측정 하기 위한 절차를 제공 합니다.

초록

마우스에 ejaculated 정액은 자 궁에 입금 됩니다. 사정 후 정액에서 젤 같은 일관성을 변경 물, 프로세스 라는 액 화. 이 연구에서 우리는 마우스 모델에서 여성 재생산 지역에서 후 ejaculated 정액을 수집 하는 방법을 보여줍니다. 첫째, 성인 여성 쥐 발 정기 단계에서 남자의 감 금 소에 하룻밤 보관 되어 있었다. 다음날 아침, 결합 질에 copulatory 플러그의 존재에 의해 확인 됐다. 여성 쥐 copulatory 플러그와 안락사 했다 고 각 생식 관 (질, 자 궁, oviducts, 난소), 전체적으로 수집 된 정액을 포함 하는 닫힌된 시스템을 보장. 튜브에 정액을 풀어 질 렸와 생식로 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 배치 되었다. 분석에 대 한 최대 정액 볼륨을 보장 하기 위해, 한적한 집게는 나머지 정액을 추방 하는 질 끝에 난소에서 자 궁 뿔을 집어넣은 사용 되었다. 전체 생식 관은 다음 삭제 됩니다. 정액에 포함 된 튜브는 잠시 내려 냈 지. 25 μ 모 세관 피 펫 (튜브 벽에 평행) 180 ° 각도로 튜브에 배치 했다. 25 μ 라인에 모 세관 튜브를 작성 하는 데 사용 하는 시간을 기록 했다. 검증 된 남성 종 축에서 정액은 일반적으로 25 μ 모 세관 튜브를 채우기 위해 약 60-180 s를 걸립니다. 이 정액 컬렉션 기술은 또한 정자 이미징 및 운동 성 분석 등 다른 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.

서론

여성 재생산 지역 상위 및 하위 책자의 구성 됩니다. 위 재생산 지역에는 나 팔 관, 자 궁 그리고 endocervix는 포함 되어 있습니다. 낮은 재생산 지역에는 ectocervix 및 질 포함 됩니다. 인간에서는, ejaculated 정액 ectocervix¹에 인접 한 질 앞쪽 벽에 입금 됩니다. 그러나 쥐,, 정액은 휩 쓸 자 궁으로²짝짓기 후 분 이내.

정액 침투 수를 정자를 일으키는 루의 초 이내에 경화 되 고³움직일 정액 젤을 포함 합니다. 액 화 물 일관성에 젤 같은에서 정액을 변경 하 여 고정된 정자를 해제 합니다. 이 과정은 정자의 운동 성 및 포유류 복제에 대 한 필수적입니다. 정액 액 화의 지식은 주로 어디 정액 문화 접시에 액 화 된다 생체 외에서 연구 기반으로 합니다. 인간에서는, 전립선 특정 항 원 또는 PSA (일컬어 kallikrein 관련 peptidase 3 또는 KLK3)의 효소 활동은 semenogelins (젤 형성 단백질 정액에 존재)^{4 의 가수분해를 통해 액 화에 대 한 주요 기여자 ,56}. Semenogelins의 정자 이동성 증가 정액 coagulum에서 정자를 줘 라. 계란을 기름 지 게 나 팔 관으로 정자 수영을 해제. 액 화 (또는 정액 점도) 테스트는 불 임 클리닉 남성 불 임⁷평가에서 정액 분석을 위한 표준 초기 검 진 중 하나.

최근에 출판 된 기사를 정액 액체 여성 마우스 생식 관 후 짝짓기에서 수집 된의 분석 이후에 다 산 결함⁸를 일으킬 수 있는 액 화 결핍을 설명 하기 위해 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 결함이 액 정액 hyperviscosity 같은 남자⁹, 일반 액 화는 포유류 복제를 위한 불가결 제안에 불 임 사례의 11.8 32.3%에 기여 한다. 그러나, 연구 및 치료 액 결함의 남성⁷에 독점적으로 집중 했다. 여성 재생산 지역 정액 액 화에서 역할을 담당 하는 가능성은 탐구 하지. 따라서, 정액 수집 및 액 화 시간 측정 방법 연구 액 관심의 모델 생물에서 불 임의 원인 중 하나 될 수 있는지 여부를 결정 하는 새로운 진단 도구를 제공 합니다.

프로토콜

모든 동물 및 절차가이 연구에 사용 된은 WSU 승인 동물 프로토콜 #4702 # 4735과 워싱턴 주립 대학 (WSU) 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 처리 합니다.

1입니다. 마우스

1. 사용 하 여 표준 C57BL/6J 성인 남성 쥐 또는 관심의 다른 긴장. 물과 음식 광고 libitum 액세스와 온도 및 습도 제어 환경에서 동물을 유지 한다.
   1. 8 주 정도에서 10 개월에 이르기까지 남성 브리 더를 사용 합니다. 실험에서 입증 된 종만을 사용 합니다.
2. 재생산 지역 스 트로 겐 수용 체 α ( Esr1 유전자 인코딩)의 조직 선택적 삭제와 성인 여성 쥐를 사용 하 여 상피 세포¹⁰ (Wnt7a^{Cre / +}; Esr1^f/f, 녹아웃 또는 "코" 라고)이이 연구에서 littermates (Esr1^f/f, "CTRL" 라는) 제어.
   1. 8 주 된 여성을 사용 합니다. 여성의 연령대의 실험에 따라 다양합니다.
3. 아침 08시 h에 estrous 사이클의 단계를 결정 합니다. 주기의 발 정기 단계에서 여성만을 사용 합니다. 질 번짐 및 cytological 분석의 자세한 방법에 대 한 이전 게시 절차¹¹를 참조 하십시오.

2. 짝짓기와 Copulatory 플러그를 평가

1. 발 정기 (16시 h) 일에서 남자의 감 금 소에 여성을 집.
2. 다음날 아침 (08시 h), 남성 마우스에서 여성을 구분 합니다.
3. 짝짓기의 표시로 질 또는 copulatory 플러그의 유무를 이전에 게시 방법¹² 의 적응을 사용 합니다.
4. 짧게 뒷 다리 사지를 들어 꼬리의 기지에서 여성 마우스를 잡아.
5. 이쑤시개를 사용 하 여 질 오프닝에서 하얀 정액 coagulum의 존재에 의해 copulatory 플러그를 찾아. 있으면 copulatory 플러그, 이쑤시개 질 운하에 삽입할 수 없습니다.

3입니다. 조직 컬렉션 전에 준비

1. 10 mL Leibovitz의 L-15 미디어, 보충 1% 태아 둔감 한 혈 청의 준비 (라고 L15 미디어 + 1 %FBS) 15 mL 튜브에. waterbath에 15 분 동안 37 ° C에서 미디어를 품 어.
2. 조직 및 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 정자의 생존을 위해, 미리 데워 진 L15 미디어 + 1%의 aliquot 2 mL 2 mL microcentrifuge에서 FBS 조직 컬렉션에 대 한 관.
3. 37 ° c.에 stereomicroscope의 단계를 따뜻한 37 ° C로 열 블록을 설정 하 고 블록에는 빈 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 배치.
4. 다운스트림 응용 프로그램에서는 정자의 운동 성, 따뜻한의 37 ° c 유리 슬라이드 이미징 하는 경우

4. 조직 컬렉션

1. 조직 컬렉션 영역에 미리 따뜻하게 L15 미디어 + 1 %FBS 약 수를가지고.
2. 여성 안락사 (~ 08:30 h) 자 궁 경관 탈 구 다음 이산화탄소 질 식을 사용 하 여.
   참고: 이것은 대략 8 h 짝짓기 후 가정 자정에 일어난 짝짓기입니다.
3. 복 부 영역을 노출 하는 부정사 위치에 동물을 놓습니다.
4. 복 부 뒷 다리 사지 근처에 70% 알코올을 스프레이.
5. 낮은 복 부의 피부에 작은 상처 (~ 1 cm)을 해가 위를 사용 합니다.
6. 지배적인 손을 꼬리 (및 필요한 경우 뒷 다리 사지)를 사용 하 여 비 지배적인 손을 당긴 다 피부 (머리)를 향해 반대 방향으로 복 부 근육을 노출 하는 동안. 이 메서드는 내장 장기에 머리 오염의 최소화 하는 데 사용 됩니다.
7. V-모양에 인접 한 질, 복 부의 기지에서 내장 장기를 노출 하는 복 부 근육을 잘라.
8. 내장 및 복 부 지방 노출 재생산 지역 쪽으로 이동 합니다.
9. 방광과 질 영역 위에 다른 조직에서 트림.
10. 음모 관절 질 조직에 대 한 액세스를 얻기 위해 떨어져 잘라.
11. 질에 질 직물 들어올린 직장 조직에서 질 운하를 분리 하는 위를 사용 하 여.
12. 신중 하 게 봄이 위를 사용 하 여 자 궁의 양쪽에서 mesenteric 지방에서 트림.
    주의: 자 궁 안에 정액 매우 깨지기 쉬운입니다. 자 궁을 찔린 하지 않도록 주의 하십시오 또는 다른 정액 손실 됩니다.
13. 더 낮은 재생산 지역 들어올리고 양쪽의 난소 지방 패드를 잘라 합니다.
14. 미리 따뜻하게 Leibovitz L-15 미디어 + 1%의 관에는 전체 생식 기관 전송 FBS.

5. 자 궁 콘텐츠 컬렉션에서 정액 액 화 (점도)의 측정

1. stereomicroscope의 열띤된 무대에서 35mm 무 균 조직 문화 접시에 조직 3.5 mL 가득 전송 사전 예 열 L-15 미디어 + 1 %FBS 혈액과 다른 오염 물질의 조직 청소.
   주의: 세척, 동안 지방, 아니라 자 궁 조직을 잡아. 정액이 시점에서 예상 되는 자 궁 안에 그대로 수.
2. 실험실 물티슈를 사용 하 여 초과 미디어의 조직 오 점.
3. 미리가 열된 microcentrifuge 관에서 난소 끝을 배치 하면서 조직 질 끝에 잡으십시오. 질 끝을 잡고, 자 궁, 자 궁 뿔 microcentrifuge 튜브에 빠지게 할 수 있도록의 기지에서 자 궁 뿔을 잘라.
4. 정액 하 게 튜브에 자 궁 뿔에서 흐름. 한적한 포 셉을 사용 하 여 부드럽게 질 끝, 남은 정액 밖으로 추방 하는 난소에서 자 궁 뿔을 짠 다.
5. 생물 학적 가방에서 티슈를 삭제 하 고 소 각.
6. 짧게는 minicentrifuge에 정액 아래로 회전 (1 ~ 2 s).
7. 튜브, 열띤된 무대에 평행 하다-정액 밖으로 유출 하지 않습니다.
8. 타이머를 준비 하 고 '을 계산 하 는'로 설정.
9. (튜브 벽에 평행) 180 ° 각도로 정액 샘플으로 25 µ L 모 세관 튜브를 삽입 합니다. 이것은 다른 각도에서 모 세관 튜브를 잡고 각 조사 사이 가변성을 최소화 하는 것입니다.
10. 모 세관 튜브 게 타이머를 누르면 정액과 접촉.
11. 정액 25 µ L 라인에 도달 하는 데 걸리는 시간 (s)를 기록 합니다.
12. 측정 완료 되 면 바로 추가 기능 분석, 정자 운동 성의 비디오 영상 등을 위해 건조 열 블록에 다시 정액을 포함 하는 튜브를 넣어.
13. 20 분 동안 10% 표 백제 솔루션에서 튜브를 immersing 하 여 정액을 포함 하는 모 세관 튜브를 소독 하 고 세관 sharps 컨테이너에서 삭제.

6. 비디오 이미징 정자 운동 성의

1. 현미경 및 비디오 이미징 소프트웨어 설정.
2. 유리 슬라이드 온수 스테이지에 배치 하는 동안 미리 데워 진된 유리 슬라이드에 남은 정액의 20 µ L를 플라스틱.
3. 유리 coverslip 커버.
4. 현미경 슬라이드 coverslip 측면을 내려 놓습니다.
5. 20 X 렌즈를 사용 하 여 관심 영역을 찾을 수 있습니다.
6. 100 X 객관적 렌즈 비디오 영상에 대 한 변경 합니다.
7. 30 12 프레임/s (fps)에서 비디오 s.
8. 임의로 동물 당 적어도 3 개의 다른 영역에 동영상을 기록 합니다.
9. 이미징 수행 신속 하 고 정자의 운동 성 및 생존 능력을 유지 하기 위해 슬라이드에 빛 노출을 최소화.
   참고:이 이미징 절차는 2-3 분 내에서 행해져야 한다.
10. 앞에서 설명한⁸ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 데이터 분석을 수행 합니다.

결과

정액은 비옥한 CTRL 남성과 짝짓기 후 ctrl 키와 코 여성 약 8 h에서 수집 되었다. 액 화 (또는 정액 점도) 정액 25 μ 모 세관 튜브를 작성 하는 데 걸린 시간에 의해 정량 이다. 정액에서 CTRL uteri 수집 했다 2.06 ±0.12 분 (mean±S.E.M, n = 5) 모 세관 튜브 (그림 1)을 채우기 위해. 그러나, 정액 코 uteri에서 수집 했다 60 분 이상 (60.0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) 실험 시간. 이러한 데이터 정액은 크게 더 액 화 또는 CTRL에 보다 적게 점성 코 uteri에 비해 좋습니다.

여성 재생산 지역에서 정액을 모으기의 다운스트림 응용 프로그램 중 하나를 설명 하기 위해 정자 운동 성 비디오 이미지를 사용 하 여 평가 했다. 정액 그림 2A에서 스냅숏에서 미세한 필드 ...

토론

같이 전 수 정액 및 여성 재생산 지역. 에서 분 비 물 간의 생리 적인 상호 작용 정액 분석에서 생체 외에서 이점을 제공할 수 있습니다 마우스 uteri에서 정액을 수집 이 연구에서 제시 하는 기술 연구원 정액 품질과 정자 생존으로 이상적인 생리 조건에서 운동 성을 확인 하 수 있습니다. 또한, 정액은 uteri에서 수집 된를 사용 하 여 수행할 수 있는 다양 한 다운스트림 분석, 예를 들어 정자 자 궁 및 정자 입력 실제 정자 수는 또한 운동 성 분석에 대 한 몇 군데 수 결정 계산 하실 수 있습니다. 수정 기능에 대 한 정액을 수집 하도록 이상적인 시간 포인트¹짝짓기 후 1 ~ 2 h 이내 이어야 한다.

이전에 언급 한 다운스트림 응용 프로그램 뿐만 아니라 조사 또한 정자 수송에 억제제/화합물 관심의 효과 평가 수 처리, 정액 액 화 (또는 정액 점도), 정자 수, 정자에 운동 성, 또는 다른 지역 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
이쑤시개	Diamond	750-Flat	오토클레이브 멸균, 무딘 이쑤시개 사용. 뾰족한
해부 가위를	Fisher	08-940
스프링 가위	Roboz	RS-5600
미세 집게	Roboz	RS-5045
25-μ L 유리 모세관	VWR	53432-761
Leibovitz' s L-15 media	Life Technologies	11415064	1% FBS
소 태아 혈청(FBS)	Gemini Bio-Products	100-106
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브	Axygen	MCT-150-C
2mL 마이크로 원심분리기 튜브	Axygen	MCT-200-A
디지털 드라이 블록 히터	VWR	13259-052	마이크로 원심분리기 튜브 가난용 정액 채취 전
미니 원심분리기	Corning	LSE 6765
35mm 배양 접시	VWR	10861-656
15mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	VWR	10025-686
수조	정밀	TSGP05
가열 스테이지 실체 현미경	Leica Microsystems	MZ10F	조직을 따뜻하게 유지하기 전에 조직을 따뜻하게 유지하기 위해 정액 채취
명시야 현미경	Leica Microsystems	DMi8	옵션. 정자 운동성의 비디오 이미징을 위해
Camera	Leica Microsystems	DMC2900	옵션입니다. 정자 운동성의 비디오 이미징용
유리 슬라이드	Fisher	12-552-3	옵션. 정자 운동성의 비디오 이미징용
Coverslip	VWR	48393-059	옵션. 정자 운동성의 비디오 이미징을 위해
표백제를			dH2O에서 10% 농도로 희석

사용하지 마십시오 보충제: , ,