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방법 논문

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

11.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56675

⸱

2017년 11월 17일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, James Madison University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

두뇌에 있는 유전자의 세포 자치 기능 손실을 유도 하 여 공부 될 수 있다 또는 셀의 스파스 인구에 있는 기능을 얻을. 여기, Cre recombinase 함수 비보의 손실에 floxed 유전자와 대뇌 피 질의 뉴런 개발의 부족 인구에 제공 electroporation utero에서 설명 합니다.

초록

유전자의 세포 자율 신경 기능 손실이 발생 하 여 계시 될 수 있다 또는 뉴런의 작고 부족 인구에 있는 유전자의 기능을 얻을. 이렇게 하려면 손실 또는 이득 유전자의 기능의 신경 유전자 교란된 조직에 의해 포위 된다 모자이크를 생성 해야 합니다. 여기, 우리가 결합 Cre lox 재결합 시스템 electroporation utero에 모자이크 뇌 조직 신경에 있는 유전자의 세포 자치 기능을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다을 생성 하기 위하여. DNA 구조 (저장소를 통해 사용 가능), 형광 라벨 및 Cre recombinase 코딩 유전자에 utero 를 사용 하 여 마우스 태아의 두뇌에 loxP 사이트와 측면을 포함 하는 대뇌 피 질의 뉴런 개발에 도입 electroporation입니다. 또한, 우리는 utero에 electroporation 메서드에 생존 및 재현성을 증가 하는 다양 한 적응을 설명 합니다. 이 방법은 또한 titer Cre 중재 재결합 뉴런의 스파스 또는 조밀한 인구에 대 한 설정 포함. (필요 하지 않습니다 하지만)을 적용할 수 있습니다 레이블이 뇌 조직의 조직학 준비 immunohistochemistry. 사용 하는 구문을 붙일 뉴런 수행 Cre recombinase에 대 한 유전자 표시 보장 합니다. 조직학 준비 수지상 및 axonal 아 버 및 모 수석 등뼈의 confocal 영상 통해 뉴런의 형태소 분석 허용. 있으므로 손실 또는 함수의 이득 스파스 모자이크 조직에서, 세포 자치 필요성의 연구와 유전자 제품에서 vivo에서의 자족이이 방법을 허용 합니다.

서론

유전 모자이크를 생성 하는 것은 관심사의 유전자의 기능을 이해 하기 위한 고전적인 실험 패러다임 이다. 프로그램 유전자 세포 표현 형에 필요한 지 확인 하려면 가장 간단한 방법은 유기 체 (예 마네)에 걸쳐 유전자의 기능의 손실을 일으키는 것입니다. 그러나, 확인 하려면 유전자 특정 셀 종류에 특히 필요한 경우, 유기 체 전체 유전자의 녹아웃이 아니다 유효한 접근. 대신, 메서드는 필요한 wildtype (즉 유전자 교란) 조직으로 둘러싸여 동안 주어진된 셀에 유전자의 기능의 손실을 발생 합니다는-즉, 모자이크 조직 만들기. 만약 돌연변이 세포 돌연변이 표현 형을 표시 하지만 주변 wildtype 세포 안, 세포 자치 방법으로 유전자 기능. 돌연변이 세포 wildtype 조직에 의해 포위 된다 모자이크 조직의 분석 유전자, 특히 신경 및 명과 조직의 광대 한 상호 네트워크를 형성 하는 뇌의 세포 자치 기능을 이해 하는 데 이상적입니다.

여러 형태의 모자이크 뇌 조직의 강력한 모델 조사 유전자의 세포 자치 기능을 제공 합니다. 연구 신경 이식1, 여성 X 연결 mosaicism2,3,4에 집중 하 고 내 생 신체적인 mosaicism5,6 그린 모자이크에 따라 그들의 결론 뇌 조직입니다. 조건부 삭제 Cre lox 재결합 시스템을 통해 유전자의 유전자 변형 마우스 라인의 좋은 가용성을 최대한 활용 하는 방법입니다. 이 방법에서는, 2 개의 loxP 사이트 loxP 사이트 같은 방향으로 ("floxed")에서 두 얼굴을 있는 그것을 떠나 (예:는 exon), 유전자의 필요한 시퀀스의 양쪽에 소개 된다. Cre recombinase loxP 사이트7사이 시퀀스 excises. Cre 중재 재결합 Cre recombinase 셀 ("Cre 기자 선")의 하위 집합에서 형광 표식 함께 표현 하는 또 다른 마우스 라인을 건너 floxed 마우스에 의해 얻을 수 있습니다. 이 다양 한 방법으로 흥분 성의 뉴런 등 이다8셀의 하위 집합에서 유전자의 기능을 밝히기 위해 입증 되었습니다. Cre 기자 라인 Cre 중재 재결합 마약을 유도할 수 있는 (단일 신경 라벨 유도할 수 있는 Cre 중재 녹아웃 또는 매끄러운) 될 수 있도록 있다T2 를 표현할 수 있습니다9. 다른 전략 이라는 이중 표식 (MADM)10,11모자이크 분석, Cre 중재 interchromosomal 재결합 homozygous 돌연변이 heterozygous 조직 함께 만들 수 있습니다. 이러한 방식에서 쥐의 새로운 라인 각 후보 유전자 또는 세포 하위 테스트에 대 한 각 시간 제작 될 필요가 있다. 또는, Cre recombinase 소개 될 수 있다 postnatally 또는 바이러스 성 벡터 (예를들면 adeno 관련 바이러스13 또는 lentiviruses14 셀룰러 하위 형식 관련 운반 iontophoresis12 통해 발기인)입니다. 이 전략 강력 하 고 산 후 라벨을 만듭니다. 대뇌 피 질 뉴런을 띄엄띄엄 prenatally 개발 대상으로 이상적인 전략의 형광 표시와 함께 Cre recombinase electroporation utero에 입니다.

Cre lox 재결합 electroporation utero에서 생성을 통해 결합 뿐만 아니라 vivo에서조직 모자이크, 다른 게시 프로토콜15,,16에서 프로시저에 여러 각 색 한 소개 17,,1819,,2021. 우리는 사육 타임-임신 여성에서 성공을 개선 하는 정보를 제공 합니다. 우리 또한 우리의 두 전략 스파스 하 고 밝은 대뇌 피 질의 조직에서 뉴런의 라벨을 소개 하는 개요: 하나의 전략 Cre recombinase 및 형광 마커22단일 구문을 코딩의 수준을 적정 하는 것입니다. 또 다른 전략 마음23,24에 이러한 매개 변수를 특별히 설계 된 "초신성" 시스템을 사용 하는 것입니다. 또한, 생산 하는 일관 된 microinjection 펫 및 단순화에 utero electroporation 수술에 개선을 제공 합니다. 마지막으로, 우리는 더 얼룩 또는 immunohistochemistry 없이 모 수석 등뼈와 수지상 및 axonal 아 버의 분석을 허용 하는 간단한 조직학 준비에서 중요 한 단계를 개요.

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프로토콜

여기에 설명 된 방법 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC), 제임스 매디슨 대학에 의해 승인 되며 모든 관련 규제 기관 지침 준수에 따라.

1. 마우스 설정

  1. 젊은 집 (> P60) 남성과 여성의 homozygous floxed 마우스 개종 쌍25를 설정 하는 함께.
    참고: 좋은 부정적인 제어는 Cre에서 recombinase 식 모자이크26발생 하지 것입니다 wildtype 마우스의 추가 종족 쌍을 설정 하는.
  2. 여성 출산을 남성으로 그녀의 첫번째 담가 수 있습니다. 쓰레기의 생존을 증가 하는 여자와 남자를 유지 합니다. 이유 후 쓰레기, 예를 들어 출생 후 하루 (P) 21, 여성 및 남성을 구분합니다.
  3. Murine 사육
    1. 암컷과 수 컷25사이 타임 짝짓기를 설정 합니다. 시각적 신호를 사용 하 여 여성27의 발 정기 주기를 결정 하 고25짝짓기 후 아침 질 플러그에 대 한 확인.
    2. 플러그인을 발견 하는 경우, 하 고 여성을 무게 합니다. 배아 날 (E) 0.5 일 수입니다.
    3. 그녀는 임신을 확인 하는 여성 3-5 일 마다 무게를 계속 합니다. 임신 여성에서에서 갖게 됩니다 10-20% 증가 몸 무게 개념 (E0) 후 7-10 일.
      참고:이 단계는 이전 하 고 육안 검사25보다 더 확실 하 게 임신을 확인합니다.
    4. 여성 임신 인 경우 반복 1.3.1-1.3.3 단계.
  4. 일단 임신을 확인 electroporation utero에서 날짜를 선택 합니다. 대상 레이어 II/III 대뇌 피 질의 각 추 모양 신경 창시자, electroporation E15.5에서 수행 합니다.

2. DNA 설정

  1. 단일 DNA 생성 Cre recombinase 뿐만 아니라 녹색 형광 단백질 (GFP),2829등 형광 표식에 대 한 해당 코드를 선택 하십시오. 또는 이전 간행물23,24에서 자세히 설명 "초신성" 시스템을 사용 합니다. 재료의 목록 생성 예를 참조 하십시오.
  2. 증폭 단계 2.1 표준 미생물 기술30을 사용 하 여 대장균에서에서 DNA construct(s).
  3. 제조업체의 지침에 따라도 무료 플라스 미드 정화 키트 DNA 구조를 정화. 물도 없는 구문 elute
    참고: 표준 정화 키트도 없는 정화 키트 선택이 중요 합니다.
  4. 원하는 라벨 밀도26에 따라 1-3 mg/mL를 DNA eluate 집중.
    참고:는 titer 설립 새로운 DNA 구조를 작업할 때 서로 다른 길이 및 발기인을 항상 필요 합니다. 여러 다른 농도 및 식 평가 금액에서 개념 주입을 고려 하십시오. 예를 들어, 1 µ L 또는 2.0 mg/mL GFP의 1.5 µ L의 주입 Cre는 스파스 (1 µ L) 또는 조밀한 (1.5 µ L) 수 레이어 II/III 시각 대뇌 피 질의 피라미드 뉴런26의 라벨.
  5. 추가 0.4 %trypan 버퍼링 하는 인산 염 (PBS, 137 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2HPO4, 1.8 m m KH2포4 H2O, pH 7.4 HCl와 조정) x 1에 파란색 1:10 집중 DNA 솔루션.
  6. 10 x PBS 1시 10분 집중된 DNA 솔루션에 추가 합니다.
  7. 4 ° c.에 집중된 DNA 솔루션 저장 솔루션은 무기한으로 저장할 수 있습니다.

3. 피 펫 설정

  1. 매우 긴과 피 펫을 당겨 유리 모 세관 풀러를 사용 하 여 (10-15 m m) 테이퍼 및 아주 좋은 팁, 미 발달 줄기 세포 주입 또는 핵 이식31펫의 전형.
    참고:는 펫을 오염에서 파편을 방지 하기 위해 수술의 2 일 안에 만들 수 그들은.
    1. 제조업체의 지침에 따라 램프 테스트를 수행 하 여 유리 모 세관 끌어당기는 보정. 결과 열 값 당기는 프로그램을 다음 매개 변수를 사용 하 여 프로토콜 사용: 열 = (램프 테스트 값 + 15), 당겨 30, 벨 = = 120, 시간 = 100, 압력 = 200. 유리 모 세관을 삽입, 끌어당기는 사람에 클램프를 고정 하 고 유리 모 세관에 테이퍼를 만드는 프로그램된 당기 프로토콜을 활성화.
    2. 테이퍼 길이 사이 인지 확인31복합 조명 현미경 (예: 10 X 목표) 사용 하 여 10-15 m m.
  2. 20-25 µ m 직경을 거친 가장자리가 팁을 피펫으로 다시 휴식.
    1. 단일-따위를 열심히 작업 지우기 센터 (재료의 목록 참조) 50 mL에 비 커와 스트레치 닦아 한 손으로 긴장 된. 다른 손으로 누른 테이퍼31에서 깨끗 한 휴식을 일으키는 지우기의 센터를 통해 수직으로 완전히 피 펫 (테이퍼 면이 아래로)을 밀어.
      참고: 완전히 닦아 통해 피 펫을 추진 20-25 µ m 직경 팁 시간의 약 70%를 생산할 예정 이다.
    2. 복합 조명 현미경 (예: 20 x 목표) 확인 합니다.
      주의: 눈 보호 유리를 깨고 하는 동안 사용 합니다.
  3. 부분적으로 채워진된 piptte에는 피 펫의 0.4 %trypan 블루 1 x PBS에서 1 µ L 발음으로 교정 후 뾰족한 알코올 내성 마커를 사용 하 여 피 펫에서 1 µ L의 높이에 따라 1 µ L 표시와 피 펫을 졸업. 보정된 피 펫을 사용 하 여 삭제 하기 전에 다른 펫을 졸업. 펫 피 펫 홀더에 먼지와 다른 입자에서 무료로 유지.

4. Electroporation Utero에서

  1. Graefe 집게, 아이리스가 위, 하트 모기 겸 자, 비-짠 거 즈 스폰지, 반지 밀고 집게와 접시 스테인리스 쟁반에 놓고 알루미늄 호 일로 포장 합니다. 압력솥에 트레이 1 L 0.9% 식 염 수 (0.9 %wt / 집 물에서 NaCl)를 배치 합니다. 121 ° C에 고압과 40 분에 대 한 3.5 kPa 압력솥에서 제거 하 고 소독된 외과 영역에 배치.
    참고: 그것은 수술 하는 동안 멸 균 상태를 유지 하기 위해 중요 한입니다.
  2. 수술 전에 38 ° C 이상 2 h 작은 물 욕조에 압력가 1 L 염 병을 따뜻한.
  3. 족집게 형 전극 및 발 페달 발전기를 연결 (재료의 목록 참조). 제조업체의 지침에 따라 설정 때 50 V (950 ms 간격)와 5 50 ms 펄스를 전달 하기 위해 발전기 발 페달에 의해 트리거됩니다. 족집게 형 전극 소독 하 고 소독된 외과 영역에 놓습니다.
  4. 이전에 게시32로 마 취 코 콘 만들지만 니트 릴 또는 라텍스 장갑 손가락 끝을 사용 하 여 코 콘 오프닝에 안전 하 게 맞는 다이어 프 램을 형성. 마우스의 주 둥이에 맞게 충분히 큰 격 막에 구멍을 절단.
  5. 깊이 순수 산소 1 L/min에서 흐르는 isoflurane (2-4%)로 가득 유도 실에서 E15.5에서 임신 쥐를 anesthetize. ~ 1 분 후 테스트 righting 반사 (부드럽게 유도 챔버 기울기와 마우스 자체 오른쪽 하지 않습니다 확인). 나중에 수술 하는 동안 관리 하는 진통의 복용량을 결정 하는 마우스의 무게.
  6. 외과 영역에 마우스를 전송 하 고 관리 외과 평면에서 마우스를 유지 하기 위해 코 통해 1 L/min에서 흐르는 순수 산소 흡입된 isoflurane (1-2%). 집게를 사용 하 여 페달 반사 테스트 (부드럽게 발을 꼬 집 고 마우스는 반사를 반환 하지 않습니다) anesthetization 확인 하. 호흡 속도 노력, 깊은, 일반 호흡을 찾고 (70 ~ 100 호흡/분), 그리고 점 막 색상에 핑크와 촉촉한.
  7. 절차 동안 건조에 대 한 보호에 대 한 그들을 완전히 커버 눈에 충분 한 수의 안과 연 고를 적용 합니다.
  8. 밀폐 된 주머니의 금속 활성 디스크 가득 플렉스 supersaturated 소금 솔루션 (재료의 목록 참조), 소금의 발열 결정 화를 활성화. 2 단일-따위를 열심히 작업 물티슈는 주머니 위에 누워 하 고 체온을 유지 하기 위해 주머니에 마우스를 놓습니다.
  9. (약 20-40 s), 복 부 털에 녹이 고 때까지 면봉과 복 부 지역에 depilatory 크림 마사지 후 복 부 털을 닦아. 70% 에탄올과 목화 면봉을 어떤 잔여 잔류물 및 탈모 크림을 신중 하 게 청소. 복 부 지역에 fenestrated 메 마른 외과 용 드 레이프 놓으십시오.
  10. 무 균 기술을 사용 하 여, 내 피부 위쪽으로 복 부에서 Graefe 집게, 고 ~ 2 cm 복 부 정중 선 절 개 기본 근육 절단 하지 보장 하는 아이리스가 위를 사용 하 여 피부에.
    참고: Graefe 집게와 아이리스가 위 절 개를 만들기 위해 수락 가능한 대안 출판 이전17, 메스를 사용 하는.
  11. 교육을 찾아 곧바로 복직의 중간을 시각화 하는 알바. Graefe 집게와 위쪽으로에서 복 부 근육을 당겨 하 고 복 부 구멍을 노출 하는 아이리스가 위로 다른 ~ 2 cm 중간 절 개 거기 (자 궁은 반투명 하 고 배아 아래 표시 됩니다). 자 궁과 장의 조직 밑은 잘라 하지 확인 하십시오. 꺼내 고 편안 하 게 자 궁을 절 개 만큼만 큰 (일반적으로 ~ 2 cm)를 확인 합니다.
    참고: Graefe 집게와 아이리스가 위 절 개를 만들기 위해 수락 가능한 대안 출판 이전17, 메스를 사용 하는.
  12. 살 균 10 µ L micropipette 팁을 사용 하 여, 진통에 대 한 복 부 구멍으로 4 mg/kg (살 균 0.9% 식 염 수에 용 해) carprofen 분배.
  13. 곧바로 복직 절 개의 왼쪽된 가장자리에 대 한 하트 모기 겸 자 클램프. 절 개, 절 개의 왼쪽된 측면을 열어 왼쪽에 전복된 페 트리 접시에는 집게를 휴식. 다른 하트 모기 겸 자 곧바로 복직 절 개의 오른쪽 가장자리에 클램프 하 고 절 개, 절 개의 오른쪽을 열어 오른쪽 전복된 페 트리 접시에는 집게를 휴식. 절 개 주변 거 즈 스폰지를 놓습니다.
  14. (첨부 제한 나사) 없이 링 집게를 사용 하 여, 분쇄 또는 어떤 조직 부상 없이 어떤 두 개의 인접 배아 사이 자 궁에 당겨. 거 즈 위에 스폰지 그들을 누워 절 개를 통해 모든 태아를 꺼내 시작. 복 부 구멍에서 마지막 태아를 꺼내 때 난소 나 자 궁 경부에 내려고 하지 있는지 확인 합니다. 일단 노출, 그것은 자 궁을 따뜻한 식 염 수로 습 한 유지 하는 중요 한입니다. 자 궁은 배아를 5와 8 사이 일반적으로 포함 되어 있습니다.
    참고: 염 분17에 페니실린과 스 추가 가능 하다.
  15. 흡 인기 튜브 어셈블리에 보정된 피 펫을 연결 (재료의 목록 참조), 각 배아의 측면 뇌 실에 자 궁 벽을 통해 2 단계에서 준비 된 DNA 솔루션의 정확 하 게 1 µ L를 주사. 측면 심 두 패치 (패치 둘러싼 telencephalon의 조직 보다는) 태아의 등 쪽 telencephalon에으로 나타납니다. 측면 심 공개를 주입 하는 동안 자 궁 벽에 부드럽게 밀어 수 배아 배아를 조작 하 microinjection 및 electroporation 엄지와 집게를 사용 합니다. Trypan 블루 작성 측면 뇌 실 관찰 하 여 성공적인 주입을 확인 합니다.
  16. 놓고 족집게 형 전극 (재료의 목록 참조)의 음극, 자 궁에 직접 시각 피 질을 대상으로 중간과 꼬리 피 질 (뇌의 다른 영역을 대상으로 필요 합니다 다른 전극 배치)16, 26. 자 궁, 그냥 열 등 하 고 태아의 머리 앞쪽에 양극을 놓습니다.
  17. 양극과 음극의 적절 한 위치에서 태아를 둘러싼 자 궁을 만지고는 확인 합니다. 발 페달으로 전극에 걸쳐 50 V (950 ms 간격)와 5 50 ms 펄스의 납품을 트리거하십시오.
    참고: 삽입, 부정적인-청구 DNA는 음극 쪽으로 이동 하 고 음극에 가까운 심 실 영역 셀에 통합 됩니다.
  18. 그것은 발견 동일한 방향에서 복 부 구멍에 자 궁을 반환 합니다. 식 염 수를 사용 하 여 그들의 위치는 자 궁에서 태아를 치환 하지 않도록 주의 복용을 수동으로 하 고 매우 부드럽게, 지도 하는 동안 자 궁에 기름칠을.
  19. 흡수 되기 쉬운 봉합 (재료의 목록 참조)와 복 부 근육을 닫습니다 외과 의사 매듭으로 끝을 묶는 간단한 중단 된 스티치를 사용 하 여. 끝 매듭에 너무 가까이 하지 클립 또는 매듭 내의 될 것입니다.
    참고: 그것은 중요 한 복 부 근육 상처의 가장자리는 완전히 폐쇄 되도록 폐쇄, 봉합을 하지만 근육의 창백 없이. 그들은 내의 수 없습니다 그래서 매듭 꽉 해야 합니다.
  20. 피부 층을 흡수 되기 쉬운 봉합 (간단한 중단된 스티치, 외과 의사 매듭, 단계 4.19로)를 닫습니다. 상처를 봉인 하기 위해 조직 접착제의 작은 금액을 적용 합니다. 잠금과 방지 하기 위해 노트에 조직 접착제를 적용 합니다. micropipette에 의해 발음 될 수 있는 상처를 둘러싼 모든 조직 접착제를 제거 하는 micropipette를 사용 합니다.
  21. 낮출 isoflurane 수준을 0.5-1.5%. 조직 접착제는 일단 건조 (접착제를 장갑으로 테스트), isoflurane에서 제거 하 고 따뜻한 장에 혼자 복구 하 여 허용. 0.03 mg/kg는 26 G, ½ "1 mL 주사기를 사용 하 여 intraperitoneally에서 buprenorphine 관리 바늘.
  22. 계속 마우스 완전히 복구 될 때까지 마우스를 모니터 하 고 정상적으로 작동 (즉, 손질, 케이지를 탐험, 먹고, 또는 마시는). 복구 되 면 다시 장에 남자와 여성 장소.
    참고: 모든 단계를 따를 경우 마우스 일반적으로 2 분 이내 의식 회복 되며 즉시 불편의 흔적을 보여주는 감 금 소에 대 한 이동 시작.
  23. 마우스의 불편 함 (예: hunched 자세, 포 르 피 린의 분 비)33전시, 물 공급에 있는 0.1 mg/mL에서 carprofen를 관리 합니다. 불편의 몇 가지 징후는 존재, 또는 불편 carprofen 관리에도 불구 하 고 4 시간 이상 지속 되 면, 즉시 케 타 민 (240 mg/kg)-xylazine (48 mg/kg)-의 복 치명적인 주사를 투여 하 여 마우스를 안락사 acepromazine (1.85 mg/kg) 칵테일으로는 26 G, ½"1 mL 주사기를 사용 하 여 바늘, 그리고 안락사33의 승인 보조 양식을 따르십시오.
  24. 출생 후 electroporated 배아의 생존을 증가, 조용한 룸, 소음 및 진동에서 무료로 개최에 감 금 소를 유지 합니다. 플라스틱 igloos, 중첩 재료와 해바라기 씨 (재료의 목록 참조)와 같은 보조 환경 풍부. 이동 하거나 특히 출산 후 처음 3 일 동안 감 금 소, 방해 하지 않습니다.

5. 형광 현미경 검사 법 조직학 준비

참고:이 조직학 프로토콜 조직 했다 electroporated utero출생 후 하루 (P) 13 보다 더 오래 된 동물에서 준비 하 고 최적화 되어 있습니다. 젊은 산 후 동물 (P0-P13)에서 조직 준비, 그것 것이 좋습니다 모든 단계 (를 포함 하 여 transcardial 관류), 따라 agar 섹션 (단계 5.9)을 준비 하 고 이전에 두뇌를 포함 해야 하지만. 조직 준비도 있습니다 electroporation 후 1-2 일 이내에 배아에서 방법을 사용 하 여 위에서 설명한18,20.

  1. Paraformaldehyde (PFA) 솔루션을 준비 합니다.
    참고: 실험의 1 일 안에 신선한 PFA, 준비 하는 것이 필수적 이다.
    주의: Paraformaldehyde 독성 이며 적절 한 개인 보호 장비와 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.
    1. 4%의 50 mL를 만들려고 PFA, 60 ° c 열 40 mL 물 유리 막대 또는 교 반 바 교 반 하면서 2 세대 PFA를 추가 합니다. PFA 디졸브 때까지 10 M NaOH 마다 2 분의 10 µ L를 추가 합니다.
    2. 10 x PBS의 5 mL을 추가 하 고 솔루션을 물 50 mL의 최종 볼륨을가지고.
    3. 냉각 및 4 ° c.에 저장 10 M HCl 허용 솔루션으로 필요에 따라 pH 7.4에 조정 솔루션 50 mL 데 려 오, 후
  2. 마우스를 안락사 케 타 민 (240 mg/kg)-xylazine (48 mg/kg)-의 복 주사와 acepromazine (1.85 mg/kg) 칵테일 바늘을 26 G, ½ "1 mL 주사기를 사용 하 여. Transcardially perfuse 10 또는 20 mL 얼음 1 x PBS, 25 또는 40 mL 갓 만든, 얼음 4% PFA17다음. 젊은 산 후 (P0-P13) 마우스 및 더 오래 된 쥐에 대 한 높은 볼륨에 대 한 낮은 볼륨을 사용 하 여 (P14 이상).
  3. 관류, 직후 큰가 위로 후 두 골과 C1 척추 사이 마우스 시체 목을 벨 고 벗 겨와 아이리스가 위를 사용 하 여 두개골을 둘러싼 피부의 대부분, 특히 피부 주변 정면, 정수 리, 및 후 두 뼈입니다. 두개골과 뇌 그대로 유지.
  4. 10 mL 4%에서 두개골과 뇌를 배치 후 수정 조직에 4 ° C에서 24 h에 대 한 50 mL 원뿔 튜브에 PFA. 1% 솔루션을 희석을 원뿔 튜브에 30 mL 1 x PBS 추가 PFA 4 ° c.에 스토리지에 대 한
    참고: 각 두개골과 뇌에 대 한 별도 원뿔 튜브를 사용 하 여 고정 후. 뇌를 품 어 하지 않습니다 1%에서 2 주, 또는 형광 보다 더 오랫동안 PFA 퇴색 하기 시작 합니다.
  5. 뇌와 두개골과 평평한 표면에 단일-플라이 작업 잎사귀 1 x PBS를 적신. (재료의 목록 참조) 핀셋의 쌍을 사용 하 여 나머지 피부 또는 두개골을 둘러싼 막 제거.
  6. 핀셋을 사용 하 여, 먼저 후 두 뼈 다음 조심 스럽게 제거 정수 리 뼈, 뇌의 표면에서 족집게를 밖으로 멀리 이동 하는 방법. 조심 스럽게 제거 피 질에 손상을 방지 하기 위해 어떤 meninges.
  7. 두개골 어떤 두개골 신경 절단을 따라 뇌에서 핀셋의 뒷면을 쐐기와 두뇌를 제거 합니다.
  8. 젊은 산 후 (P0-P13) 두뇌에 대 한
    1. 80 ° c 25 mL 1 x PBS를가 열 하 여 4 %agar 25 mL를 만들기 저 고 1 g 유리 막대 또는 교 반 막대 한 천 분해).
    2. 계속 저 어 하는 동안 35 ° C에 멋진 솔루션입니다. (예: 50 mL 원뿔 튜브의 캡), 작은 용기에 뇌를 배치 하 고 두뇌에 붓는 한 솔루션. Agar를 확정할 수 있습니다.
  9. 두뇌, 약 0.5 m m bregma rostral 통해 단일에 지 면도날을 사용 하 여 수동으로 코로나 컷을 확인 합니다. 게 다른 코로나 컷 뇌 약 0.5 m m를 통해 꼬리 시각 피 질. Cyanoacrylate 접착제 두뇌의 rostral 끝으로 동일한 직경의 풀 진동 톰 견본 디스크의 중앙에 놓습니다. 두뇌의 rostral 끝 접착제, 조직의 전체 rostral 표면 접착제 견본 디스크에 바인딩됩니다 보장의 풀 위에 놓습니다.
  10. 톰 진동에 버퍼 트레이 탑재 하 고 내장 클램핑 레버와 보안. 나이프 홀더에 블레이드를 삽입 하 고 톰 내장 클램핑 스크류 진동에 나이프 홀더 탑재. 버퍼 트레이 내장 클램핑 장치를 사용 하 여에 두뇌와 견본 디스크를 보호 합니다. 속도 설정을 5.70 (= 0.285 mm/s), 및 주파수 설정을 5.33 (53.3 Hz)를 설정 합니다.
  11. 1 x PBS를 가진 두뇌의 수준 이상의 챔버를 PBS에 블레이드를 낮은. 조직을 통해 100 µ m 코로나 섹션을 복용 시작 합니다.
  12. 경우 추가 처리 등 ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵 얼룩 immunohistochemistry 필요로 하지.
    1. 잘 끝된 페인트 브러시를 사용 하 여 각 슬라이드에 4-6 섹션 피팅 현미경 슬라이드에 진동 톰에서 직접 섹션을 전송.
    2. 하 뇌 조각 이상 슬라이드에 드리프트 그런 정밀한 끝된 붓으로 멀리 솔루션 wicking 여 건조 섹션 수 없습니다.
    3. 다음, 한 방울 mountant 장소 (재료의 목록 참조) 슬라이드에 각 섹션에.
    4. 부드럽게 24 x 50 m m coverslip 위에 누워, 1) 기포 보장 양식 섹션 2) 섹션에서 이동 하지 않습니다, 그리고 3) mountant 완전히 슬라이드 coverslip 사이의 영역을 커버. 24-48 시간 이상 치료 mountant 허용.
  13. 대뇌 피 질의 하기의 조직학 검사 DAPI와 핵 얼룩
    1. 좋은 끝된 페인트 브러시를 사용 하 여 포함 10 µ g/mL DAPI 재고 솔루션 (20 mg/mL 물에 DAPI)에서 1 x PBS에 희석 (재료의 목록 참조) 솔루션으로 각 섹션을 전송.
    2. 실 온에서 5 분 동안 DAPI 솔루션에서 incubate 다음 DAPI 솔루션에서 1 x PBS 섹션을 전송 하 여 실 온에서 5 분에 대 한 1 x PBS에서 품 어 잘 밀고 페인트 브러시를 사용 합니다. 전송 섹션 2 번 이상 5 분에 대 한 신선한 1 x PBS. 다음, 수행 단계 5.11.2-5.11.4, 정밀한 끝된 붓, 전송 사용 하 여 현미경 슬라이드에 섹션 및 5.13 단계로 진행.
  14. 완전히 녹을 때까지 낮은 열 설정에 뜨거운 접시에 Valap (동등한 부품 바 셀 린, 라 놀 린, 및 파라핀)를 포함 하는 유리 페 트리 접시를 열. 인감 녹은 Valap에 솔 질 하 여 슬라이드의 가장자리를 노출.
  15. 조직에서 형광 검사, 또는 사용 하 여 가벼운 현미경 confocal 현미경 (재료의 목록 참조) 필터는 fluorophore를 보기 위한 적절 한 설정 (예: DAPI: 여기 325-375 nm, 방출 435-485 nm; GFP: 여기 450-490 nm, 방출 500-550 nm)17. 낮은-공초점 이미지를 촬영 수 있습니다 (4 X, 숫자 조리개 나 = 0.20), 중간-(20 X, 나 = 0.75), 및 고 전력 (60 X, 나 = 1.40) 목표.

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결과

단일 GFP를 구성 합니다. Cre는 E15.5에서 electroporated 이었고 P14에서 시각 (재료의 목록 참조). 구성의 농도 주입의 볼륨에 따라 스파스 또는 밀도 결과22,26얻어질 수 있다. 예를 들어, 2 mg/mL GFP의 1 µ L의 주입. 레이블이 지정 된 셀, 일부는 밝은 (그림 1A), 그리고에서 지역화 레이어 II/III (그림 1B) 수의 스파스 유통 Cre 결과. 조직 때문에 두께가 100 µ m, 수지상 아 버의 대부분 (그림 1C) 유지 됩니다. 모 수석 등뼈 높은 배율 (60 X;에서 관찰 될 수 있다 그림 1D)입니다....

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토론

여기, electroporation utero에 모자이크 뇌 조직의 생성을 floxed 마우스에 Cre recombinase와의 조합을 소개 합니다. 이 방법의 장점은 새로운 마우스 선 다른 셀룰러 하위는 타겟이 될 때마다 생성 될 필요는 없습니다: electroporation utero에서 흥분 성의 뉴런, 신경 억제, 또는 시간에 따라 명과 대상으로 사용할 수 있습니다 그리고 electroporation15,,1617,18,19,20,21,

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공개 사항

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

감사의 글

저자는 제임스 매디슨 대학 생물학 부와 제임스 매디슨 대학교 빛 현미경 이미징 시설의 관대 한 지원을 감사합니다. 닥터 마크 L. 가브리엘 젊은 출생 후 조직 준비, 에 관한 유용한 조언 및 박사 저스틴 W. 브라운 코리 L. Cleland 수술 재료와 공간의 관대 한 조정에 대 한. 이 연구 4-VA, 전진 하는 연방의 버지니아 (G.S.V.)에 대 한 공동 제휴 및에 의해 버지니아 아카데미의 과학 작은 프로젝트 연구 부여 (G.S.V.) 공동 연구 교부 금에 의해 부분적으로 투자 되었다. 지원이 아낌없이 제공 되었습니다 베티 조 사랑 버틀러 ' 58 기부금으로 학부 연구 장학금 (K.M.B.), 파렐 여름 연구 장학금 (K.M.B.)을, (에 K.M.B.), 제임스 매디슨 대학 두 번째 세기 장학금에 대 한 한 제임스 매디슨 대학 센테니얼 장학금 (C.J.H.), 제임스 매디슨 대학 루시 로빈슨 검색 ' 30 기념 장학금 (Z.L.H.)을 및 과학 및 수학 교수 지원 그랜트 (G.S.V.)에 제임스 매디슨 대학 대학.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C57BL/6J 마우스The Jackson Laboratory#000664"1. 마우스 설정"(1.1단계, "야생형 마우스")GFP
. Cre empty vectorAddGene#20781"2. DNA 설정"(2.1단계 "Cre 재조합효소 및 형광 마커를 암호화하는 단일 DNA 구성물"). GFP입니다. Cre empty vector는 Tyler Jacks의 선물이었습니다.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#69138"2. DNA 설정"(2.1단계 "초신성" 시스템") 및 http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)는 이와사토 타쿠지의 선물입니다.
pK031.TRE-Cre (Supernova)AddGene#69136"2. DNA 설정"(2.1단계 "초신성" 시스템") 및 http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova)는 이와사토 타쿠지의 선물입니다.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#85006"2. DNA 설정"(2.1단계 "초신성" 시스템") 및 http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)는 이와사토 타쿠지의 선물입니다.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen#12362"2. DNA 셋업"(단계 2.3 "내독소가 없는 플라스미드 정제 키트")
트리판 블루 파우더, 바이오시약 등급시그마T6146-5G"2. DNA 셋업"(2.5단계 "트리판 블루")
염화나트륨, ACS, 2.5kgVWRBDH9286-2.5KG"2. DNA 설정"(단계 2.5 "NaCl")
염화칼륨, ACS, 500gVWR#97061-566"2. DNA 설정"(2.5단계 "KCl")
인산나트륨이염기성, ReagentPlus, 100g시그마-알드리치S0876-100G"2. DNA 설정"(단계 2.5 "Na2HPO4")
산칼륨 모노염기성, ReagentPlus, 100gSigma-AldrichP5379-100G"2. DNA 셋업"(단계 2.5 "KH2PO4")
염산, ACS 시약, 500 mLFisher ScientificA144-500참조 "2. DNA 설정"(단계 2.5 "HCl")
P-97 마이크로피펫 풀러셔터 기기P-97"3. 피펫 설정"(3.1단계 "유리 모세관 풀러")
3.0mm 너비의 트로프 필라멘트셔터 기기FT330B"3. 피펫 설정"(3.1단계 "유리 모세관 풀러")
얇은 벽 유리 모세관, 4", 1 / 0.75 OD/IDWorld Precision InstrumentsTW100-4"3. 피펫 설정"(3.1.1단계 "유리 모세관")
단일 플라이 소프트 테크 물티슈, 4.5"PhoenixLW-8148"참조 3. 피펫 설정"(3.2.1단계 "단일 플라이 작업 지우기"); 다른 단일 플라이 와이프(예: Kimwipes)를 사용할 수 있습니다.
Graefe 집게, 7cm, 직선, 0.7mm 1x2 치아World Precision Instruments#14140"4. 자궁 전기천공법"(단계 4.1 "Graefe paps")
홍채 가위, 11.5cm, 스트레이트, 12팩World Precision Instruments#503708-12"4. 자궁 전기천공법" (step 4.1 "홍채 가위")
Hartman 모기집게, 9 cm, 스트레이트, 12팩World Precision Instruments#503728-12"4. 자궁 내 electroporation" (단계 4.1 "Hartman 모기집게")
범용 부직포 스폰지, 2" x 2", 4-plyMedrepexpress#2204-c"4. 자궁 전기천공법"(단계 4.1 "부직포 거즈 스폰지")
링 팁 집게, 10cm, 직선, 2.2mm IDWorld Precision Instruments#503203"4. 자궁 electroporation" (단계 4.1 "ring-tipped forceps")
Pyrex 페트리 접시 완료, O.D. × H 100mm &시간; 20mm시그마-알드리치CLS3160102-12EA"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.1 "페트리 접시")
평판 기구 트레이, 스테인리스강, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8"AmazonB007SHGAHA"4. 자궁 전기천공법"(단계 4.1 "스테인리스 스틸 트레이")
백금 핀셋, 5mmBTX#45-0489"4. 자궁 전기천공법"(단계 4.3 및 4.16 "핀셋 형 전극")
ECM 830 풋 페달BTX# 45-0211"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.3 및 4.17 "풋 페달")
ECM 830 발전기BTX#45-0052"4. 자궁 내 전기천공법" (단계 4.3 "발전기")
단일 동물 이소플루란 마취 시스템 소형 유도 상자Harvard Apparatus#72-6468참조 "4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.4 및 4.6 "노즈 콘", 단계 4.4 "유도 챔버")
안과 연고Hanna Pharmaceutical Supply Co#0536108691"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.7 "수의학 안과 연고")
스페이스 젤(AIMS)VWR#95059-640"4. 자궁 전기천공법"(단계 4.8 "과포화 소금 용액으로 채워진 밀봉된 파우치")
헤어 리무버 젤 크림, 민감성 포뮬러Veet#062200809951"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.9 "제모 크림")
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk)Phoenix Research ProductsTSP-10LKIT참조 "4. 자궁 내 electroporation" (단계 4.12 "sterile 10 µ L 마이크로피펫 팁")
보정된 마이크로모세관 피펫용 흡인기 튜브 어셈블리Sigma-AldrichA5177"4. 자궁 전기천공법"(단계 4.15 "흡인기 튜브 어셈블리")
꼰 흡수성 봉합사, 4-0, 바늘 NFS-2(FS-2), 27"MedrepexpressMV-J397"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.19 "흡수성 봉합사")
" LiquiVet 급류" 티슈 접착제MedrepexpressVG3"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.20 "조직 접착제")
피하 주사기, 폴리프로필렌, 루어 잠금 팁, 용량 1.0mLSigma-AldrichZ551546-100EA"4. 자궁 내 electroporation" (단계 4.21 "1 mL 주사기")
BD Precisionglide 주사기 바늘 게이지 26, L 1/2 in.Sigma-AldrichZ192392-100EA참조 "4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.21 "26G, ½ ” 바늘")
Nestlets 중첩 재료AncareNES3600"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.24 "중첩 재료")
해바라기씨, 검은 기름, 멸균Bio-ServS5137"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.24 "해바라기씨")
파라포름알데히드, 97%Alfa AesarA11313"5. 조직학"(단계 5.1.1 "PFA")
이코노미 핀셋 #3, 11cm, 0.2 x 0.4mm 팁World Precision Instruments#501976"5. 조직학" (단계 5.5 "핀셋")
한천 분말Alfa Aesar#10752참조 "5. 조직학"(단계 5.8.1 "한천")
단일 가장자리 면도날, #9 블레이드Stanley Tools#11-515"5. 조직학"(단계 5.9 "단일 가장자리 면도날")
시편 디스크 S D 50 mmLeica#14046327404참조 "5. 조직학"(단계 5.9 "진동 마이크로톰 표본 디스크")
버퍼 트레이 S 어셈블리Leica#1404630132"5. 조직학"(단계 5.10 "버퍼 트레이")
VT1000 S VibratomeLeica#14047235612"5. 조직학"(단계 5.10 "진동 마이크로 톰")
양날 면도PersonnaBP9020"5. 조직학"(단계 5.10 "블레이드")
나이프 홀더 SLeica#14046230131"5. 조직학"(5.10단계 "나이프 홀더")
Studio Elements Golden Taklon 짧은 손잡이 라운드 브러시 세트아마존B0089KU6XE참조 "5. 조직학"(단계 5.12.1 "미세한 팁 페인트 브러시")Superfrost
Plus 슬라이드전자 현미경 서비스#71869-11"5. 조직학"(5.12.1 단계 "현미경 슬라이드")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 mlThermofisherP36970참조 "5. 조직학" (단계 5.12.3-5.12.4 "mountant")
커버 유리, 24 x 50 mm, No. 1Phoenix Research ProductsMS1415-10참조 "5. 조직학"(단계 5.12.4 "커버슬립")
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)Sigma-AldrichD9542"5. 조직학"(단계 5.13.1 "DAPI")
고정 스테이지 정립 현미경OlympusBX51WI"5. 조직학"(단계 5.15 "광학 현미경")
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경NikonTE2000/C2si"5. 조직학"(단계 5.15 "컨포칼 현미경")
4x 대물렌즈, NA = 0.20NikonCFI Plan Apo Lambda 4X"5. 조직학"(단계 5.15 "저전력 목표")
20x 대물렌즈, NA = 0.75NikonCFI Plan Apo Lambda 20X"5. 조직학" (단계 5.15 "중간 전력 목표")
60x 목표, NA = 1.40NikonCFI Plan Apo VC 60X Oil참조 "5. 조직학"(단계 5.15 "고출력 목표")
인날

참고문헌

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