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방법 논문

Vivo에서 골절 뼈 쥐 마우스 대 퇴 골에 대 한 MRI-호환 Osteosynthesis 장치를 사용 하 여 치료 기간 동안 굳은 살 개발의 평가

9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56679

⸱

2017년 11월 14일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Orthopedic Research and Biomechanics, University Medical Center Ulm, 2RISystem, 3Core Facility Small Animal MRI, University Medical Center Ulm, 4Department of Traumatology, Hand-, Plastic-, and Reconstructive Surgery, University Medical Center Ulm

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

Endochondral 뼈 치유 하는 동안 골절 굳은 살에 조직 개발의 평가 치료 과정을 모니터링 하는 데 필수적 이다. 여기, 우리는 자기 공명 영상 (MRI)의 사용을 보고-MRI 있도록 마우스 대 퇴 골에 대 한 호환 외부 fixator 쥐에서 뼈 재생 동안 검색.

초록

Endochondral 골절 치유 골절 굳은 살에 섬유, 연골, 뼈가 있는 직물의 개발을 포함 하는 복잡 한 공정 이다. 다른 조직에는 굳은 살의 금액 골절 치료 진행에 중요 한 정보를 제공 합니다. 경도 작은 동물을 사용 하 여 전 임상 골절 치유 연구에 굳은 살 조직 개발 모니터링 기술을 사용할 수 비보에 디지털 방사선 및 µCT 이미징 포함 됩니다. 그러나, 두 기법과 비 mineralized 광물 화 된 직물을 구별 수만 있습니다. 따라서, 섬유 조직에서 연골을 차별 수 아니다. 대조적으로, 자기 공명 영상 (MRI) 그들의 함량에 따라 해 부 구조를 시각화 하 고 따라서 noninvasively 부드러운 조직과 연골 골절 굳은 살에 확인할 수 있을 수 있습니다. 여기, 우리는 MRI 호환 외부 fixator 마우스 대 퇴 골에 대 한 쥐에서 뼈 재생 중 MRI 검사를 허용 하도록 사용을 보고 합니다. 실험 그는 fixator와 주문 품 장착 장치 수 있도록 반복적인 MRI 검사, 골절-굳은 살 조직 개발의 경도 분석 활성화 설명 했다.

서론

2 차 골절 치유 뼈 치유의 가장 일반적인 형태입니다. Ontogenic endochondral 나오고1,2,3의 특정 측면을 흉내 낸 복잡 한 과정 이다. 주로 초기 골절 혈은 면역 세포과 립 및 섬유 조직 구성 됩니다. 낮은 산소 긴장 및 높은 biomechanical 긴장 골절 간격에서 osteoblast 차별화를 방해 하지만 chondrocytes4,,56으로 조상 세포의 분화를 촉진. 이러한 셀 골절된 뼈의 초기 안정성을 제공 하는 연골 매트릭스를 형성 하는 상해의 사이트에 확산 하기 시작 합니다. 굳은 살 성숙 동안 chondrocytes hypertrophic, 되 받을 apoptosis, 또는 트랜스-osteoblasts로 분화. 연골 뼈 전이 영역에서 Neovascularization 제공 높은 산소 수준, 뼈 조직7의 형성. 뼈 분쇄 갭의 다리, 후 biomechanical 안정성 증가 하 고 외부 골절 굳은 살의 osteoclastic 개장 생리 뼈 윤곽 및 구조3을 얻을 수 발생 합니다. 따라서, 골절 굳은 살에 섬유, 연골, 뼈 조직 양의 뼈 치유 과정에 대 한 중요 한 정보를 제공 합니다. 굳은 살 조직 개발 모두 인간과 쥐8,9,,1011의 변경에 의해 방해 또는 지연 치유 표시 됩니다. 경도 연구 작은 동물을 사용 하 여 치료 전 임상 골절에 굳은 살 조직 개발 모니터링 기술을 사용할 수 비보에 디지털 방사선 및 µCT12,13이미징 포함 됩니다. 그러나, 두 기법 및 비 mineralized 광물 화 된 조직 사이 차별 수만 있습니다. 반면, MRI 우수한 연부 조직 대조를 제공 하 고 따라서 부드러운 조직과 연골 골절 굳은 살에 확인할 수 있을 수 있습니다.

이전 작업 intramembranous 뼈-결함 치유15동안 쥐에 사후 MRI 쥐에서 관절 골절14 그리고 vivo에서 MRI를 위한 유망한 결과 보여주었다. 그러나, 두 연구는 또한 제한 된 공간 해상도 조직 대비를 밝혔다. 우리는 이전 murine endochondral 골절 치유16동안 부드러운 굳은 살 형성의 경도 평가 대 한 고해상도 vivo에서 MRI의 타당성을 설명 했다. 여기, 우리는 굳은 살 조직 개발 endochondral 골절 치유 과정 동안 경도 모니터 하기 위해 쥐의 대 퇴 골 뼈에 대 한 MRI 호환 외부 fixator를 사용 하기 위한 프로토콜을 보고 합니다. 외부 fixator의 삽입에 대 한 주문 품 장착 장치 디자인 반복된 검사 하는 동안 표준된 위치를 보장합니다.

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프로토콜

모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 국제 규정을 준수 하 고 (제 1250, Regierungspräsidium 튀빙겐, 독일) 지역 규제 당국에 의해 승인 했다. 모든 마우스 10 h 어두운 circadian 리듬 물과 음식을 제공 광고 libitum 14 h 빛에 감 금 소 당 2 ~ 5 동물의 그룹에서 유지 되었다.

1. 수술 재료 및 쥐의 치료 전 준비

  1. Sterilize 모든 수술 재료. 120-135 ° C의 압력가 마로 소독 온도 사용 하 여 살 균 시간 20-30 분.
  2. 구매 C57BL/6 마우스 또는 몸 무게의 19-35 g 사이 다른 스트레인에서 쥐. 적절 한 동물 보호 및 조사에 의해 승인 되는 국가 지침 서에 따라 실험 프로토콜에 따라 ' s 기관 동물 관리 및 사용 위원회. 절차를 시작 하기 전에 7 일 순응 기간의 최소 허용.
  3. 3 수술 날까지 수술 전에 1 일 식 수를 통해 모든 마우스 진통 제공.

2. 수술 절차 및 응용 프로그램의 외부 Fixator

  1. 장소 5-7 %isoflurane 및 60 mL/min 산소 튜브로 마우스 탑재. 자세 반사의 손실, 후에 마 취 유도 관에서 마우스를 제거 하 고 제공 하는 1-3 %isoflurane 및 60 mL/min의 산소 흡입 마스크를 통해 마 취를 유지 합니다. 마 취 중의
    1. 모니터 호흡 패턴 및 뒷 다리 발 반사 호흡 속도 약 100 사이클/분 하 고 뒷 발 반사 이다 결 석.
      ​ 참고: 필요로 하는 가스의 양을 나이, 성별, 체중, 및 마우스의 변형에 따라 달라 집니다.
  2. 수술 전에 주입 마우스 항생제의 단일 투여와 피하 (clindamycin, 45 mg/kg). 또한, 생리 유체 균형의 유지 보수, 500 µ L 염 분의 피하 유체 디포 마우스 주입 (0.9 %NaCl).
  3. 막 방지 하기 위해 건조, 마우스 눈 눈 연 고를 적용 됩니다. 마 취 동안 37 ° C에서 난방 접시에 마우스를 배치 하 고 생리 유지 하기 위해 수술 신체 온도.
  4. 오른쪽 뒷 다리에서 모피를 제거 하 고 알코올 기반의 소독 제와 수술 영역을 문질러. 오른쪽 뒷 발 unsterile 지역을 피하기 위해 멸 균 장갑의 작은 부분을 커버. 오른쪽 뒷 다리를 세 번 치료. 외과 영역 제외한 전체 마우스 살 균 드 레이프 장소.
    5. 메스와 오른쪽 대 퇴 골의 앞쪽 측에 따라서 경도
  5. 절 개 피부 약 1 cm. 별도 퉁 명 스럽게 엠 팔 뚝 femoris와 m. vastus lateralis 마이크로 시저 및 집게. 뼈의 anterolateral 부분에 무료로 액세스할 수 있도록 마이크로 시저와 대 퇴 골 trochanter에 힘 원점 쪽을 잘라. 좌 골 신경 유지 됩니다 있는지 확인 하십시오.
  6. 외부 fixator (3 N/mm, 그림 1 A의 축 강성) 대 퇴 골에 평행 하 게 배치합니다. 수동으로 0.45 m m 드릴 비트와 함께 피 질을 통해 시추공 훈련과 시추공에 핀을 장착 하는 세라믹을 배치. 가장 말 초 핀 뒤 가장 근 위 핀과 2 개의 핀 사이 시작 합니다.
    1. 는 긴장, 압축, 또는 전단 응력에는 fixator 장착 절차 동안 그렇지 않으면 달성된 뼈 격차는 fixator의 이완으로 인해 충분 한 되지 것입니다 있는지 확인 하십시오.
  7. 절단 절차 동안 탈수를 피하기 위해 무 균 NaCl의 작은 양의 뼈 축이다.
  8. 만들 0.4 m m 질 리 와이어 톱을 사용 하 여 두 내부 핀 사이 전체 뼈를 통해 서 0.4 m m 뼈.
    참고: 필요에 따라, 진동 마이크로 보고 사용할 수 있습니다는 뼈를 만드는 데. 뼈 지역에서 본에서 어떤 금속 칩을 피하기 위해 있는지 확인 하십시오.
  9. 두 골절된 외피가 사이 뼈 칩을 제거 하는 살 균 NaCl의 2 mL와 함께 신중 하 게 뼈 간격 플러시.
  10. Resorbable 봉합으로 연속 봉합 사를 사용 하 여 근육을 적응 (재료의 표 참조). 다음 중단된 비 resorbable 봉합 (재료의 표 참조)를 사용 하 여 피부를 적응. 상처 물고를 방지 하려면 배치 하지 마십시오 봉합 상처의 두개골 부분에.
    참고: 피부 접착제를 사용 하지 마십시오 또는 클립 마우스 일반적으로 상처 발생에서 그것을 제거 하는 때문에, 더 피부를 손상.
  11. 살 균 제와 수술 영역을 청소 하 고 마우스의 케이지. 모니터 마우스 그리고 공급 충분 한 열 (예: 적외선 빛) 때까지 완전히 깨어. 물, 음식 섭취 량과 몸 무게를 수술 후 모니터링 동물 통증과 고통을 하지 있는지 확인 합니다. 3 수술 날까지 식 수를 통해 모든 마우스 진통 제공.
    참고: 마우스 최대 4 개의 동물의 그룹에서 지 내게 될 수 있습니다.
  12. 모니터 마우스 ' 수술 후 1 ~ 5 일에 s 활동. 그 시간 과정, 마우스는 운영된 다리에 체중을 부담 한다. 그렇지 않으면, 마우스 추가 분석에서 제외 해야 합니다.

3. Mri 검사 절차 및 이미지 분석

  1. 이전 절차, 스캔 MRI에 2.1, 2.3, 단계에서 프로토콜에 따라 마우스를 anaesthetize 하 고 계속 호흡 속도 약 100 사이클/분의 오른쪽 뒷 다리에 외부 fixator를 삽입 합니다 주문 품 장착 장치 ( 그림 1 B, C)에 신중 하 게 마우스.
    1. 이후이 골절 치유를 방해할 수 있습니다 절곡 또는이 단계는 fixator의 압축을 피하기 위해 있는지 확인 합니다.
      참고: MRI 검사는 동물 보호와 실험 프로토콜에 따라 수술 후 3 일 지휘 될 수 있다.
  2. MRI 장치 도입에 대 한 온도 제어 요람에 마우스를 놓습니다. 4 소자 헤드 코일에 단단하게 장착 장치를 연결.
  3. 11.7 토니에서 전용된 높은 필드 작은 동물 MRI 시스템을 사용 하 여 취득 MRI 데이터
    ​ 참고:는 MRI 데이터 수집 형상을 직교 나사에 대 퇴 골 뼈에 맞춰집니다. 양성자 밀도 지방 억제 멀티 슬라이스 TSE 시퀀스 (PD-TSE)을 적용 하 여
    1. 취득 데이터 수집 매개 변수를 사용 하 여: 에코/반복 시간 테 5.8 ms/TR = 2500 ms, 해상도 Δr = 52 × 52 × 350 µm³, 보기의 필드 (FOV) = = 20 × 20 m m ², 그리고 대역폭 Δω = 150 KHz.
    2. 참고: 22 조각 총 수집 시간은 36 분
  4. 이미지 분석 소프트웨어와 함께 수집 된 데이터를 엽니다. 0.35 m m 3 x 0.05 x 0.05로 복 크기를 입력 합니다. (뼈, 연골, 섬유 조직/골) 골절 굳은 살에 다른 조직 같이 반자동 임계 처리를 가진 그들의 강도에 따라 세그먼트.
  5. 클릭
      는 " 새로운 레이블 필드 편집 ", 클릭 " 추가 자료 ", 자료를 이름을 바꿉니다 " callus ". 사용 하 여과 포 강렬한 신호에 따라 주변 조직에서 굳은 살 지역 구분은 " 올가미 " 도구.
    1. 클릭 " 자료에 추가 ". 클릭 " 추가 자료 " 자료를 이름을 바꿉니다 " 연골 ". 연골을 사용 하 여 세그먼트는 " 임계값 " 도구 및 " 현재 자료만 선택 "에서 " callus ". 클릭 " 연골 " 및 " 물자에 추가 ". 이러한 단계를 반복 하 여 " 뼈 " 및 " 골/섬유 조직 ".
  6. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 조직 세분화 데이터에 따라 골절된 화관의 3D 개조를 생성. 클릭 " 생성 표면 ", 적용 " 없음 " 위한 " 부드럽게 유형 " 클릭 합니다 " 표면 보기 ".
    참고: 매우 작은, 하이퍼 강렬한 분야는 en을 둘러싼골절된 외피가의 ds 뼈에서 부드러운 조직 전환으로 유물을 될 가능성이 있습니다. 이 지역 추가 분석에서 제외 해야 합니다. 골절 중간 하이퍼 강렬한 지역 callus 대표 연골 조직 치유 골절의 endochondral 단계. Endochondral 나오고 단계에서 뼈 간격에서 골절 굳은 살 원심 hypo-강렬한 지역 및 전체 골절 굳은 살 나중 치유 단계에 걸쳐 동일한 강도 영역 새로 형성된 된 뼈 굳은 살 조직을 나타냅니다. 이 분야는 hypo 강렬한 신호, 성숙한 뼈 (피 질)에서 신호 강도 더 낮은. 임계 처리 후 골절 굳은 살의 연골 조직과 뼈 조직에 대 한 신호 강도 표시 골으로 나머지 조직과 섬유 조직. 조직 세분화에 대 한 값: 뼈 조직 (를 포함 하 여 성숙 피 질, 배수 뼈와 뼈의 굳은 살 조직) 1-3.3 (성숙 피 질 정규화 된 신호 강도)의 범위 내에서 세그먼트는 3.4-5.4의 범위 내에서 골 수/섬유 조직 및 5.5-6.2의 범위 내에서 연골 굳은 살 조직.
  7. 필요한 경우 MRI 스캔 경도 동안 반복 골절 치유 과정. 연골이 굳은 살 개발 모니터링, 10, 14, 그리고 21 일 수술 후에 마우스를 스캔.
    참고: 시간 포인트 동물 관리 및 실험 프로토콜에 따라 달라질 수 있습니다.

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결과

첫째, 수술의 성공 ( 그림 2에서 예제 참조)는 MRI 검사의 분석에 의해 확인할 수 있습니다. 모든 4 개의 핀 대 퇴 축 가운데 위치 해야 합니다. 뼈 간격의 크기는 0.3-0.5 사이 여야 m m. 뼈 간격의 크기는이 값에서 크게 차이가, 마우스 추가 분석에서 제외 해야 합니다.

둘째, 골절 치유 같은 동물에서 과정 동안 경도 검사의 평가 굳은 살 조직 개발에 대 한 정보를 제공 합니다. 연골 조직 10 일째에 골절 굳은 살 중간에 표시 되는 마우스 하루 10, 14, 21 ( 그림 3에서 예를 참조)에서 검색 하는 경우 (상대 연골 영역 = 30.8%)와 하루 14 (상대 연골 영역 = 29.0%), 후 21 일까지 감소 수술 (상대 연골 영역 = ...

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토론

수정 및 문제 해결:

이 연구의 주요 목표를 사용 하 여 MRI 호환 외부 fixator의 마우스에 대 퇴 골 뼈에 대 한 경도 endochondral 골절 치유 과정 동안 굳은 살 조직 개발을 모니터링 하는 기능에 대 한 프로토콜을 설명 했다. 외부 fixator의 삽입에 대 한 주문 품 장착 장치 디자인 반복된 검사 하는 동안 표준된 위치를 보장합니다. 자동 조직 세분화 골절 굳은 살에 섬유, 연골, 뼈 조직의 금액의 분석을 수 있습니다. 또한, MRI 이미지의 3D 복원 endochondral 골절 치유 과정에서 각 개별 마우스의 시각화를 수 있습니다.

프로토콜 내에서 중요 한 단계:

MRI-호환 외부 fixator를 사용 하 여 수술의 가장 중요 한 단계는: (1) 피하 모든 수술 하는 동안 좌 골 신경 손상, 그...

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공개 사항

저자 로마노 Matthys RISystem AG 다보스, 스위스는 임 플 란 트를 생산 하 고이 문서에서 사용 되는 특정 악기 임 플 란 트의 직원입니다. 다른 모든 저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

감사의 글

우리는 우수한 기술 지원에 대 한 Sevil Essig, 스테파니 치유력이, 레나 피셔, 카 차 Prystaz,이 본 Hägele, 및 앤 Subgang 감사합니다. 우리는 또한 독일 연구 재단 (CRC1149, INST40/499-1)와 AO 외상 기초 독일이이 연구 자금에 대 한 감사 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
마취관FMI, Seeheim, GermanyZUA-82-ANA-TUB-마우스
마취기 FMI, Seeheim, GermanyZUA-82-GME-MA
동맥 집게 Aesculap, Tuttlingen, GermanyBH104R
AutoclaveSystec, Wettenberg, GermanyDX-150
오토클레이브 패키징Stericlin, Feuchtwangen, Germany2301-04/06/10/12/16
Avizo softwareFEI, Burlington, USA-Version 8.0.1
BioSpec 117/16 자기공명영상시스템Bruker Biospin, Ettlingen, Germany117/16
불독 클램프 Aesculap, Tuttlingen, GermanyBH 021R
탄소강 메스 no. 11/15Aesculap, Tuttlingen, GermanyBA211/215
세라믹 마운팅 핀 0.45 mm RISystem, Davos, SwitzerlandHS691490
Clindamycin (300 mg / 2ml)Ratiopharm, Ulm, Germany-
드레싱 펜치 115 mm Aesculap, Tuttlingen, GermanyBD210R
드레싱 펜치 130 mm Aesculap, Tuttlingen, GermanyBD025R
드릴 비트 코팅 0.45 mm RISystem, Davos, 스위스HS820420
Durogrip 바늘 홀더 125 mm Aesculap, Tuttlingen, GermanyBM024R
폴리오드레이프 Hartmann, Heidenheim, Germany2513026
FrekadermFresenius, Bad Homburg, Germany4928211
Gigli는 0.44mm를 보았습니다.RISystem, Davos, SwitzerlandRIS.590.110.25
핸드 드릴RISystem, Davos, 스위스RIS.390.130-01
가열판 FMI, Seeheim, GermanyIOW-3704
Hygonorm 장갑 Hygi, Telgte, Germany2706
IsofluraneAbbot, London, UK포렌
마이크로 펜치 155 mm Aesculap, Tuttlingen, GermanyBD343R
마이크로 가위 120 mm Aesculap, Tuttlingen, GermanyFD013R
마우스 FixEx L 0.7 mm RISystem, Davos, 스위스RIS.611.300-10
드릴용 바늘 케이스 Aesculap, Tuttlingen, GermanyBL911R
바늘 홀더Aesculap, Tuttlingen, GermanyBB078R
OcteniseptSchü lke, Norderstedt, Germany121403
Osirix 소프트웨어Pixmeo SARL, Bernex, 스위스-버전 4.0
산소, 의료용MTI, Ulm, 독일-
Resolon 5/0Resorba, Nü rnberg, Germany88143
식염수 0.9%Braun, Melsungen, Germany3570350
메스 핸들 125 mmAesculap, Tuttlingen, GermanyBB073R
가위 150 mm Aesculap, Tuttlingen, GermanyBC006R
오토클레이브 포장용 실러 Hawo GmbH, Obrigheim, GermanyHM500
Sterican 27 G Braun, Melsungen, Germany4657705
멸균 수술용 칼날 번호 11/15 Aesculap, Tuttlingen, GermanyBB511/515
수술용 장갑 Hartmann, Heidenheim, 독일Peha-micron 9425712
수술 용 조명 Maquet SA, Ardon, France블루 라인 80
주사기 5 ml Braun, Melsungen, GermanyInjekt 4606051V
조직 펜치 80 mm Aesculap, Tuttlingen, GermanyOC091R
트라마돌 25 mg/lGrü nenthal, 아헨, 독일100mg/ml
Vasofix 안전성 Braun, Melsungen, Germany4268113S-01
Vicryl 5-0 Ethicon, Norderstedt, GermanyV30371
Visdisic 눈 연고 바우쉬 & Lomb, 베를린, 독일3099559

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