과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

요약

이 프로토콜 열 충격 유발 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템), 외국 단백질을 표현 하거나 안티 apoptotic 활동의 잠재적인 외국 단백질 및 그들의 잘린 아미노 평가에 사용 될 수 있는 설명 곤충 세포에서 산입니다.

초록

변이 유전자 표현 시스템 잠재 체 외에서 세포 문화 시스템에서 단백질 기능 분석을 수행 하기 위한 가장 중요 한 기술 중 하나입니다. 이 시스템은 과도 식 플라스 미드에 baculoviral 발기인의 통제 익스프레스 외국 유전자를 개발 되었다. 또한,이 시스템은 자체 잠재 또는 외국 단백질 기능 분석 결과에 적용할 수 있습니다. 가장 광범위 하 게 그리고 상업적으로 사용 가능한 변이 유전자 식 시스템 Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV)의 즉시 이른 유전자 (IE) 발기인에 따라 개발 된다. 그러나, 낮은 식 수준 외국 유전자 곤충 세포에서 관찰 되었다. 따라서, 일시적인 유전자 표현 시스템 단백질 식 향상을 위한 건설 되었다. 이 시스템에서 재조합 플라스 미드는 초파리 열 충격 70 (Dhsp70) 발기인의 통제 대상 시퀀스를 포함 하도록 건설 되었다. 이 프로토콜의이 열 충격 기반 pDHsp/V5-그의 (6 히스티딘와 V5 epitope) 응용 프로그램 선물 /Spodoptera frugiperda 셀 (sf9 셀) 시스템; 이 시스템은 또한 곤충 세포에서 후보 단백질의 안티-apoptotic 활동을 평가 하기 위한 유전자 발현 뿐만 아니라 가능 하다. 또한,이 시스템 중 한 재조합 플라스 미드와 페 수 또는 두 개의 잠재적으로 기능적으로 대립 곤충 세포에서 재조합 플라스 미드를 페 공동. 프로토콜이이 시스템의 효율성을 설명 하 고이 기술의 실용적인 사례를 제공 합니다.

서론

두 단백질 표정 시스템 단백질 생산을 위해 일반적으로 사용 되었습니다: 원핵생물 단백질 표정 시스템 (대장균 유전자 표현 시스템) 및 진핵생물 단백질 표정 시스템. 하나의 인기 있는 진핵생물 단백질 식 시스템은 잠재 식 벡터 시스템 (BEVS)¹. Baculoviruses 먼저 농업의 전세계 생물 관리 요원으로 사용 되었다 산림 해충 및. 지난 몇 년간, baculoviruses 단백질 표정 벡터도를 위한 바이오 도구로 개발 되었다. 더블-좌초 원형 DNA 및 엔벌로프된 nucleocapsids²baculoviruses의 게놈에 의하여 이루어져 있다. 날짜 하려면, seventy-eight 잠재 이상 격리 시퀀스³되었습니다. 호스트 곤충 세포에서 baculoviral 유전자 식의 시간적 cascade를 바탕으로, 유전자 전사 4 시간 계곡, 즉시 초기 지연-초기, 늦은, 그리고 매우 늦은 유전자⁴등으로 분류 될 수 있습니다.

매우 늦은 유전자 발기인 (즉, 다면체 또는 p10 발기인) 대상 유전자 재조합 잠재 동종 재결합에 의해 생성 하는 동....

프로토콜

1입니다. 준비

1. 곤충 세포 배양
   1. 세포 배양의 50 mL를 준비 합니다. 이렇게 하려면 추가 항생제의 500 µ L (암포 B = 0.25 µ g/mL, 페니실린 단위/100ml, 스 = = 100 µ g/mL) 및 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS 또는 항생제) 없이 혈 청 무료 세포 배양에서의 5 mL.
      참고: 사용 하기 전에 물 욕조에 30 분 동안 65 ° C에서 소 태아 혈 청을 열.
   2. Spodoptera frugiperda 를 유지 (나비목: Noctuidae), sf9 곤충 세포. 분리 ca. 25 cm² 셀 문화 플라스 크에서 세포의 80%는 플라스 크를 흔들어 하 고 가벼운 현미경 검사 법에서 확인. 다음, 새로운 25 cm² 셀 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액의 50%를 전송 하 고 실 온에서 15 분 동안 연결할 셀을 허용. 5 mL 신선한 세포 배양 매체와 매체를 대체 하 고 28 ° c.에 인큐베이터에서 성장 통로 세포 세포 성장에 따라 2 ~ 3 일 마다.
2. 세포 transfection 플라스 미드의 준비
   1. 삽입 대상 DNA 파편 (예: Lymantria xyl....

결과

전체 길이 LyxyMNPV에서 Ly-IAP3의 다른 두 잘림 (BIR 및 도메인) 했다 overexpressed sf9 셀에는 열 충격 기반 pDHsp/V5-그의 기반 /Spodoptera frugiperda 셀 (sf9 셀) 시스템. pDHsp/V5-그의 초파리 열 충격 단백질 발기인, 셀룰러 transcriptional 요인과 번역 시스템 (그림 1)^{8 를 사용 하 여 다운스트림 유전자 발현 온도 42 ° C 조건에서 드라이브 포함 9,11}. 전체 기술 흐름도 그림 2에 표시 됩니다. 1 h 5 h 열 충격 후, 세포 단백질 견본 버퍼와 lysed 되었고 서쪽 오.......

토론

열 충격 기반 pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템의 개념 처음 클레 멘 타인 외. 1994⁸에 의해 설명 되었다. Baculoviral 유전자 발기인 (IE1)와 초파리 hsp70 의 비교는 hsp70 모기 셀¹⁰높은 효율을 했다 보여주었다. 또한, 열 충격 유도 때문 단백질 식의 타이밍은 열 충격 처리 후 정확 하 게 제어할 수 수 있습니다. 이 시스템은 다음 새우와 nucleopolyhedrovirus (NPV)의 단백질 기능 분석에 대 한 적용 IAP 단백질^9,11. 6 플라스 미드 구조물의 총이이 프로토콜에서 사용한: 3 (pDHsp/V5-그의 pDHsp/Ac-p35/V5-그의 그리고 pDHsp/D-rpr/플래그-그의) 지 앤 Horng 레이

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
곤충 세포 배양을 위한	항생제-항진균제, 100X	Gibco	15240-062
인증된 소 태아 혈청	Bioind	04-001-1A
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher	10902096	무혈청 세포 배양 배지
Sf9 세포	ATCC	CRL-1711
25cm2 세포 배양 플라스크	Nunc, Thermo Fisher	156340
반전광 현미경 WHITED		WHITED WI-400
RBC HIT 유능한 세포	Bioman	RH618-J80	Escherichia coli (DH5α)
LB Broth (Miller)	Bioman	LBL407
한천, 세균 등급	Bioman	AGR001
Zeocin	Invitrogen	ant-zn-1	선택 항생제
PCR 마스터 믹스 (2X)	ThermoFisher	K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free)	Geneaid	PIE25
Actinomycin D	SIGMA	A9415
Corning 50 mL 원심분리기 튜브	SIGMA	CLS430829-500EA	50 mL 튜브
혈구분석기	Gizmo Supply Co	B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	142475	24-well plate
Cellfectin II 시약	Thermo Fisher	10362100	cell transfectin 시약
PBS-Phosphate-Buffered 식염수 (10X) pH 7.4	Thermo Fisher	AM9624
4회; SDS 로딩 염료	Bioman	P1001
Immobilon-P (PVDF 블로팅 멤브레인)	Merck Milipore	IPVH00010	PVDF 멤브레인
미니 트랜스 블롯 셀 시스템	BIO-RED	1703930	블로팅 장치
Ponceau S 솔루션	SIGMA	6226-79-5
Anti-V5	SIGMA	V8137	rabbit anti-V5 항체
염소 안티 토끼 IgG-horseradish peroxidase (HRP)	Jackson	111-035-003
Tween 20	Merck	817072
6-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	145380
0.4 % trypan blue solution	AMRESCO	K940-100ML
P10 pipetman	Gilson	F144802
P1000 pipetman	Gilson
테이프	Symbio	PPS7	24 웰 테이프 ( 19 mm× 36 M)

F123602