포유류에서 oogenesis 오류가, 특히 염색체 missegregation 인 것으로 알려져 있다. 이 원고 chromatin 확산 마우스 의향에 대 한 준비 방법에 설명 합니다 분열 I 및 II 준비 oocytes. 이러한 기본 기술을 chromatin-바인딩 단백질 및 포유류 oogenesis 전체 염색체 형태학 연구에 대 한 수 있습니다.
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방법 논문
Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Chromatin 확산 기법 gametogenesis spermatogenesis 위해 특히 동안 다양 한 단백질의 동적 지역화를 평가 하기 위해 널리 사용 되었습니다. 이러한 기술을 synapsis 및 DNA 복구 동종 염색체, 페어링 등 meiotic 이벤트 기간 동안 단백질 및 DNA 지역화 패턴의 시각화 하실 수 있습니다. 문학에서 몇 가지 프로토콜 설명 되었습니다, 포유류 의향 oocytes를 사용 하 여 일반 chromatin 확산 기술을 제한 하 고 태아 난소에서 감수 분열 개시의 타이밍 때문에 어려운 있습니다. 비교에서는, 의향 spermatocytes 기정을 위한 필요 없이 더 높은 수익률을 젊은 남성 쥐에서 수집할 수 있습니다. 그러나, 특정 단계 청소년 및 성인 고환에 meiotic 및 포스트 meiotic 생식 세포 인구의 때문에 셀의 순수한 동기화 된 인구를 어렵습니다. 감수 분열의 후기, oocytes 성숙한 oocytes의 그룹의 성인 여성 쥐에서 수집 하 고 문화 감수 분열 재개를 자극 수 있기 때문에 내가 (미) 또는 감수 분열 II (MII), 감수 분열을 겪고을 평가에 유리 하다. 여기, oocytes를 사용 하 여 확산 meiotic chromatin 준비 방법에서 태아, 신생아 해 부와 성인 난소 동반 비디오 데모와 함께 설명 되어 있습니다. 염색체 missegregation 이벤트 포유류 oocytes에는 자주, 특히 미 중입니다. 이러한 기술 평가 oogenesis의 다양 한 단계 다른 돌연변이 또는 환경 노출의 효과 특성을 사용할 수 있습니다. 내 설명은 감수 분열 동안 염색체 단백질 역학의 성적으로 동종이 형 기능과 포유류 oogenesis의 우리의 이해를 증가 하는 귀중 한 oogenesis spermatogenesis 사이 뚜렷한 차이가 있기 때문에, .
서론
Spermatogenesis, 동안 meiotic 세균 세포의 큰 반동기 파도 신속 하 고 지속적으로 충만 한 사춘기와 성인 기1에 걸쳐 발병에 고환에. 남성, 달리 여성에서 감수 분열은 태아 개발 중 유일 하 게 시작 됩니다. 출생, 다음 oocytes 체포 의향의 장기간된 dictyate 단계에 남아 나는 그대로 germinal 소포 (GV; 핵 봉투) 사춘기까지. 사춘기의 개시에 oocytes의 하위 집합을 성장과 성숙, meiotic 재개의 개시를 표시 주기적으로 선택 됩니다. Meiotic 재개 가득 oocytes에서 germinal 기 쇠 약 (GVBD)로 알려진 프로세스에서 GV의 실종에 의해 명시 됩니다. oocyte는 염색체 응축 및 분리, 극 지 몸 밀어 남에 의해 다음 다음 겪 습. Oocytes는 MII 진행 시 체포 되 고 수정 후에 두 번째 그리고 마지막 meiotic 부문 완료 자극.
여성 불 임은 매우 meiotic 의향의 성공에 따라 달라 집니다 내가 진행. 이 핵심은 동종 염색체 크로스 오버 재결합2를 통해 유발된 DNA 이중 가닥 틈 (DSBs)의 수리에 의해 중재 chiasmata로 알려진 사이의 물리적 링크의 형성 이다. 이 프로세스는 동적 단백질이 풍부한 비 계 라고 자신의 synapsis3촉진 하기 위하여 상 동 염색체 사이 형성 하는 synaptonemal 복잡 한 (SC)의 컨텍스트 내에서 발생 합니다. 사우스 캐롤라이나 지퍼 처럼 노사 정 구조 이다 중앙 지역 단백질에 의해 연결 된 2 개의 병렬 측면 요소 구성 된 지속적인 DNA 수리에 걸쳐 함께 homologs를 보유 하 고. Synapsis, 이전 축 요소 라는 측면 요소의 선구자 형성 자매 사이 chromatids. SYCP2 및 SYCP3 같은 synaptonemal 복잡 한 단백질 초기 의향 동안 자매 chromatid 결합 축에 colocalize 축 요소를 형성 합니다. 나중에 이러한 역할을 가로 필 라 멘 트 단백질, SYCP1, 중앙 요소 어셈블리 및 정렬된 homologs4사이 synapsis 용이 대 한 사이트를 바인딩. 마우스 oocytes에서 완전 한 synapsis 표시 됩니다 20의 존재에 의해 완전히 겹치는 chromatin를 사용 하 여 구상 될 수 있다 SYCP3와 SYCP1 뻗어 확산 준비. Synapsis는 pachytene substage, 그것에 의하여 homologs 사이의 양식 chiasmata 운명 성숙한 크로스 꾸며져 홍보 그들의 정확한 처리5,6 mutL 체 (MLH1/3) 이합체에 진입 시 완료 , 7. cohesin, condensin, 및 SMC5/6 복잡 한, 포함 하는 염색체 (SMC) 단지의 구조 유지 염색체 역학 및 감수 분열8,9, 전체 구조 규제에 대 한 중요 하다 10,,1112. 이러한 이벤트는 사우스의 해체 다음 스핀 들 극 반대를 상 동 염색체의 올바른 bi 방향을 보장 하는
Meiotic 세포 주기 프로그램된 유도 및 DNA DSBs의 후속 수리 유지 보수 게놈에서에서 다양 한 단백질의 역할을 검사 하는 강력한 모델입니다. 또한, 포유류 감수 분열 후 성적인 수정 및 각 인13의 연구에 대 한 관련 모델 이기도합니다. 그러나, 포유류 (그림 1) 태아 및 신생아 난소에서 여성 감수 분열 동안 이러한 이벤트를 평가 하기 위해 기술적으로 어렵습니다. 의향 나 5 substages로 나눌 수 있습니다: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema 및 dictyate. 여기, 우리가 격리 태아 및 신생아 난소와 고환 (그림 2) 사이 구별 하는 방법을 설명 합니다. 앞에서 설명한 방법에서 적응이 원고 또한 프로토콜 (1 단계) 여성 meiotic 의향의 준비에 대 한 비디오 데모와 함께 설명 난 chromatin 확산14,,1516,17 . 6-7 단계에 설명 된 대로 immunolabelling와 결합 하면이 프로토콜 사용 의향의 상세한 현미경 분석 나 oocytes에서 이벤트.
Oogenesis 오류가, 이며 첫 번째 meiotic 부문 중 염색체 missegregation 이벤트 자손18,19에서 유전자 질환의 가장 일반적인 소스를 나타냅니다. 이 원고 (프로토콜 단계 2), 우리는 성숙한 GV 준비 oocytes 성인 여성 쥐의 끝났다 난소에서 추출 되는 프로토콜을 설명 합니다. 지원 조건 가득 oocytes 고립과 문화20다음 감수 분열의 황 호르몬 독립 재개를 받 다. Meiotic 재개 다음 oocytes 감수 분열을 통해 진행, 다음 분열 II에 체포. . 을 수정 하지 않는 한 oocytes 유지 분열 II에서 체포 단계 2-5, 우리가 이전에 보고 된 프로토콜, 문화를 수집 하 고 chromatin 확산 준비21MI와 MII oocytes를 준비 하는 방법을 설명 하는 비디오 데모와 함께 적응. 기술 확산이 chromatin 염색체와 관련 된 단백질의 명확한 immunolabelling 수 있습니다. 또한,이와 일가 염색체 사이 구별 하는 데 사용 수 프로토콜과 단일 자매 해결 더 수 oocyte ploidy의 평가 촉진 하기 위하여 chromatids. 따라서, meiotic 단백질의 지 방화 패턴을 공개, 뿐만 아니라이 프로토콜 수 역할도 elucidating MI와 MII 동안 염색체 missegregation의 잠재적인 원인에 대 한 귀중 한 도구.
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었습니다. 야생-타입 C57BL/6J 쥐에 실험을 수행 했다.
1. 확산 수확 태아 또는 신생아 난소와 의향 Chromatin의 준비
- 14.5-19.5 일 배아 추출 게시물-coitum (dpc) 자 궁 경관 탈 구 또는 IACUC 지침에 따라 CO2 질을 통해 임신 여성을 희생.
참고: 출생 후 하루 1-5 난소에 대 한 1.3 단계로 건너뜁니다. 그림 1 에 다른 배아 및 출생 연령대에 농축 meiotic 의향 단계 요약 되어 있습니다. - 살 균가 위, V 자형 오프닝 만들기를 사용 하 여 abdominopelvic 구멍을 엽니다. 어머니 자 궁 경적 밖으로 dissect, 태아는 태에서 분리 하 고 35mm 페 트리 요리 미리 데워 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 37 ° c.에 x의 3 mL에 배아를 전송
참고: fliptop 인큐베이터 37 ° C에서 설정 온도 유지 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 온도 통제 유리 무대 또한 난소 조작 하는 동안 온도 유지 하기 위해 사용할 수 있습니다. - 3.5 인치 수술가 위, 배아 또는 IACUC 지침에 따라 잘린 통해 새끼를 희생. 더 절 개 전에 미리 데워 공영에 잘린된 배아 또는 새끼를 배치 합니다.
- 37 ° c.에 미리 데워 공영 3 mL를 포함 하는 별도 35 mm 페 트리 접시에 한 번에 하나의 배아 또는 강아지 해 부 앞 발 아래 앞쪽 절반 바로 위에 뒷 다리 사지 및 꼬리 그림 2A-B에 명시 된에 따라 배아의 후부 절반의 복 부 정중 선 따라 절단 하 여 진행 합니다.
- 3.5 인치 수술가 위를 사용 하 여 복 부를 엽니다. 뾰족한 집게를 사용 하 여 치환 하거나 간, 창 자, 37 ° C에 미리 데워 공영 3 mL를 포함 하는 새로운 35mm 페 트리 접시에 난소를 노출의 루프를 제거 ( 그림 2B에 설명서 참조). 난소와 복 막 구멍 (그림 2B-C)의 후부 벽 쪽으로 신장 뒤에 바로 아래 있습니다. 남성과 여성의 생식 기 사이 차별에 대 한 가이드는 그림 차원에서 제공 됩니다.
참고: 최적의 조건에 대 한 신속 하 게 해 부 난소 밖으로 후 임신 여성 희생 이다. - 절 개 범위 및 시계 안경에서 뾰족한 집게의 쌍을 사용 하 여 각 여성 태아에서 양쪽 난소를 제거 하거나 멀티 잘의 별도 우물 접시 미리 따뜻하게 PBS의 0.5 ~ 1.0 mL를 포함 하 고 37 ° c.에 유지
- 깨끗 한 시계 유리 또는 난소 comp를 담가 9-잘 접시의 작은 우물에서 0.5 mL hypo-추출 버퍼 (17mm trisodium 시트르산이 수화물, 50mm 자당, 5 mM EDTA, 0.5 m m DTT, 30 mM Tris HCl, 프로 테아 제 억제 물, pH 8.2)에 난소의 각 쌍을 배치 letely입니다. 적어도 15 분, 하지만 더 이상 30 분 품 어.
참고: 포 추출 버퍼 신선한 만들고 DTT 추가의 2 시간 이내에 사용. - 그림 3A와 같이 부 화, 소수 성 장벽을 PAP 펜을 사용 하는 동안 깨끗 한 유리 25 x 75 m m2, 1 m m 두께 현미경 슬라이드 22 x 22 m m2 사각형을 그립니다.
참고: 슬라이드 미리 준비 될 수 있습니다. - 깨끗 한 슬라이드에 100mm 자당의 45-50 µ L 플라스틱 하 고 드롭 난소의 한 쌍을 전송.
- 자당 솔루션에 셀 출시 떨어져 난소를 애타게 두 27 G 바늘의 날카로운 끝을 사용 하 여. 집게, 난소의 큰 조각을 제거 하 고 신중 하 게 플라스틱 셀 분산 자당 솔루션.
- 통 솔루션의 장소 40 µ L (1 %paraformaldehyde (PFA), 0.2% 세제 ( 재료의 표참조), pH 9.2) 준비 된 슬라이드의 각 광장으로. 200 µ l 피 펫 팁, 슬라이드 표면 통 솔루션을 균등 하 게 확산.
- 20 µ L 자당 믹스에는 정착 액을 포함 하는 슬라이드의 각 사각형의 플라스틱
참고:이 슬라이드 당 난소의 한 쌍을 사용 하는 것 같습니다. - 하룻밤 실 온에서 닫힌 습 챔버에서 슬라이드를 품 어.
참고: 야간 보육 주위 배열할 수 있다 (12-15 시간) 실내 온도에. - 챔버 뚜껑 열고 슬라이드 완전히 건조 허용 합니다.
- 씻어 0.4% 일로 에이전트-PBS 솔루션 50 mL를 포함 하는 Coplin jar에 슬라이드 2 분, 건조 한 공기 및 immunolabelling 프로토콜 (6 단계)로 이동 ( 재료의 표참조).
참고: 나중 사용을 위해-80 ° C에서 슬라이드를 저장할 수 있습니다 하지만 이것은 관심사의 단백질에 따라 다릅니다. 최적의 결과 대 한 immunolabelling 프로토콜 (6 단계)로 즉시 이동 합니다.
2. 분열 나 Oocyte 컬렉션
- 각 마우스에서 격리 antral 낭의 수를 최대화 하려면 intraperitoneally 임신 암 말의 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG, 일컬어 말 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (eCG))의 5 IU와 성적으로 성숙한 처녀 여성 쥐를 주사.
참고: 최적의 oocyte 수율에 대 한 쥐 해야 1 ~ 3 개월, oocytes 수확의 수 나이로 줄일 것 이다. -20 ° c.에 600 µ L의 단일 사용 aliquots에 살 균 PBS (5 U/0.1 mL) 저장소의 100 ml에서 5000 IU의 병 해산 PMSG를 준비 하려면 - 44-48 h 후 준비 컬렉션 매체, 최소 필수 중간 알파 (MEMα) 매체 3 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA; 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 MEMΑ/BSA/FBS). 0.2 µ m 기 공 필터를 통해 미디어를 소독. MEMα/BSA/FBS 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에 따뜻하고 마우스 당 한 유리 그릇에 중간의 2.5 mL을 가만히 따르다.
참고: 다른 수집 및 상용 (m 2와 M16)는 문화 미디어도 자주 사용 됩니다.
주의: 조작 단계 동안 주변 공기 노출을 최소화 하기 위해 제한 된 기간 동안 한 번에 하나는 5% CO2 배양 기에서 문화 요리를 제거 것이 좋습니다. - 자 궁 경관 탈 구 또는 IACUC 지침에 따라 CO2 질을 통해 쥐를 희생.
- 큰 V 자형 여 만드는 살 균가 위를 사용 하 여 abdominopelvic 구멍을 엽니다. 집게를 사용 하 여 창 자를 마우스의 머리 쪽으로 치환. 각 자 궁 경적을;를 찾습니다 난소는 흉 곽에 인접 제시 됩니다. 좋은 집게와는 수 란 관을 보유 하 고 해 부가 위 (그림 4)를 사용 하 여 난소에 지방 등을 잘라. 수 란 관, 그리고 좋은 집게의 또 다른 세트 MEMα/BSA/FBS 매체를 포함 하는 컬렉션 접시로 부르사와 장소에서 난소 릴리스 계속.
참고: 1 단계에서 그것은 37 ° C에서 난소를 유지 하 고 5% CO2에 유지 하는 것이 필수적. 5% CO2 혼합 연결 fliptop 인큐베이터 온도 CO2 레벨의 최적의 유지 보수를 위해 수 있도록 사용할 수 있습니다. 또한, 온도 통제 유리 단계 또한 oocyte 조작 하는 동안 온도 유지 하기 위해 사용 한다. - 수동으로 큰 antral 낭을 puncturing 의해 적 운 oocyte 단지 릴리스 27 게이지 바늘 (또는 비슷한 크기), 1 mL 주사기를 사용 하 여.
- 해 부 현미경을 통해 관찰 하는 동안 GV 준비 oocytes 입 운영 하는 유리 피 펫 또는 모 세관, 또는 수동 마이크로미터-주사기 (그림 5)를 사용 하 여 수집 합니다. 만 antral 낭에서 출시 된 oocytes를 수집 합니다. GV oocytes 약 90의 직경이 있다 µ m. GV oocytes granulosa 셀의 2-3 층으로 둘러싸여 있을 수 있고 약 200 µ m의 총 직경.
- 깨끗 한 시계 유리 또는 분열에 도달 6 h에 대 한 MEMα/BSA/FBS 매체를 포함 하는 9-잘 접시에 oocytes를 문화 나 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서.
- 4 단계로 진행 합니다.
3. 분열 II (MII) Oocyte 컬렉션
- Oocytes 각 마우스에서 분리를 최대화 하기 위해 intraperitoneally PMSG의 5 IU와 성적으로 성숙한 처녀 여성 쥐를 주사. 44-48 h 후 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)의 5 IU와 주사 intraperitoneally.
참고: 최적의 oocyte 수율에 대 한 쥐 해야 1 ~ 3 개월, oocytes 수확의 수 나이로 줄일 것 이다. HCG를 준비 하려면 10000 U 200 mL PBS의 병 해산 (5 U/0.1 mL). -20 ° c.에 600 µ L의 단일 사용 aliquots에 저장 - 12-14 시간 후 2.2, 단계에서 설명한 것 처럼 MEMα/BSA/FBS 컬렉션 매체를 준비 합니다.
- 자 궁 경관 탈 구 또는 IACUC 지침에 따라 CO2 질을 통해 쥐를 희생.
- 큰 V 자형 여 만드는 살 균가 위를 사용 하 여 abdominopelvic 구멍을 엽니다. 집게를 사용 하 여 창 자를 마우스의 머리 쪽으로 치환. 각 자 궁 경적을 찾습니다, 그리고 난소 근 흉 곽에 제시 됩니다. 좋은 집게와는 수 란 관을 보유 하 고 해 부가 위 (그림 4)를 사용 하 여 난소에 지방 등을 잘라. 다음 난소와 수 란 관을 제거 하 고 MEMα/BSA/FBS 매체를 포함 하는 컬렉션 접시에 놓습니다.
참고: 단계 1과 2에서 그것은 37 ° C에서 난소를 유지 하 고 5% CO2에 유지 하는 것이 필수적. 5% CO2 혼합 연결 fliptop 인큐베이터 온도 CO2 레벨의 최적의 유지 보수를 위해 수 있도록 사용할 수 있습니다. 또한, 온도 통제 유리 단계 또한 oocyte 조작 하는 동안 온도 유지 하기 위해 사용 한다. - 1 mL 주사기 27 G와 함께 (또는 비슷한 크기)를 사용 하 여 또는 날카로운 집게, MII oocytes를 해제 수 란 관의 ampulla에 구멍을 찢 어.
주: 수는 ampulla에 oocytes를 손상 하지 않도록 주의 하십시오. ampulla가 나타납니다 부 어 반투명 되도록 oocytes는 표시 (그림 4). - 입 식 유리 피 펫 또는 모 세관, 또는 수동 마이크로미터-주사기 (그림 5)를 사용 하 여 컬렉션 매체와 새로운 그릇에는 수 란 관의 ampulla에서 MII oocytes를 수확.
- 4 단계로 진행 합니다.
4. oocyte Denuding 및 Zona Pellucida 제거
- 보충 3 mg/mL BSA 주변 적 운 세포 (2.5 mL/마우스)는 시계 유리, 37 ° C, 5% CO2에서 계속의 oocytes를 발가 벗기다 MEMα 매체에 hyaluronidase의 300 IU/mL를 준비 합니다.
참고: Hyaluronidase 효능 준비의 1 시간 후 급격히 감소합니다. MII oocytes hyaluronidase 치료 필요 하지 않습니다. - Oocyte-적 운 세포 단지 주변 적 운 세포의 oocytes를 발가 벗기다를 3 분 MEMα/BSA에 hyaluronidase의 300 IU/mL를 노출 합니다.
주의: 그것에 oocytes를 손상 것 이다 hyaluronidase, 노출 3 분을 초과 하지 마십시오. - Oocytes는 세척, 신선한 oocytes 전송 MEMα/BSA 중간 접시를 따뜻하게 합니다. 작은 입 운영 하는 유리 피 펫 또는 모 세관 (oocyte는 대략 90 µ m의 직경 보다 약간 큰)을 사용 하, 복합물을 플라스틱 하 고 적 운 세포를 완전히 분리를. 다음 단계를 위해 준비 하는 동안 인큐베이터에 복구 oocytes를 허용 합니다.
- 따뜻한 산 Tyrode의 솔루션, MEMα/BSA, 고 37 ° c (500 µ L/마우스) Waymouth의 미디어. 장소 300 µ L 작은 9 잘 유리 접시의 각 잘.
- Zona pellucida (ZP)를 제거 하려면 Tyrode의 솔루션으로 5-10 oocytes를 전송. 솔루션에만 30 ~ 45 s oocytes를 노출 합니다.
참고: 솔루션에 너무 작은 노출 제거 되지 않습니다는 ZP 완전히는 파열 및 확산에서 염색체는 oocytes를 방지할 것 이다. 너무 많이 노출 손상 하 고는 oocyte 죽 일 것입니다. 해 부 현미경 ZP 디졸브를 보고 노출 시간 최적화에 도움이 있습니다.
주의: 신선한 Tyrode의 솔루션을 사용 하는 중요 기능 나 이와 함께 감소입니다. Oocytes는 ZP의 균일 한 소화 되도록 치료의 각 그룹에 대 한 Tyrode의 솔루션의 신선한 잘을 사용 합니다. - ZP 제거 직후에 oocytes 따뜻하게 MEMα/BSA/FBS 매체에 전송 하 여 세척. 이 세 단계를 반복 합니다.
참고: 전송, oocytes 쉽게 뭉쳐 것과 유리 피 펫 또는 모 세관 다음 제거는 ZP의 다는 것을 조심 하십시오. 유리 피 펫 또는 모 세관 Waymouth의 중간에 미리 일로 함께 튀어나와 oocytes 최소화 됩니다. - 전송 및 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 Waymouth의 중간에 30 분 동안 복구 oocytes를 허용.
- 5 단계로 진행 합니다.
5. 미와 MII Oocyte Chromatin
- PAP 펜을 사용 하 여 그림 6A와 같이 유리 슬라이드에 11 x 44 m m2 사각형을 그립니다.
- 정착 액의 얇은 층으로 슬라이드 코트 (1 %paraformaldehyde, 0.2% H2O, pH 9.2 트리톤 X 100) 슬라이드에 정착 액의 100 µ L를 pipetting 앞뒤로 슬라이드 락을. 초과 정착 액의 제거를 누릅니다.
- 가능한 작은 미디어와 작은 입 피 펫 바늘 5-10 oocytes 사이 선택 하 고 끌어 바늘 줄에 고정 제-코팅 슬라이드 통 솔루션으로 슬라이드 위에 1 cm에서 oocytes를 입금 하는 동안. Oocytes는 입금 되었습니다 하 고 그들은 버스트 있다 해 부 현미경을 사용 하 여이 단계를 수행 합니다.
참고:는 oocytes 슬라이드에 즉시 폭발 한다. 높이 oocytes는 영향 chromatin 확산의 정도 입금. 자세한 내용은 그림 6 에 대표적인 결과 참조 하십시오. - 닫힌된 습도 챔버에 하룻밤 준수 chromatin 있도록 실 온에서 슬라이드를 품 어.
- 완전히 건조 린스 0.4% 일로 에이전트-H2O, pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 Coplin jar에 슬라이드를 슬라이드 수 있습니다.
- 6 단계로 진행 합니다.
6입니다. Immunolabelling
- 표 1에 설명 된 항 체 희석 버퍼 (ADB)를 준비 합니다.
- 워시 버퍼 (WB) 솔루션 (ADB PBS에 희석 10%)의 50 mL를 포함 하는 두 개의 Coplin 항아리와 50 mL WB와 0.05% 세제 솔루션을 포함 한 Coplin jar 준비 (예를 들어, 50 mL WB에 10% 세제의 250 µ L을 추가).
- 워시 슬라이드 섹션 1과 5 10 분 동안이 프로토콜의 WB의 50 mL를 포함 하는 하나의 Coplin jar에서에서 준비 했다.
주의: 슬라이드 immunolabelling 중 어느 시점에서 말리 게 하지 마십시오. - 워시 Coplin jar 포함 50 mL WB와 0.05% 세제 용액에서 10 분에 대 한 슬라이드. 그런 다음 나머지 Coplin jar 10 분에 대 한 WB 솔루션 50 mL를 포함 하는 슬라이드를 씻어.
- ADB에서 희석 하는 선택한 기본 항 체의 100 µ L 초과 액체와 커버 슬라이드 누릅니다. 닫힌된 습 챔버에 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
참고: 부 화 3 2 단축 될 수 있다 37 ° c.에 시간 취재는 coverslip 또는 parafilm으로 슬라이드 하 여 항 체 (예, 50 µ L)의 작은 볼륨을 사용 합니다. - 0.2% 일로 에이전트-PBS 솔루션, pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
- 6.2에서 6.5 단계를 반복 합니다.
- ADB에 희석 된 이차 항 체의 100 µ L 초과 액체와 커버 슬라이드 누릅니다. 슬라이드 2 1 품 어 닫힌된 습 실에서 37 ° C에서 시간.
- 워시 Coplin 단지 0.2% 일로 에이전트-PBS 솔루션, pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 10 분에 대 한 2 번 슬라이드.
- 워시 Coplin 단지 0.2% 일로 에이전트-H2O 솔루션, pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 5 분에 대 한 2 번 슬라이드.
7. 마운트 슬라이드
- 의향 chromatin 확산 단계 2에서에서 준비, 100 µ L 4', 6-diamidino-2-phenylindole를 포함 하는 설치 매체의 추가 (DAPI, 1.5µg / mL). 미와 MII chromatin에서 준비 단계 5 확산, 대 추가 DAPI를 포함 하는 설치 매체의 50 µ L (1.5µg / mL). 부드럽게 멀리 초과 액체를 되 리.
- 22 m m x 60 m m coverslip 위에 배치 하 고 명확한 매니큐어와 인감. 형광 현미경 검사 법을 통해 평가까지 4 ° C 또는-20 ° C에서 슬라이드 상자에 저장 합니다.
참고: 탭 커버 슬립에 가볍게 매니큐어와 씰링 전에 초과 설치 매체를 제거 합니다.
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결과
우리는 시각화 및 oocytes meiotic 염색체를 평가 대 한 두 가지 기법을 설명 했습니다. 첫 번째 기술은 배아 및 신생아 난소에 의향 진행 평가 쪽으로 음식을 제공 했었죠. 의향 chromatin 확산 준비 중 감수 분열, 페어링, synapsis 염색체를 포함 하 여 수많은 동적 프로세스를 시각화에 대 한 매우 귀중 한 하 고 desynapsis, 동종 재결합 하 고 개장 하는 epigenetic 염색체. 여기, 우리는 증명 하고있다 강력한 시각화에 대 한이 메서드의 유틸리티 및 oocytes C57BL/6J 배아에서 수확에 크로스 오버의 정량 분석 (그림 3B 및 3c). 셀 pachytene substage에 풍부 하 게 마우스 배아 18.5 dpc (그림 1)에서 검색 했다. 두 가지 ...
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토론
Chromatin 확산 준비 시간순으로 여성 포유류 감수 분열 및 관련된 단백질의 동적 지역화를 공부 하는 연구자를 수 있습니다. 배아 및 신생아 chromatin 스프레드 meiotic 의향에 걸쳐 이벤트의 가까운 분석 하실 수 있습니다. 분열 중 기 나 고 분열 II chromatin 스프레드 단일 자매를 구별 하는 데 사용 수에서 chromatids 쌍 자매 및 쌍된 동종 염색체 뿐만 아니라 ploidy 평가. 비교 함으로써, 여기서 설명 하는 프로토콜 수 유리한 자주 배경 신호 chromatin-바인딩 단백질의 해상도 감소 하는 높은 수준의 생성 전체 oocyte immunolabelling에 비해. 게다가, chromatin 확산 기법 라이브 셀 이미징, 시간 및 특수 장비의 큰 투자를 요구 하는 매력적인 대안을 나타냅니다.
배아 및 신생아 난소를 찾아서 추출 어려울 수 있습니다. 신중 하 게 다른 모든 장기와 난소에 대 한 검색 및 각 태아/강아지 (
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품 G.H. 하 세영 훈련 그랜트 화목에서 미국 국립 암 연구소 (NIH) (CA009110)와 NIGMS (R01GM11755) P.W.J에 의해 지원 되었다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10X 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4 | 품질 생물학적 | 119-069-161 | |
| 60mm x 15mm 페트리 접시 | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm 페트리 접시 | Denville | T1103 | |
| 미세 집게 | VWR | 300-050 | |
| 마이크로 해부 가위 | Ted Pella | 1340 | |
| 해부 가위, 날카로운 팁, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| 시계 유리 광장 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | 매번 사용하기 전에 오토클레이브 |
| 설탕 | 시그마 | S8501 | |
| 트리소듐 시트레이트 이수화물 | 시그마 | S1804 | |
| EDTA | 시그마 | E6758 | |
| 트리즈마 베이스 | 시그마 | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | 사용 직전 저장성 완충액에 추가 |
| 50x 프로테아제 억제제 | Roche | 11873580001 | 직전 저장성 완충액에 추가 |
| 바늘이 있는 Turberculin 주사기(1cc, 27G x 1/2인치) | Becton, Dickinson(BD) | 309623 | |
| 골드 씰 울트라 프로스트 유리 슬라이드(25X75mm, 두께 1mm) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP 펜, 대형 (액체 차단제) | 전자 현미경 과학 (EMS) | 71310 | |
| 16% 파라포름알데히드 수성 | 전자 현미경 과학 (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 원고 내 세제 |
| 면역 염색 수분 챔버 | 에버그린 | 240-9020-Z10 | |
| 코플린 항아리 | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | 원고의 습윤제 |
| 임산부 암말 혈관 성선 자극 호르몬 (PMSG) | Sigma | G4877 | -20C에서 부분 표본 저장 |
| 인간 융모성 성선 자극 호르몬 (HCG) | Sigma | C0434 | -20C에서 부분 표본 저장 |
| 9개의 오목한 공동이 있는 PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 매번 사용하기 전에 오토클레이브 |
| 유리 모세관 | Fisher | 22260943 | 난모 세포 수집 바늘 제작 |
| 브랜드 Parafilm M | Sigma | BR701501 | 난모 세포 수집 바늘 제작 |
| 용 라텍스 고무 튜브 (내경 3.2mm x 외경 6.4mm) | Fisher | 14-178-5B | 난모 세포 수집 바늘 제작 |
| 라텍스 고무 튜브 (내경 6.4mm x 외경 11.1mm) | Fisher | 14-178-5D | 난모 세포 수집 바늘 |
| 제작 용 유연한 실리콘 고무 노즈 피스, 단단한 플라스틱 마우스 피스 및 15 인치 라텍스 튜브 | Sigma | A5177-5EA | 난자 수집 바늘 |
| Mitutoyo 마이크로 미터 헤드 | Mituoyo | 150-208 | 난자 수집 바늘 제작 |
| 주사기 5 mL | BD Biosciences | 309646 | 난모 세포 수집 바늘 주 |
| 사기 필터 0.45 μ m 필터 | Corning | 431220 | 난모 세포 수집 바늘 제작용 |
| 유리 파스퇴르 피펫 5 3/4 " | Fisher | 13-678-6A | 난모 세포 수집 바늘 |
| 제작 83 x 0.5 mm 피펫 팁 | Denville | P3080 | 난모 세포 수집 바늘 |
| 제작 용 및 알파;-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth의 미디어 | Life Technologies | ||
| 소 태아 혈청 | 피셔 | A3160602 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | 시그마 | A3311 | 난모 세포 배양 매체 |
| 용 500ml 필터 유닛 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode ' s 솔루션 | Sigma | T1788 | -20C에서 부분 표본 저장 |
| 세럼 | Sigma | H-1270 | ADB/세척 완충액 |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma | A1470 | ADB/세척 완충액 |
| VECTASHIELD DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| 현미경 커버 슬라이드(22mmx60mm) | 가 | 12-544-G | |
| 투명 매니큐어 | 아마존 | N/A | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | 희석 계수 - 1:100 |
| 토끼 anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | 희석 인자- 1:1000 |
| 염소 항-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 희석 계수- 1:50 |
| 인간 항-중심체 단백질 | 항체 통합 | 15-235 | 희석 인자- 1:100 |
| 토끼 항-TOPOII | Abcam | ab109524 | 희석 인자- 1:100 |
| 마우스 항-히스톤 H4 (디 메틸 K20, 트리 메틸 K20) | Abcam | ab78517 | 희석 계수- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 희석 계수- 1:10,000 |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| 당나귀 안티 염소 IgG (H + L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | 희석 계수 - 1:500 |
| 당나귀 안티 마우스 IgG (H + L) Alexa Fluor 488 접합체 | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | 희석 계수 - 1:500 |
| 당나귀 안티 토끼 IgG (H + L) Alexa Fluor 647 접합체 | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | 희석 계수 - 1:500 |
| 염소 안티 마우스 IgG (H + L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | 희석 계수 - 1:500 |
| 염소 anti-Human IgG (H + L) 교차 흡착 된 2 차 항체, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | 희석 계수 - 1 : 500 |
| 염소 안티 토끼 IgG (H + L) Alexa Fluor 568 접합체 | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | 희석 계수 - 1 : 500 |
참고문헌
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- Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413(2014).
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- Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
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- Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
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- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
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