이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

환자에서 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립

13.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56767

⸱

2018년 4월 11일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Pathology Unit, Morgagni-Pierantoni Hospital, 3Unit of Surgery and Advanced Oncologic Therapies, Morgagni-Pierantoni Hospital

이 논문에서

요약

다음 프로토콜 환자 파생 된 연 조직 육 종 (STS)의 주 문화는의 설립에 집중 한다. 이 모델 분자 배경 및 약리 프로필 이러한 드문 악성 종양의 더 나은 이해를 우리를 도울 수 및 STS 관리를 개선 하기 위한 추가 연구에 대 한 출발점을 대표할 수 있었다.

초록

연 조직 sarcomas (STS) 어려운 진단, 분류 및 관리와 함께 다른 유형의 악성의 스펙트럼을 나타냅니다. 날짜 하려면,이 드문 단단한 종양의 50 이상 조직학 하위 확인 되었습니다. 따라서, 그들의 특별 한 다양성 및 낮은 발병 률,이 종양의 생물학의 우리의 이해 여전히 제한 됩니다. 환자 파생 문화 STS 이상과 약리학 연구에 이상적인 플랫폼을 나타냅니다. 우리는 따라서 종양 표본을 외과 절제술을 받은 환자에서가 걷이에서 시작 하는 STS의는 인간의 전 임상 모델을 개발 했다. STS 세포 배양 환자 파생 콜라 소화에 의해 수술 표본에서 얻은 고 여과 의해 분리. 셀 계산, 시드, 그리고 표준 단층 문화에서 14 일에 대 한 되었고 다운스트림 분석 처리. 분자 또는 제약 분석을 수행 하기 전에 STS 주 문화의 설립 cytomorphologic 기능, 그리고 가능한 경우, 평가 통해 확인 되었다 immunohistochemical 마커. 이 메서드는 1)이 제대로 탐험된 악성의 자연의 역사를 공부 하 고 2) 그들의 행동의 메커니즘에 대 한 자세한 노력에 다른 약물의 효과 테스트 하는 유용한 도구를 나타냅니다.

서론

모든 고체 종양1,2, 1%에 대 한 간 엽 기원 회계의 이질적인 장애의 스펙트럼을 포함 하는 부드러운 조직 sarcomas (STS) 그리고 이상의 50의 존재를 인식 하는 새로운 세계 보건 기구 분류 다른 하위3. 이 중, 가장 일반적인 histotypes 있으며 체형 육 종 또는 liposarcoma leiomyosarcoma, 15%와 모든 성인 STS, 각각4,5의 11%를 차지. STS는 신체의 다른 부분에서 개발할 수 있습니다, 비록 사지 그리고 retroperitoneum 60%와 20%의 경우, 각각6에서 발생 하는 가장 일반적인 사이트는.

지역화 된 질병에 대 한 치료의 초석은 넓은 외과 절제술, 보조 및 neoadjuvant 요법의 혜택은 아직 명확 하지 않다 고7선택 된 경우만 간주 됩니다. 전이성 설정에서 화학 요법 치료의 표준 이지만 제한 된 결과8를 보여줍니다. STS의 분자 생물학의 더 나은 이해는 현재 차별 진단 개선, 사용 가능한 치료를 최적화 하 고 치료를 위한 새로운 표적 식별에 도움이 될.

이 컨텍스트 내에서 불멸 하 게 셀 라인9를 사용 하 여 몇 년 동안 암에 대 한 연구를 수행 하고있다. 이러한 실험 모델 일반적으로 표준 단층 지원에 배양 또는 vivo에서 이 종이 식10모델 확립 immunodeficient 설치류에 이식. 불멸 하 게 셀 라인 관리 및 매장이 쉬운 자료를는 연구 실험의 충분 한 번호를 수행할 수 있습니다 나타냅니다. 그들은, 실제로, 가장 저렴 하 고 가장 널리 전 임상 연구11에 도구를 사용.

그러나, 셀 라인 기반 암 모델도 몇 가지 제한이, 구절의 증가 함께 단층 시스템에서 예: 연장 문화 유도 phenotypic 및 유전적 부동, 만들기에 정리 주요 종양을 적은 셀 기능입니다. 또한, 셀 라인 문화 셀 상호 작용 및 신호 분자 크로스 토크는 종양의 생물 학적 행동을 모방 하 고 종양 microenvironment 특성화를 재현 하지. 이러한 문제는 전 임상 및 임상 결과12사이 기존 하는 격차의 기초를 형성 합니다.

위의 감안할 때, 환자 파생 주 문화에 관심13을증가 했다. 실제로, 악성과 정상적인 직물의 절단 암 세포 표현 형 및 따라서 종양 microenvironment의 대표는 시작 물자를 제공 하 고이 잃기의 위험을 줄여줍니다. 또한, 외과 절제술을 받은 환자에서 수확 한 신선한 종양 견본의 사용 단일 종양을 조사 하 고 다른 병 변 환자의 몸14의 동일한 부분에서 비교 하 있습니다. 위의 이유로 조직 파생 셀 문화 종양 이상과 약리학15,16,17, 특히 어떤 상용 육 종 세포 라인에 STS를 연구 하는 귀중 한 자료를 제공 제한 된18있습니다. 우리는 따라서 환자 파생 STS 1 차 셀 문화 수술 삭제 종양 조직13,,1920에서 시작을 설정 하는 방법을 최적화 합니다. 우리의 방법 뒤에 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 하룻밤 효소 조직 분리 하는 작은 조직 조각으로 종양 견본 disaggregating 이루어져 있다. 다음 날, 효소 소화 신선한 문화 미디어를 추가 하 여 중지 되 고 얻은 서 스 펜 션 조직 파편, 셀 집계 및 초과 매트릭스 또는 파편을 제거 하도록 필터링 됩니다. 마지막으로, 격리 된 종양 세포의 일부분은 유리 슬라이드, 고정 및 cytomorphological, immunohistochemical 및 분자 cytogenetic 평가 STS 주 문화 설립을 확인 하기 위한 다운스트림 분석에 대 한 저장에 cytospinned (MDM2 증폭의예: 물고기 분석이 나타냅니다 잘 차별화 liposarcoma 및 dedifferentiated liposarcoma 표준 차별 진단을) 4. 나머지는 유전자 식 프로 파일링 및 약리 연구에 대 한 표준 단층 문화로 시드. 실험 낮은 사용 하 여 수행 됩니다 모든 구절을 피하기 위해 특정 암 subclones의 선택 주 문화 그리고 경험된 육 병리학 자에 의해 분석. 우리는 완전히 인간 STS ex vivo 모델13,19,20를 따라서 만들었습니다. 이 높게 다재 다능 한, 쉽게 핸들 모델의 전 임상 연구, 예를 들어 진단 및 예 후에 대 한 새로운 분자 마커를 식별 하거나 활동의 깊은 이해 및 메커니즘의 종류에 대 한 유용한 도구를 나타낼 수 STS의 관리에 사용 되는 표준 및 새로운 약물의 액션.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

STS 세포 대량 수술 환자 STS에서에서 excised 종양 으로부터 격리 됩니다. 프로토콜 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다 하 고 좋은 임상 연습 가이드라인과 헬싱키 선언에 따라 수행 됩니다. 모든 환자는 연구에 참여 하는 것 서 면된 동의 했다. 수술 표본 경험된 육 병리학 자에 의해 분석 하 고 수술의 3 시간 이내에 처리 됩니다.

1. 종양 표본 수집 및 처리:

  1. DMEM 낮은 포도 당 매체 파라핀 필름으로 밀봉의 50 mL를 100 mL 무 균 소변 용기에 육 병리학의 도움으로 종양 표본을 수집 합니다.
  2. 종양 절제 후 3 h의 최대 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
  3. 메 마른 조직 문화 후드 아래 모든 다음 단계를 수행 합니다.
    1. 70% 에탄올과 후드를 소독 하 고 멸 균 장갑을 착용.
    2. 70% 에탄올 (사용 멸 균 거 즈)와 철강 inox 족집게를 소독.
    3. 파라핀 영화 소변 컨테이너에서 제거 하 고 삭제.
    4. 70% 에탄올과 소변 컨테이너의 외부 세척.
    5. 광장 페 트리 접시를 엽니다.
    6. 소변 컨테이너를 열고 멸 균된 강철 inox 핀셋을 사용 하 여 사각형 페 트리 접시에 종양 견본을 전송 합니다.
  4. PBS와 종양 표본 두 번 씻는 다.
  5. 무 균 수술 메스를 엽니다.
    1. 1-2 m m3 조각으로 종양 표본을 잘게 잘게.
    2. 2 mL 튜브에 총 샘플의 1/4을 수집 합니다.
    3. Trizol 시 약 (구입) 튜브의 1 mL을 추가 하 고 즉시-80 ° C (샘플에에서 사용 됩니다 다운스트림 분석 STS 유전자 식 계산에 대 한)에서 동결.
  6. 15 mL 튜브에 가늘게 파쇄 된 종양 재료의 나머지를 수집 합니다.
    1. 콜라의 4 개 mL를 추가 유형 I 솔루션 (콜라 유형 내가 4 µ g/mL의 농도에서 PBS에 용 해).
    2. 희석 된 콜라 DMEM 높은 문화 미디어의 4 mL와 함께 솔루션 타입 (최종 농도 콜라 종류의 나는 2 µ g/mL).
    3. 15 mL 튜브 닫고 파라핀 영화와 함께 인감.
    4. 소화를 활성화 하기 위해 15 분 교 반 조건에서 37 ° c 배양 기에서 압 연 통에 15 mL 튜브를 넣어.
    5. 15 분 후 하룻밤 실 온에서 교 반 조건 아래 압 통에 튜브를 저장 합니다.
  7. 다음 날 살 균 후드 15 mL 튜브를 넣어.
  8. 부드럽게 50 mL 튜브의 상단에 연결 된 100 µ m 살 균 필터를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.
  9. 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 글루타민, 및 1% 페니실린/스 보충 DMEM 높은 문화 미디어 필터를 세척.
  10. 100 µ m 살 균 필터, 실 온에서 5 분 동안 50 mL 튜브 및 225 x g에서 원심 분리기를 닫습니다.
  11. 튜브를 거꾸로 하 여는 상쾌한을 삭제 합니다.
  12. 다시 1-2 mL DMEM 높은 문화 미디어 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 글루타민, 및 1% 페니실린/스 보충 셀을 일시 중단 합니다.
    참고: 볼륨 처리 종양 샘플의 크기에 따라 달라 집니다.
  13. Neubauer 챔버와 셀을 계산 합니다.
    1. Trypan 파랑의 1:2 샘플을 희석 하 고 희석의 10 µ L를 사용 하 여 셀의 개수.
    2. 두 번 이상 계산 하 고 셀 수집된의 평균 총 알아야 복제의 평균을 계산.
  14. 80000 셀/c m2의 조밀도에 표준 단층 문화에 플레이트 세포.
    참고: 항상 실험에 컨트롤을 포함 합니다. 각 조건에 대해 3 기술 복제를 수행 합니다. 2 생물 복제를 수행 합니다. 전 임상 약리학, 유전자 발현 및 단백질 표정 분석, 실험 한다 실시 문화 통로의 낮은 수와 함께 셀 손실 암 세포 고기를 뿌리기의 30-45 일 이내.
  15. Cytological 샘플 준비입니다.
    1. DMEM 높은 문화 미디어 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 글루타민, 1% 페니실린/스와 보충의 200 µ L에 100000 세포를 수집 합니다.
    2. 피펫은 일회용 깔때기로 솔루션 (200 µ L 피 펫) 필터를 장착 하 고 유리 슬라이드와 함께 탑재.
    3. cytocentrifuge를 열고 예제를 삽입 합니다.
    4. 18.6 x g 20 분에 cytocentrifuge를 실행 합니다.
    5. 필터를 장착 하는 깔때기를 삭제 합니다.
    6. 10 분 뒤에 5 분에 대 한 클로 프롬 아세톤에 슬라이드를 수정.
    7. -20 ° c.에 슬라이드 저장
      참고: 해 동 하 고 얼룩이 지기 전에 샘플 화 얼룩 제조업체의 지침에 따라 수행. 3 기술 복제를 준비 합니다.

2. STS 세포 배양:

  1. 일주일에 한 번 (DMEM 높은 문화 미디어 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 글루타민과 1% 페니실린/스 보충) 미디어를 변경 합니다.
    1. 200-1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 문화 매체를 버리십시오.
    2. 200-1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 새로운 신선한 매체를 추가 합니다.
    3. 셀 통로:
      1. 합류는 약 90% 세포 분리:
        참고: STS 셀 문화 증폭 문화 조건에 따라 일주일에 한 번 수행 되어야 한다.
      2. 폐기 매체, PBS로 세척 및 트립 신 1의 2-3 mL를 추가 PBS에 x
        참고: 트립 신 사용의 볼륨 얻은 배양된 세포의 크기에 따라 달라 집니다.
      3. 37 ° c.에 3-5 분에 대 한 셀을 품 어
      4. 200-1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 접시에서 분리 된 세포를 수집 합니다.
      5. 15 mL 튜브로 분리 된 세포를 플라스틱 고 DMEM 높은 문화 미디어 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 글루타민, 효소 반응을 중지 하 1% 페니실린/스와 보충의 4 mL를 추가 합니다.
      6. 실 온에서 5 분에 대 한 225 x g에서 원심.
      7. 폐기는 상쾌한.
      8. 다시 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 글루타민, 및 1% 페니실린/스 보충 DMEM 높은 문화 미디어의 1 mL을 추가 하 여 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
      9. 새로운 문화 접시 또는 제조업체의 지침에 따라 최종 볼륨을 플라스 크에 세포 씨앗
        참고: 1:3 보다는 더 많은 세포를 분할 하지 않습니다.

3. 다운스트림 분석:

참고: 다른 실험의 다양 한 밖으로이 모델 (아래 참조)를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그것은, 그러므로, 연구의 설계 단계는 분석 샘플 및 복제의 충분 한 숫자를 준비할 수 있도록 수행 됩니다 결정 하는 중요 한.

  1. MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드 등 확산 분석 실험
  2. Apoptotic 분석 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 (TdT) 같은 닉 끝 라벨 (TUNEL) 분석 결과
  3. Immunohistochemical 분석
  4. 유전자 표정 분석
  5. 서쪽 오 점 분석
  6. ELISA 분석 결과
  7. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 분석
  8. 이 종이 식 모델 vivo에서

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

우리 설계 환자 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립 여기 한 특정 STS histotype13에서 얻은 결과의 예를 보고 하는 간단한 방법. 프로토콜, 잘 분화 liposarcoma를 포함 하 여 다른 STS histotypes의 기본 문화의 설립을 위해 사용 되었다 liposarcoma, myxoid liposarcoma, pleomorphic liposarcoma, myxofibrosarcoma, undifferentiated dedifferentiated pleomorphic 육 종, 요점, 및 desmoid fibromatosis입니다.

주 문화의 설립에 대 한 성공률 수술 표본 환자 화학 요법, 방사선 요법으로 치료 또는 치료 하지에서 파생 된에 대 한 54% (24 STS 외과 샘플에서 13 주 문화)를...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

잘 정의 된 전 임상 모델 종양의 분자 배경 명료, 가난한 예 후를 예측 하 고 암 환자에 대 한 새로운 치료 전략을 개발 필요 합니다. 이것은 특히 STS 등 희귀 한 종양에 대 한 중요 한 형태에서 그 높은, 공격적인 잠재적인, 및 임상 행동 STS 생물학 및 환자 관리21의 우리의 이해에 도전. 또한, 사용할 수 있는 몇 가지 상업 육 종 셀 라인 엽 종양18의이 그룹에 대 한 전 임상 조사를 제한 합니다. Ex vivo 모델 따라서 STS에 대 한 귀중 한 연구 리소스를 나타냅니다. 우리는 모델을 완벽 하 게 인간의 체 외에 수술로 절제 종양 조직 (그림 3)에서 시작 하는 STS의 개발. 방법의 최적화 하는 동안 몇 가지 중요 한 문제는 해결 되었고 해결. 첫 번째 문제 우려 수술 치료 및 샘플 처리 사이 시간 간격. 처음에, 종양 표본을 특정 시간 후에 우리의 생물 과학 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

감사의 글

저자 편집에 Gráinne Tierney를 감사 하 고 싶습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM 고포도EuroCloneECB7501L
소 태아 혈청EuroCloneECS0180D
GlutamineGibco25030-024
Paraformaldehyde 4% 수용액, EM 등급전자 현미경 과학157-4-100
페니실린 스트렙토마이신Gibco15140122
Triazol 시약Ambion Life-Technologies15596018
TrypsinEuroCloneECB3052D
당

참고문헌

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
  2. Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
  3. Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
  4. De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
  5. Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
  6. Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294(2011).
  7. Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
  8. The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).
  9. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  10. Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
  11. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
  12. Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
  13. De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662(2016).
  14. Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
  15. Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
  16. Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
  17. Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313(2008).
  18. Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
  19. Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309(2017).
  20. De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
  21. Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
  22. Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
  23. Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
  24. Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
  25. Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
  26. Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
  27. Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
  28. Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313(2008).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

MDM2
환자에서 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.