Method Article

유기체 살충제에 노출된 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하기 위한 실험 프로토콜

DOI:

10.3791/56800

⸱

September 16th, 2020

 ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Institute of Toxicology, Nanjing Medical University, 2Key Laboratory of Modern Toxicology of Ministry of Education, School of Public Health, Nanjing Medical University, 3Center of Gallbladder Disease, Shanghai East Hospital, Institute of Gallstone Disease, Tongji University School of Medicine

In This Article

Summary

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간세포에서 미토콘드리아 기능에 대한 환경 유기염소농약(OCP)의 영향을 이해하는 것은 대사 장애를 일으키는 OCP의 메커니즘을 탐구하는 데 중요합니다. 이 논문은 간 미토콘드리아 기능을 검출하는 방법에 대한 자세한 방법을 제시합니다.

Abstract

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이 논문은 간세포에서 환경 유기염소 살충제 (OCP)로 인한 대사 장애의 원인을 더 잘 이해하기 위해 간 미토콘드리아 기능을 검출하는 방법에 대한 자세한 방법을 제시합니다. HepG2 세포는 β-헥사클로로시클로헥산(β-HCH)에 24시간 동안 일반 집단에서 내부 노출의 동등한 용량으로 노출되었다. 간세포내의 초구조는 미토콘드리아의 손상을 나타내기 위해 전염 전자 현미경 검사(TEM)에 의해 검사되었다. 미토콘드리아 기능은 β-HCH로 배양된 HepG2 세포에서 미토콘드리아 형광 강도, 아데노신 5'-triphosphate(ATP) 수준, 산소 소비율(OCR) 및 미토콘드리아 막 전위(MMP)에 의해 추가적으로 평가되었다. 미토콘드리아 녹색 형광 프로브에 의해 염색된 후 미토콘드리아 형광 강도는 형광 현미경검사로 관찰되었다. 루시페린 루시파라제 반응은 ATP 수준을 결정하는 데 사용되었다. MMP는 양이온염 JC-1에 의해 검출되고 유동 세포측정하에 분석되었다. OCR은 세포외 플럭스 분석기로 측정되었다. 요약하자면, 이러한 프로토콜은 미토콘드리아 손상을 조사하기 위해 간세포에서 미토콘드리아 기능을 검출하는 데 사용되었습니다.

Introduction

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생식 간섭, 면역 독성, 대사 변화 등 건강에 대한 유기염소살충제(OCP)의 효과는 이전에1,,2,,3을연구하였다. 세포 대사를 감지하고 미토콘드리아 기능 장애를 알아내는 방법은 과학자들이 미토콘드리아기능(즉)역할을 이해할 수 있게 해 주었다. , 미토콘드리아 STAT3 수준, 젖산, 피루바테, 젖산염-피루바테 비율, 코엔자임 Q10, 미토콘드리아 양성자 누출, 생체 에너지, 생체 발생, 심혈관 기능, 암 및 안전 독성4,,55,6,,7. 이 논문에서는 OCP에 의한 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 방법을 설명합니다.

우리는 HepG2 세포를 β-헥사클로로클로헥산(β-HCH)에 노출시켰다( β-HCH), 하나의 대표적인 OCP, 24h는 인간의 내부 노출에 상응하는 용량으로. 먼저, TEM은 핵, 미토콘드리아 및 내피....

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Protocol

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모든 실험과 실험 프로토콜은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었으며 난징 의과 대학의 지역 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. TEM에 의한 미토콘드리아 초구조

  1. HepG2 세포 수집
    1. 100mm 접시에 씨앗 HepG2 세포. 37 °C 및 5 % CO2에저장합니다.
    2. 1.5 mLEP 튜브에서 0.25 % EDTA로 세포를 소화합니다.
    3. 실온(RT)에서 3분 동안 1000 x g의 원심분리기. 상부체를 폐기합니다.
    4. 4-6 x 105 HepG2 셀을 수집합니다.
  2. 파이펫과 함께 5% 글루타랄데히드(용매: 이중 증류수)의 1mL을 넣고 4°C에서 2시간 동안 배양합니다.
  3. 인산염 완충제 1mL의 4가지 변경 사항(Na2HPO4,KH2PO4,NaCl 및 KCl, pH 7.4 포함), 각각 15분으로 세척합니다. 파이펫으로 인산염 버퍼를 빨아.
  4. 1% 오스뮴 (용매 : 이중 증류수)의 200 μm을 추가하고 검은 색 샘플에 대한 2 시간 4 ° C에서 배양.

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Results

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β-HCH에 노출된 HepG2 세포의 미토콘드리아 크리스테가 현저하게 손상되었다. 산란된 미토콘드리아는 약간 팽창하여 불규칙한 모양으로, 미토콘드리아 능선은 비교적 비정상적인 미토콘드리아아키텍처(도 1)로사라졌다.

미토콘드리아를 나타내는 평균 미토콘드리아 녹색 형광 강도는 β-HCH(도2)에노출된 HepG2 세포뿐만 아니라 ATP 수준(도3)에서감소하였다. 형광 강도와 ATP 수준은 노출 농도가 증가함에 따라 서서히 감소했습니다. 잠재적으로, 미토콘드리아 수의 감소, 또는 손상된 미토콘드리아, 관찰된 미토콘드리아 형광 강도를 일으키고, 결과적으로 ATP의 생산이 감소되었다.

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Discussion

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검출 프로토콜의 성공에 중요한 것은 표현형에서 메커니즘에 이르는 연구를 다루어온 다양한 실험 적 방법의 사용입니다. 이 연구에서, HepG2 세포는 페니실린과 연쇄상 구균 및 10% 태아 소 혈청으로 DMEM에서 배양되었습니다. 세포가 40-50% 합류에 도달하면 β-HCH(0, 10, 100 ng/mL)를 24시간 동안 첨가하고 배양하였다. 먼저 대표적인 OCP, β-HCH에 의한 간세포의 초구조적 변화를 보여 미토콘드리아 구조의 손상을 나타내는 TEM을 사용했다(도1)). 더욱이, 형광 염색 분석서(도2),루시파아료-루시페린 ATPFigure 2 (분석(도 3)), JC-1

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (그랜트 Nos. 81573174, 81570574)에 의해 지원되었다; 장쑤성 우수 청년기금(SBK2014010296); 중국 교육부 연구 프로젝트 (213015A); 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학술 프로그램 개발 (PAPD), 강서 고등 교육 기관의 주력 주요 개발; 및 환경 화학 및 생태 독성학의 국가 핵심 연구소의 오픈 프로젝트 프로그램 (KF2015-01).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
투과 전자 현미경 FEITecnai G2 Spirit Bio TWIN고대비, 고해상도 이미징, 저선량 관찰 및 이미징, 저온 관찰, 뛰어난 분석 성능, 편의성과 성능을 위한 자동화
Mito-Tracker GreenBeyotimeC1048Mito-Tracker Green은 라이브 셀 미토콘드리아 특이적 형광 염색에 사용할 수 있는 미토콘드리아 녹색 형광 프로브입니다.
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경Zeiss700B디자인은 컴팩트하고 안정적이며 광 경로는 가장 짧고 높은 광 정밀도, 창의적인 기술 및 정교한 스캐닝 기술을 결합하여 완벽한 3차원 표본 이미지를 생성합니다.
Enhanced ATP Assay KitBeyotimeS0027Enhanced ATP Assay Kit는 일반적인 용액, 세포 또는 조직에서 ATP(아데노신 5'-트리포스페이트) 수치를 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 세포와 조직 샘플을 분할하여 샘플 준비를 완료할 수 있으며 최대 0.1nmol/L의 검출 감도, 화학 발광을 30분 동안 유지할 수 있습니다.
광도계BertholdCentro LB 960광도계는 화학발광 검출기이며 테스트 샘플 자체가 가벼울 수 있으며 자극할 필요가 없습니다. 광도계는 화학발광을 감지하는 기기입니다.
BCA 단백질 분석 키트BeyotimeP0012BCA 단백질 분석 키트는 단백질 농도를 감지하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다.
멀티모드 리더TECANInfiniteM200멀티모드 리더는 단백질 동의를 감지하는 데 사용됩니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79(2015).
  2. Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated ....

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