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방법 논문

Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes

10.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56802

⸱

2017년 12월 6일

 , 
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

이 논문에서

요약

이 원고 X를 생성 하는 자세한 방법을 제공-염색체 팔 프로브 및 수행 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 자매의 상태를 검사 하 chromatid 응집력 prometaphase 및 를 체포 하는 분열 초파리 oocytes. 이 프로토콜은 meiotic 팔 단결력은 그대로 또는 다른 genotypes에 방해 여부 결정 하는 데 적합 합니다.

초록

인간에서는, oocytes에서 염색체 분리 오류 유산 및 기형 아 출산의 대부분에 대 한 책임이 있습니다. 또한, 여자 나이, 그들 마음속에 aneuploid 태아는 극적으로 증가 하 고이 현상의 위험 모성 연령 효과로 알려져 있다. Meiotic 분열 동안 정확한 염색체 분리에 대 한 요구 사항 중 하나는 자매의 유지 보수 oocytes 경험 확장된 의향 기간 chromatid 단결력. 인간 및 모형 유기 체에서 cytological 증거 meiotic 단결력 노화 과정 동안 악화 나왔다. 또한, 인간의 oocytes에서 분리 오류는 감수 분열 중 가장 널리 퍼진 나 팔 단결력의 조 손실와 일치. 모델 생물의 사용은 기초가 단결력의 연령에 따라 손실 메커니즘을 탈피 중요 합니다. 초파리 melanogaster oocytes meiotic 응집력의 규칙을 공부에 대 한 몇 가지 장점이 있습니다. 그러나, 최근까지, 유전 시험만 팔 응집력 oocytes 다른 genotypes 또는 다른 실험 조건에서의 손실에 대 한 분석 결과를 사용할 수 없었습니다. 여기, 상세한 프로토콜 형광에서 제자리에서 사용 하기 위한 교 잡 (물고기)을 직접 시각화 결함 prometaphase 팔 응집력에 나 고 분열 초파리 oocytes를 체포 하는 제공 됩니다. X 염색체의 원심 팔 hybridizes를 물고기 프로브를 생성 하 여 수집 하는 confocal Z 스택 연구원 수 3 차원에서 개별 물고기 신호의 수를 시각화 하 고 자매 여부 결정 chromatid 무기 분리. 설명한 팔 단결력 결함 초파리 oocytes의 수백에 계량을 가능 하 게. 따라서,이 방법은 단결력 유지 보수 뿐만 아니라 노화 과정의 죽음으로 이어질 요인에 기여 하는 메커니즘을 조사는 중요 한 도구를 제공 합니다.

서론

유사 분열, 감수 분열 동안 염색체의 적절 한 분리 필요 그 자매 chromatid 단결력, 유지, 설립 될와 조정된 패션1,2에 발표. 단결력 S 단계 설정 되 고 복잡 한, 자매는 실제 관계를 형성 하는 cohesin에 의해 중재 chromatids 함께. 감수 분열에서 결합 한 크로스 오버를 원심 또한 함께 재조합 homologs를 기능과이 실제 협회를 통해 올바른 방향이는 분열에의 나는 (그림 1)3,4, 스핀 들 5. 팔의 릴리스 anaphase에 응집력 나 반대 스핀 들 극을 분리 하는 homologs 수 있습니다. 그러나, 팔 단결력은 경우 중간, 손실 재조합 homologs 그들의 물리적 연결을 잃게 되며 임의로, 분리는 aneuploid gametes (그림 1)에서 발생할 수 있습니다.

인간의 oocytes에서 염색체 분리에 오류 유산 및 기형 아 출산, 다운 증후군6, 등의 주요 원인이 되며 그들의 발생 산 모 나이7기 하 급수적으로 증가. 자매 chromatid 단결력 태아 oocytes에서 설정 되 고 meiotic 재결합 출생 하기 전에 완료 됩니다. Oocytes 다음 체포 중간 의향에 나 배 란까지 고이 체포 하는 동안, 재조합 homologs의 지속적인된 물리적 협회 의존 자매 chromatid 단결력. 따라서, 감수 분열과 정상 임신 결과 정확한 분리 결합 최대 5 년간 그대로 유지 해야 합니다.

인간의 oocytes의 장기간된 meiotic 체포 중 응집 조 손실 모성 연령 효과에 기여할 제안 되었습니다와 증거의 여러 줄이 가설8,9를 지원 합니다. 그러나,이 현상의 우리의 이해의 대부분 모델 생물5,10,,1112, 를 사용 하 여 의존 인간의 oocytes meiotic 응집력의 과제를 감안할 때, 13,,1415.

초파리 melanogaster oocytes meiotic 응집과 염색체 분리의 연구에 대 한 수많은 이점을 제공합니다. 간단한 유전자 분석 결과 수 aneuploid gametes에서 자손을 복구 하 고 X의 충실도 측정-대규모11,,1617에 염색체 분리. 또한, 하나 또한 나 팔 단결력11,18, 의 조 손실에 일치 하는 표현 형 감수 분열 시 재조합 homologs missegregate 때문에 염색체 분리 오류 발생 여부를 결정할 수 있습니다 19. 초파리 oocytes meiotic 응집력의 상태 관찰은 또한 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 직접. 비록 반복적인 위성 시퀀스에 교배 하는 형광 oligonucleotides 사용 되었습니다 10 년 이상 모니터링 성숙 초파리 oocytes4,20, 팔의 분석에서에서 pericentromeric 결합 하 단결력은 더욱 어려운 되었습니다. 팔 단결력의 상태 시각화 단일 복사본의 큰 영역에 걸쳐 프로브 시퀀스 이며 충분히 밝은 결과 개별 여동생에 대 한 표시 신호 chromatids 팔 단결력은 결 석 하는 경우 필요 합니다. 또한, oocyte 고정 조건 및 레이블이 지정 된 DNAs의 크기 큰 성숙한 초파리 oocyte (200 µ m 넓은 500 µ m 길이 의해)에 침투21 를 촉진 해야 합니다. 최근, 한 팔 조사는 성공적으로 활용, 하지만 저자 anaphase 동안 초파리 oocyte chromatids를 시각화 하기 위해 명시 된 그들은 prometaphase에 신호를 감지 하지 못했습니다 또는 분열 oocytes22를 체포. 여기 우리는 X의 생성에 대 한 자세한 프로토콜 제공-염색체 팔 물고기 조사 조건과 oocyte 준비 나 하 고 분열 chromatid 응집력 prometaphase 언 니의 조기 상실에 대 한 분석 결과 허용 난 oocytes. Meiotic 단결력의 유지 보수에 필요한 유전자 제품을 사용, 이러한 기술을 동생에 대 한 분석 결과를 다른 수 chromatid 단결력 다른 genotypes의 성숙한 초파리 oocytes에 결함.

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프로토콜

1입니다. 준비

  1. 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)에 대 한 솔루션을 준비 합니다. 초순 수를 사용 하 여 모든 솔루션을 준비 합니다.
    1. 5 수정 Robb의 버퍼 배 준비: 275 mM 칼륨 아세테이트, 아세트산 나트륨 200 m m, 500mm 자당, 50 m m 포도 당, 염화 마그네슘 6 m m, 5 m m 염화 칼슘, 500 mM HEPES pH 7.4 =. PH 7.4 10 N NaOH를 사용 하 여가지고. 필터를 소독 하 고-20 ° c.에 저장 해 동 하 고 필요에 따라 1 x 희석-20 ° c.에 1 x aliquots를 저장
    2. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 1.3 M NaCl, 70 m m 나2HPO4, 30 mM NaH2포4를 사용 하 여 x 10을 준비 합니다. 7.0 10 N NaOH를 사용 하 여 pH를가지고. 압력가 마로 소독 또는 필터 살 균, 소독.
  2. 폴 리-L-리 신 coverslips 1 일 준비 필요 하기 전에.
    1. 플라스틱 70% 에탄올 18 m m x 18 m m #1.5 coverslip의 표면에 1% 염 산을 포함 하 고 5 분 액체를 제거를 사용 하 여 진공 포부를 품 어. 불 임 초순와 반복. 0.1 mg/mL 폴 리-L-리 신으로 coverslip의 표면을 커버 하 고 10 분 동안 품 어.
    2. 액체를 제거 하 고 10 분 저장소 coverslips 폴 리-L-리 신 쪽 먼지를 피하기 위해 꽉 끼는 뚜껑 플라스틱 용기에 대 한 건조 한 공기를 발음.
  3. 가져온된 파스퇴르는 oocytes를 제거 하지 않고 액체 솔루션을 제거 하는 펫 준비. 분 젠 버너 불꽃 위로 당기면 부드럽게 각 끝에 유리와 녹아 떨어져 끌 때까지 긴 유리 파스퇴르 피 펫의 중간 열.

2입니다. 생선 팔 프로브 생성

참고: 모든 원심 분리기 단계 ~ 16000-21000 x g (대부분 가기 테이블 microcentrifuges에 최대 속도)에 수행 됩니다. 5-15 미 소용돌이 나타냅니다 ~ 15에 대 한 vortexing에 대 한 간략 한 원심 분리기 회전 회전을 나타내는 s 맥스에서 별도로 명시 하지 않는 한 속도.

참고: BACs 팔 프로브에 대 한 BAC PAC 자원에서 얻을 수 있습니다. 2 개의 X 염색체의 euchromatic 팔 프로브가이 방법으로 성공적으로 사용 되었습니다. 한 팔 프로브 구성 되었다 6 개의 BAC 클론의 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11) 밴드에 cytological에 해당. 하 cytological 밴드 2 층-3 C (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13)에 해당 하는 6 개의 BAC 클론 다른 팔 조사에 의하여 이루어져 있다. BACs 지역에서 찾아볼 수 있습니다 다른 초파리 염색체에: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. X 염색체의 359 bp 위성 반복을 인식 하는 2 개의 pericentric 프로브는이 방법으로 성공적으로 사용 되었다. 22 뉴클레오티드 프로브 광범위 하 게 사용 되 고 (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23를 작용 한다. 28 뉴클레오티드 프로브 테스트 최근 고도 작용 (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. HPLC 정화 oligonucleotides 5' 특정 fluorophore 표시 명령 했다 (예를 들어, 통합의 DNA 기술) 상업 소스에서.

  1. BAC 클론 DNA 키트 재료의 테이블에에서 지정 된 지침에 따라 준비. 200 µ L 테;에 문화의 100 mL에서 얻은 DNA 펠 릿 resuspend 최종 DNA 농도 BAC 클론에 따라 5-40 ng / µ L 사이 배열 해야 한다.
  2. 증폭 키트를 사용 하 여 재료, 테이블과 다음 프로토콜에 지정 된 대로 각 혈에 대 한 DNA 증폭을 수행 합니다. 각 복제본에 대 한 BAC DNA를 개별적으로 처리 합니다. 효소 및 단계 2.2.3 통해 2.2.1 키트와 함께 제공 된 버퍼를 사용 합니다.
    1. BAC DNA의 임의의 분열: 각 혈 중 알코올 농도를 사용 하 여 테 10 µ L 200 µ L PCR 튜브에 1 ng / µ L DNA 솔루션의 준비. 10 X 조각화 버퍼의 1 µ L를 추가 합니다. 튜브 PCR 기계에 정확히 4 분 동안 95 ° C에 즉시 차가운 얼음 물에 샘플 놓고 짧게 원심. 보육 시간에 민감한 이며 어떤 편차 결과 변경할 수 있습니다.
    2. 라이브러리 준비
      참고:이 방법은 amplifiable 파편의 라이브러리를 생성 하기 위해 임의의 뇌관 사용.
      1. 튜브를 포함 하는 DNA 다음 추가 합니다: 라이브러리 준비 버퍼, 라이브러리 안정화 솔루션의 1 µ L x 1의 2 µ L. Vortexing에 의해 철저 하 게 혼합, 짧게, 원심 및 튜브 PCR 기계에 2 분 동안 95 ° C에 즉시 차가운 얼음 물에 샘플 놓고 짧게 원심.
      2. PCR 튜브, 믹스, 그리고 분리기를 간단히 라이브러리 준비 효소의 1 µ L를 추가 합니다. 장소 PCR PCR 기계에 튜브와 같이 품 어: 20 분, 20 분, 20 분, 75 ℃ 5 분 동안 37 ° C 24 ° C에서 16 ° C는 다음 4 ° c.에서 개최
      3. PCR 기계에서 샘플을 제거 하 고 짧게 원심. 샘플 즉시 증폭 또는-20 ° C에서 최대 3 일 동안 저장 될 수 있습니다.
    3. BAC DNA 도서관의 확대
      1. 전체 15 µ L 임의 조각 반응에 다음과 같은 시 약을 추가: 증폭 마스터 믹스, 47.5 µ L x 7.5 µ L 10 Nuclease 무료 물, 5 µ L WGA DNA 중 합 효소. Vortexing에 의해 철저 하 게 혼합 하 고 짧게 원심.
      2. 장소 PCR PCR 기계에 튜브와 같이 품 어: 3 분, 15에 대 한 변성 94 ° C에서의 14 주기 초기 변성 95 ° C s, 5 분, 65 ° C에서 어 닐 링/확장명 다음 4 ° c.에서 개최
      3. 자전거 완료 되 면, DNA 농도 분석 결과. DNA의 농도 최소 이어야 한다 ng / µ L. 4 ° C에서 유지 견본 또는-20 ° C까지에 게 소화에 대 한 준비. 필요한 경우, 400를 실행 하 여 DNA 조각 크기를 평가 2 %agarose 젤에 DNA의 ng. 200에서 조각 다양 혈압 3 kb (그림 2).
  3. 증폭 된 DNA의 금지 효소 소화
    1. 1.5 mL microfuge 관에서 이전 섹션에서 증폭 된 DNA의 장소 20 µ g. Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, BfuCl, 0.5 µ L 100 x BSA, 금지 효소 소화 버퍼, x 5 µ L 10의 25 단위, 20 단위를 추가 하 고 초순 H2o.의 적절 한 금액을 추가 하 여 50 µ L에 양을 맞추십시오
    2. 뚜껑에 응축을 방지 하기 위해 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 다이제스트를 품 어. 에탄올 침전 소화 DNA. 다이제스트에 추가: 1 µ L glycogen, 1/10 볼륨 3 M 나트륨 아세테이트, 2.5 볼륨 100% 분자 학년 에탄올. -80 ° C 1 시간 또는 하룻밤에서 품 어.
    3. 4 ° c.에 30 분 동안 원심 분리기 객실 온도 70% 에탄올과 스핀 4 ° c.에서 5 분의 1 볼륨 씻어 DNA 펠 릿 제거는 상쾌한 고 펠 렛 건조 공기 또는 공기의 꾸준한 부드럽게 건조 DNA.
    4. 36 µ L 살 균 초순 H2O DNA 펠 릿을 resuspend 하 고 DNA의 1 µ L를 사용 하 여 약 285 이어야 한다 DNA 농도 분석 결과 ng / µ L.-20 ° c.에 DNA 저장
    5. 선택적으로 DNA 조각 크기 400 실행 평가 2 %agarose 젤에 DNA의 ng. 대부분 조각 500 약해요 신호 100-200 bp에서 다양 bp (그림 2).
  4. 3 ' 미행 반응
    1. 열 블록에 1 분에 100 ° C에서 소화 DNA 변성 바로 얼음 물에 침착 해. DNA의 35 µ L를 다음 추가 합니다: 50 µ L 400 m m 나트륨 cacodylate, 1 µ L 10 mM DTT, 그리고 소용돌이 잘. 4 µ L 25 mM CoCl2, 2.5 µ L 2 m 5 m-(3-aminoallyl)-dUTP 라벨 키트 5 x TdT 버퍼, 그리고 1 µ L 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 (TdT) 400 U 재료, 5 µ L 1 m m dTTP, 18 µ L의 테이블에 지정 된 ARES에서 추가 / µ L. 소용돌이 짧게 원심 분리기.
      주의: CoCl2 독성, 적절 한 보호를 착용.
    2. 결로 방지 하기 위해 인큐베이터에서 37 ° C에서 2 시간에 대 한 품 어. 250 mM EDTA 반응과 소용돌이를 섞어 잠시 중지의 1 µ L를 추가 합니다. 에탄올 (단계 2.3.2-2.3.4) 위에서 설명한 대로 꼬리 DNA를 침전. Resuspend 10 µ L 살 균 초순 H2o. 저장소에에서 말린된 DNA 펠 릿 DNA-20 ° C에서 계속 하 준비까지.
  5. 형광 염료 활용 자료 테이블에 지정 된 대로 DNA 라벨 키트를 사용 하 여 수행 합니다.
    참고: 염색 추가 되 면 어둠 속에서 샘플을 계속.
    1. 열 블록에 5 분 동안 95 ° C에서 꼬리 DNA 변성 즉시 차가운 DNA 얼음 물과 원심 분리기에 짧게. 키트의 지침에 따라 라벨 버퍼를 준비 하 고 각 DNA 샘플을 6 µ L를 추가 합니다. 키트에서 DMSO의 4 µ L에 염료의 각 튜브를 resuspend. 소용돌이 짧게 원심 분리기.
    2. 염료에의 한 튜브를 사용 하 여 각 라벨 반응에 대 한. 짧게 DNA, 소용돌이, 그리고 원심 분리기에 염료 솔루션을 추가 합니다. 어둠 속에서 2 h에 대 한 실 온에서 라벨 반응을 품 어. 추가 3 M hydroxylamine 77 µ L nuclease 무료의 뒤 반응을 중지 하의 3 µ L H2O 키트에서. 소용돌이 짧게 원심 분리기.
  6. 자료의 테이블에 지정 된 대로 PCR 정화 키트를 사용 하 여 비 활용 된 염료를 제거 합니다. 제조업체의 지침을 따릅니다. 두 번 40 µ L 차입 버퍼의 각 시간을 사용 하 여 열에서 DNA을 elute.
  7. 에탄올 침전 이전 설명 레이블이 DNA (단계 2.3.2-2.3.4). 10 µ L 차입 버퍼에 말린된 DNA 펠 릿을 resuspend.
  8. 프로브 혼합물 준비
    1. 레이블이 지정 된 dna pmol / µ L에 형광 색소 염료의 농도 결정 합니다. Fluorophore 농도 30-100 pmol / µ L, BAC 따라에서 범위 수 있습니다. DNA 농도 300-800 ng / µ L에서 범위 수 있습니다.
      참고: microarray 설정은 microvolume 분 광 광도 계, 자료의 테이블에 지정 된 것과 같은 잘 작동 합니다. Microarray 창에서 DNA-50을 선택 하 고는 형광 색소를 지정 합니다.
    2. 아데닌 양의 (pmol fluor) 각 BAC 프로브를 결합 하 여 믹스 마스터를 만듭니다. 결합 하기 전에 소용돌이 30 s. 냉동/해 동 주기를 방지 하려면 마스터 믹스의 aliquots을 준비, 파라핀 필름 증발을 방지 하 고-20 ° c.에 어둠에 저장 튜브 적용
      참고: 포함 하는 각 6 개별 BAC의 250 pmol mastermix 프로브는 30-50 µ L 작품의 전체 볼륨에 잘 합니다. 각 혈에 대 한 25 pmol (형 석)을 포함 하는 약 수 0.31 pmol 형 석 / µ L 각 혈에 대 한 최종 조사 농도로 두 40 µ L 교 잡 반응에 대 한 충분 한 될 것입니다.

3. 해 부 및 Oocytes의 고정

  1. 적절 한 유전자 형의 30 성인 처녀 여성을 수집 합니다. 늦은 단계 oocytes에 대 한 풍부 하 게 해 부25전에 3-5 일에 대 한 사용 비행 음식과 건조 효 모와 함께 유리병에 남성 없이 여성을 잡아. 해 부, 전날 누 룩과 신선한 유리병을 가스 없이 여성을 전송 합니다.
  2. 해 부를 수행 합니다.
    주: 필요한 도구에 대 한 그림 3 을 참조 하십시오. 솔루션은 다른 설명이 없는 한 가져온된 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 제거 됩니다. 난소를 항상 전송할 때 10 %BSA 해결책으로 피 펫 팁을 사용 합니다.
    1. 수정 Robb의 버퍼를 포함 하는 얕은 해 접시, 집게를 사용 하 여 단일 여성에서 난소를 제거 하. 집게를 사용 하거나 내부 ovarioles에 연결할 솔루션을 수 있도록 각 난소를 부드럽게 퍼짐에 텅스텐 바늘. 1 mL 수정 Robb의 버퍼를 포함 하는 1.5 mL microfuge 관 splayed 난소의 쌍을 전송 합니다.
    2. 3.2.1 1.5 mL microfuge 관에서 20-25 여성에서 난소를 축적 단계를 반복 합니다. 10 분 이내 20-25 여성의 해 완료.
  3. 다음과 같이 고정을 수행.
    1. 가져온된 파스퇴르 피 펫과 microfuge 관에 액체를 제거 하 고 신속 하 게 난소를 37 ° C 수정 솔루션의 500 µ L을 추가 하는 P1000 사용 즉시 난소에 실내 온도 헵의 500 µ L 추가.
    2. 혼합 하 고 3 분에 대 한 nutator에 흔들어 microfuge 관 하단에 정착 nutator는 oocytes 있도록 1 분 튜브 랙에 장소에서 microfuge 관을 제거 합니다. 총 고정 시간은 4 분 이다.
      주의: 수정 솔루션 및 헵 독성, 적절 한 보호를 착용.
    3. 수정 솔루션을 제거 하 고 0.5 %BSA 0.1%를 포함 하는 PBS의 500 µ L에 난소 3 번을 씻어 Triton X-100 (PBSBTx)
  4. 나머지 genotypes를 반복 합니다.

4입니다. Chorions 및 Vitelline 세포 막의 제거

주: 필요한 도구에 대 한 그림 3 을 참조 하십시오.

  1. 별도 늦은 단계 oocytes
    1. 얕은 해 접시를 1 mL PBSBTx를 추가 합니다. 얕은 접시에 고정된 난소 (~ 150 µ L)를에서 전송 하는 P200 BSA 코팅 팁 사용 합니다. 덜 성숙 oocytes에서 성숙한 oocytes를 꺼내 려 BSA 코팅된 피 펫 팁 난소를 위쪽 및 아래쪽 플라스틱.
    2. 때 늦은 단계 oocytes 충분히 구분 하 고, 모든 조직 500 µ L microfuge 관으로 전송. 가져온된 파스퇴르 피 펫, 떠날에 대 한 과잉 액체를 제거 튜브에 150-200 µ L. 나머지 genotypes 섹션 4.1 반복 합니다.
  2. 압 연에 대 한 준비
    1. 미리 젖은 PBSBTx. 커버의 200 µ L로 깊은 잘 요리 하 고 따로. 3 서 리 낀된 유리 슬라이드 및 설정된 슬라이드 #3 옆으로 얻을. 함께 슬라이드 # 1과 # 2의 젖 빛된 유리 영역을 문질러 부드럽게. 어떤 유리 파편을 제거 하 고 일회용 닦아 건조 하 이온된 수에 그들을 씻어.
    2. 한 슬라이드에 PBSBTx의 50 µ L을 추가 하 고 다른 슬라이드와 함께이 지역 문 지르고 하 여 슬라이드 #1 및 #2 PBSBTx의 서 리 낀된 지역 코트. 일회용 지우기 액체를 제거 합니다.
    3. 그림 4A에 표시 된 구성에서 해 현미경 슬라이드를 놓습니다. 계속 슬라이드 # 3와 #1 및 #2 접촉에서 슬라이드의 반투명된 영역 슬라이드 # 2를 지원 합니다.
  3. 롤 oocytes; 회전의 방향으로 직선에 결코 원형 모션 항상 인지 확인 합니다.
    1. Prewet는 P200 피 펫 팁 PBSBTx에서 그리고 아래로 pipetting으로 microfuge 관에 oocytes를 분산. 젖 빛된 유리 부분의 슬라이드 # 1의 센터에 액체 포함 oocytes의 50 µ L를 전송 합니다. 슬라이드가 #2 올립니다.
    2. 액체의 표면 장력 두 젖 빛된 유리 지역 사이 물개를 만듭니다 때까지 천천히 슬라이드 #2 낮은. 충분 한 액체를 두르고 지역을 커버 해야 하지만 아무도 밖으로 들어와서 해야 합니다. 액체 범람 하는 경우 가져온된 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 과잉 액체를 제거 하.
    3. 한 손으로 자리에 하단 슬라이드 (#1)를 보유 하 고 다른 손으로 앞뒤로 슬라이드 #2 수준 및 지원된 슬라이드 #3 유지, 수평 방향으로 가기 슬라이드 (#2)를 사용 하 여. Oocyte 움직임과 진행의 쉽게 시각화를 위한 현미경을 수행 합니다.
      참고:이 운동 마찰을 생성 하 고 "롤"와 그들의 chorions를 잃는 oocytes를 일으킬 것 이다. 최소한의 압력을 사용 해야 하 고 짧고 빠른 움직임 이어야 한다.
    4. 수평 방향으로 몇 움직임 후 약간 운동 (그림 4B)의 각도 변경 합니다. 여러 단위로 가기 슬라이드 (#2)의 움직임은 시작 방향 (그림 4B)에 수직 될 때까지 점차적으로 90 °이 각도 증가. Chorions 빈 참고 액체에서 볼 수와 chorions 부족 oocytes 길고 얇은 나타납니다.
    5. 솔루션은 약간 흐린 됩니다 때까지 단계 4.3.3-4.3.4 7-10 회 정도 반복 합니다. Oocytes (75-85%)의 대다수 그들의 vitelline 막 잃었을 때 회전을 중지 합니다.
      참고: 독특한 뾰족한 끝은 종종 oocytes 부족 vitelline 막에 표시. Vitelline 막은 chorions 보다 제거 하기가 더 어렵습니다. 가벼운 압력 vitelline 세포 막의 제거를 달성 하기 위해 중 상단 슬라이드 (슬라이드 2)에 적용할 수 있습니다. Vitelline 막 oocytes는 종종 다른 oocytes의 파괴에 결과에서 제거 하려고 합니다.
    6. 부드럽게 가기 슬라이드 (#2), 두르고 지역의 센터에 축적 oocytes를 압 연 하 하단 슬라이드 (#1) 두르고 지역의 센터의 모서리 중 하나를 끌어. PBSBTx 포함 된 깊은 잘 접시에 PBSBTx와 두 슬라이드에서 oocytes를 씻어.
    7. 슬라이드 #1 및 #2 초순, 일회용 닦아 건조 깨끗 하 고 다시 설정. 단계 4.3.1-4.3.6 동일한 유전자 형의 모든 oocytes 압 연 때까지 반복 합니다. 이 보통의 유전자 형 당 3-4 라운드를 필요 합니다.
  4. 압 연 후 이물질을 제거
    1. 15 mL 원뿔 튜브를 1 mL PBSBTx를 추가 합니다. 튜브의 양쪽 코트 액체를 소용돌이 친다.
    2. PBSBTx을 사용 하 여 코팅 P1000 피 펫 팁, 포함 하는 PBSBTx. 추가 포함 하는 oocytes 원뿔 튜브에 PBSBTx의 추가적인 2 mL의 1 mL 원뿔 튜브에 깊은에서 압 연된 oocytes 잘 요리 하는 전송.
    3. Oocytes는 바닥에 정착, 다음 상단 한 P1000와 파편 (chorions, vitellines, 등)을 포함 하는 솔루션의 2 개 mL를 제거 하 고 삭제 하기 시작 하자. 필요한 경우, 그들은 싱크 불투명 oocytes를 보러 어두운 배경 원뿔 튜브를 잡으십시오.
    4. Oocytes에 PBSBTx의 추가적인 2 mL를 추가 하 고 4.4.3 단계를 반복 합니다. 4.4.3을 반복 합니다. 파편 제거의 3 라운드의 총에 대 한.
    5. P1000 피 펫 팁, 원래 500 µ L microfuge 관에 다시 전송 oocytes 코팅은 PBSBTx를 사용 하 여. 20-25 여성 연된 성숙 oocytes의 약 50 µ L를 양보 한다.
  5. 각 유전자 형에 대 한 신선한 두르고 슬라이드, 깨끗 한 깊은 잘 요리와 새로운 원뿔 튜브를 사용 하 여 나머지 genotypes 섹션 4를 반복 합니다.
  6. 저장소가 필요한 경우 전송 oocytes 0.1 %TritionX-100와 저장소 1 x PBS에 4 ° c.에서 하룻밤 장기 저장에는 포름알데히드 가교 비 이온 세제에 의해 반전 될 수 있다 때문에 권장 하지 않습니다.

5입니다. 물고기

참고: 모든 세척 수행 됩니다 실 온에서 nutator에 달리 언급 하지 않는 한. 압 연 된 oocytes formamide를 포함 하는 솔루션에 (서) 특히 microfuge 관의 바닥에 정착 더 오래 걸릴. Oocytes는 과정에서 손실 되지 솔루션 변경 때 인내심을 중요 하다. 이 린스와 세척 후 정착 oocytes를 5-15 분을 대기 해야 합니다. 또한 메모는 formamide에 oocytes는 덜 불투명 하는.

  1. 추출 및 RNAse 처리
    1. 1% 포함 된 PBS의 500 µ L로 oocytes 린스 Triton X-100 (PBSTx). 액체를 제거 하 고 500 µ L 추가 추출 버퍼 (RNAse를 포함 하는 PBSTx). 2 시간에 대 한 실 온에서 nutator에 품 어.
  2. 사전 교 잡 세척
    1. Oocytes 트윈 20 (SSCT)를 포함 하는 염 분 나트륨 시트르산 x 500 µ L 2와 3 번 씻어. 약 수 (~ 500 µ L/유전자 형) x SSCT + 37 ° c 50% formamide 2의 예 열
      주의: formamide 독성, 적절 한 보호를 착용.
    2. 500 µ L 2에서에서 3 시간 10 분 대 한 oocytes를 씻어 x SSCT. X SSCT + 20% formamide 500 µ L 2에에서 10 분 동안 oocytes를 씻어. X SSCT + 40% formamide 500 µ L 2에에서 10 분 동안 oocytes를 씻어. X SSCT + 50% formamide 500 µ L 2에에서 10 분 동안 oocytes를 씻어.
    3. 액체를 제거 하 고 샘플링 하 고 회전 37 ° C에서 2 시간에 대 한 품 어 5.2.1 단계에서 37 ° C 2 x SSCT + 50 %formamide 500 µ L를 추가 합니다.
      참고:는 회전자를 갖춘 교 잡 오븐이를 위해 잘 작동 합니다. 거품 microfuge 관 "플 로트"는 회전자에 연결 된 튜브를 확보 하 여 사용할 수 있습니다.
  3. 변성 및 교 잡
    1. Oocytes의 각 관 2.5 ng / µ L centromeric 프로브 및 0.31 pmol 형 석 / µ L의 각 BAC 프로브 1 x 교 잡 버퍼의 40 µ L을 사용 합니다. 모든 genotypes에 대 한 충분 한 교 잡 버퍼에 프로브 솔루션을 준비 합니다. 추가 하기 전에 소용돌이 프로브 믹스 30 s.
    2. BSA-코팅 P200 피 펫 팁을 사용 하 여, 200 µ L PCR 튜브에 oocytes를 전송 합니다. 아래, 37 ° C와 하자 oocytes 정착에 샘플을 계속 다음 가져온된 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 가능한 많은 액체를 제거 합니다.
    3. 프로브는 oocytes (2 절에서 준비)를 포함 하는 하이브리드 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다. PCR 기계에 oocytes를 포함 하는 PCR 튜브를 놓고 다음과 같이 품 어: 3 분, 다음 37 ° C 하룻밤 동안 92 ° C 5 분 동안 37 ° C. 프로브는 oocytes에 추가 되, 계속 그들 어둠 속에서 가능 한 한 많이.
  4. 교 잡 후 세척
    1. SSCT + 37 ° C에 50% formamide x 2를 예 열 하 고 교 잡 인큐베이터에서 유지. BSA와 코팅 P200 팁 플라스틱, oocytes는 PCR 튜브에 37 ° C 2 x SSCT + 50 %formamide 100 µ L를 추가 하 고 새로운 500 µ L microfuge 관에는 oocytes를 전송.
    2. 같은 튜브를 하자는 oocytes 정착 인큐베이터에서 37 ° C에서 37 ° C 2 x SSCT + 50 %formamide 추가 400 µ L를 추가 합니다.
      참고:이 단계에서 더 오래 걸립니다 종종 정착. 15 분을 특이 한 이상 아니다. 인 내의 부족 oocytes의 상당한 손실이 발생 합니다.
    3. 500 µ L 37 ° C 2 x SSCT + 37 ° C에서 50 %formamide 회전에서 3 시간 20 분 대 한 oocytes를 씻어. 그들은 정착 하는 동안 37 ° C에서 oocytes를 유지.
    4. 500 µ L 37 ° C 2 x SSCT + 37 ° C에서 50 %formamide 회전에서 3 시간 10 분 대 한 oocytes를 씻어. 그들은 정착 하는 동안 37 ° C에서 oocytes를 유지.
    5. 실 온에서 10 분 동안 oocytes x SSCT + 40 %formamide nutator에 500 µ L 2에에서 씻어. 500 µ L 2 x SSCT + 20 %formamide에서 10 분 동안 oocytes를 씻어. 500 µ L 2에에서 10 분 동안 oocytes를 씻어 x SSCT.
  5. DAPI와 얼룩
    주의: DAPI 독성, 적절 한 보호를 착용.
    1. 2에서 500 µ L DAPI 솔루션 (1 µ g/ml)에서 20 분 대 한 oocytes를 씻어는 nutator에 x SSCT. 린스는 oocytes 500 µ L 2에에서 3 번 x SSCT. 500 µ L 2에서에서 2 시간 10 분 대 한 oocytes를 씻는 nutator에 x SSCT. 그들은 coverslips에 준비가 될 때까지 어둠 속에서 실 온에서 최대 4 시간 샘플을 저장할 수 있습니다.
  6. 장착
    주: 필요한 도구에 대 한 그림 3 을 참조 하십시오.
    1. 폴 리-L-리 신 코팅된 coverslip 해 현미경을 놓습니다. Oocytes, 약 150 µ L 총 볼륨 조정의 튜브에서 액체를 제거 합니다. BSA와 P200 피 펫 팁, 위아래로 분산 솔루션을 통해 oocytes를 다음 폴 리-L-리 신 코팅된 coverslip에 oocytes/솔루션의 40 µ L를 전송 피 펫 코팅.
    2. oocytes는 coverslip에 충실 하지만 여전히 액체를 둘러싸인 때까지 뽑아 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 하는 coverslip에서 액체의 일부를 제거 합니다. 겸 자, 1 개의 측에 커버 슬립을 누른와 텅스텐 바늘을 사용 하 여 부드럽게 oocytes, 겹치지 oocytes의 단일 레이어를 달성 하기 위해 이동의 덩어리를 분리.
    3. 가져온된 파스퇴르 피 펫과 oocytes 주위 액체의 나머지를 제거 합니다. 깨끗 한 유리 슬라이드 고 압축된 가스를 사용 하 여 모든 먼지에서 타격. 슬라이드의 중간에 (예를 들면, 머리말-금) 미디어 탑재 22 µ L를 추가 합니다. 천천히 샘플, 직면 하 고 미디어 접촉 샘플 설치 미디어와 함께 coverslip로 슬라이드를 낮춥니다. 표면 장력은 슬라이드에 coverslip을 발생할 것입니다.
    4. 신선한 dessicant (예, drierite)의 레이어를 포함 하는 꽉 끼는 뚜껑 플라스틱 용기에 슬라이드를 배치 합니다. 슬라이드 이미징 하기 전에 어둠 속에서 3-5 일 동안 건조 하자. 건조 시는 방의 습도 따라 달라질 수 있습니다.

6입니다. 영상

  1. 건조 제거 시 슬라이드 dessicant, 깨끗 한 상자에서 모든 먼지 입자를 제거 하는 그들. 매니큐어와 coverslips 인감. 봉인 된 슬라이드는-20 ° c.에 무기한으로 저장 될 수 있습니다.
  2. 레이저 공초점 이미지 6 배 디지털 줌과 높은 수 가늠 구멍 40 X 오일 목표를 사용 하 여 검색을 취득 합니다.
    참고: 이상적으로, 시스템 소프트웨어를 사용 하나를 찾아서 여러 oocytes 위한 meiotic 염색체의 X-Y 위치를 표시 하는 그들을 보는 동안 epifluorescence를 사용 하 여. 이 기능은 이미지 세션 동안 시간이 절약 됩니다. 만든 높은 숫자 조리개 60 X 목적으로 표백 급속 한 선택한 confocal 시스템, 하지만 그것은 부적 절 한 사용이 다른 시스템에 대 한 작동 수 있습니다.
  3. 각 oocyte, 위쪽 및 아래쪽 DAPI 신호를 사용 하 여 일련의 설정에 대 한 Z 시리즈를 캡처하십시오.
    참고: 이득, 오프셋, 그리고 레이저 파워 oocytes의 하위 집합을 사용 하 여 실험적으로 결정 될 필요가 있을 것 이다. 일단 적당 한 매개 변수를 발견만 약간 조정 할 필요가 있어야 한다.
    인수를 변경 하는 경우 설정 필요, 이전에 수집한 이미지 스택을 사용 하 여 필요한 사항을 변경 추정. 표백을 방지 하려면 미리 Z 시리즈를 캡처하기 전에 팔 프로브를 영상에서 후 렴. 0.25 µ m의 단계 크기, Z 시리즈 일반적으로 범위 25에서 30 단계 방향 및 염색체의 배치에 따라. 작은 단계 크기 두 물고기 명소 축 차원에서 분리 되어 있지만 작은 단계와 표백으로 인해 신호 강도의 손실 하는 데 필요한 시간으로 교환 여부를 평가 하는 하나의 능력을 높일 수 있습니다. 6 배 디지털 줌과 1024 x 512 이미지 필드 40 X 목표 0.05 μ m의 픽셀 크기의 이미지를 생성합니다.

7. 이미지 분석 및 단결력 결함에 대 한

  1. 각 oocyte19에 대 한 신호 대 잡음 비를 최적화 하기 위해 Z 시리즈 deconvolve
    참고: 자료 테이블 에 지정 된 것과 같은 소프트웨어 패키지 통합 복원을 사용 하 여 deconvolve으로 자르기와 이미지 대비 향상에 있습니다. 중요 한 것은, 3 차원에서 보기 이미지와 응집력 결함에 대 한 점수에 있는 소프트웨어 패키지가 필수적입니다.
  2. 각 oocyte 팔과 DAPI 신호 colocalize centromeric foci의 수 평면. 응집력의 손실 결과 특정 조사에 대 한 3 개 또는 4 개의 고유 하 고 분리 된 신호. 얇은 실에 의해 연결 된 두 개의 포커스를 관찰 하는 것은 드물지 않다. 가장 엄격한 기준에 의해 이러한 foci 하지 간주 됩니다 "구분."

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결과

그림 5 는 X 염색체에 cytological 지역 6E-7B에 hybridizes는 팔 조사로 얻은 이미지를 선물 한다. 공동의 DAPI, localizes 신호에서이 조사 결과 배경에서 쉽게 구별할 수 이며 팔 단결력 결함 다른 genotypes19에 척도를 성공적으로 사용 되었습니다. 단결력 결함의 부 량 제한 되었다 prometaphase에 어 분열 I 단계; 핵 붕괴 이전 oocytes 분석19에서 제외 했다. 그대로 핵 봉투 oocyte 염색체 주변 세포질 보다 개별 원형 지역에 의해 둘러싸여 있을 것입니다 때문에 DAPI 채널에서 스캔할 때 분명 하다.

그림 5...

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토론

물고기를 사용 하 여 나 고 분열 prometaphase 팔 응집력의 상태를 평가 하기 위해 프로브 나 초파리 oocytes 초파리 감수 분열의 분야에서 중요 한 발전 이다. 역사적으로, 초파리 연구 성숙 oocytes11,,1819팔 응집력의 조 손실 유추를 유전자 검사로 제한 되었습니다. 자, 여기에 제시 된 방법으로 팔 단결력의 상태 수 수 분석 직접 물고기를 사용 하 여. 크게 팔 단결력의 조 손실에 대 한 물리적 증거를 얻을 수 초파리 oocytes에서 팔 응집과 염색체 missegregation의 조 손실 메커니즘 연구에 사용할 수 있는 접근의 레 퍼 토리를 확장 합니다.

중요 한 단계
우리가 하지 염색체...

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공개 사항

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 샤론 E. 강사에 게 수 여 하는 NIH 그랜트 GM59354에 의해 지원 되었다. Confocal 현미경 검사 법에 대 한 앤 Lavanway와 기술 지원에 대 한 제이 에밀리 리드 형광 팔 프로브를 생성 하기 위한 프로토콜을 개발에 도움에 감사 위이 Q. 응웬 하 고. 우리는 또한 유용한 토론 및 조언을 위한 초파리 커뮤니티에서 수많은 동료를 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Kits
Midi Prep kitQiagen12143Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) KitSigmaWGA2Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA 라벨링 키트InvitrogenA21676Label BAC 클론 DNA
PCR 정제 키트Qiagen28104BAC 클론 DNA의 라벨링 후 비접합 염료
를 제거하십시오Name<strong>Company카탈로그 번호Comments
Chemicals & 솔루션
참고: 모든 솔루션은 멸균 초순수를 사용하여 준비되며 오토클레이브 또는 필터 멸균으로 멸균해야 합니다.
소 혈청 알부민(BSA)Fisher ScientificBP1600-10010% 재고 준비
동결 부분 표본
염화칼슘Fisher ScientificC75-500
DAPI(4', 6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드)인비트로겐D1306Toxic: 착용 적합한 보호구. 100µ를 준비하십시오; 100% 에탄올에 있는 g/ml 주식, -20 °C.에 aliquots에 있는 저장하십시오 1개를 µ 사용 전 2X SSCT의 g/ml 용액.
덱스트란 설페이트시그마D-8906
드라이라이트드라이라이트 회사23001
디티오트레이톨 (DTT)인비트로젠15508-01310 mM 재고
dTTP (10 &마이크로; mol, 100 &마이크로; l)Boehringer Mannheim12770491 mM 재고
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid)Fisher ScientificS311-500250 mM 재고
준비 100% 에탄올 (분자 등급, 200 proof)DeconLaboratories2716
Tris (Ultra Pure)Invitrogen15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)SigmaE-3889
16% 포름알데히드Ted Pella, Inc.18505Toxic: wear
proper protection FormamideInvitrogenAM9342Toxic: wear, appropriate
protection: GlucoseFisher ScientificD16-1
GlycogenRoche901393
HepesBoehringer Mannheim737-151
HeptaneFisher ScientificH350-4Toxic: 적절한 보호 장치를 착용하십시오.
염산MilliporeHX0603-4< 강한 > 독성 : < / 강한 > 적절한 보호 장치를 착용하십시오.
하이드록실아민시그마438227준비 3 M 재고
4.9 M 염화마그네슘시그마104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2OFisher ScientificS373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2OFisher ScientificS369-500
폴리-L-라이신(0.1mg/ml)SigmaP8920-100
아세트산칼Fisher ScientificBP364-500
아세트산나트륨Fisher ScientificS209-5003M 재고 준비
카코딜레이트 나트륨Polysciences, Inc.1131<강한>독성: 적절한 보호구를 착용하십시오. 400mM 스톡 준비
구연산나트륨Fisher ScientificBP327-1
염화나트륨Fisher ScientificS271-3염화나트륨
자당Fisher ScientificS5-500
10% 트윈 20Thermo Scientific28320Surfact-Amps
10% Triton X-100Thermo Scientific28314Surfact-Amps
NameCompany카탈로그 번호Comments
Solutions<
strong>참고: 모든 솔루션은 멸균 초순수를 사용하여 준비되며 오토클레이브 또는 필터 멸균으로 멸균해야 합니다.
TE 완충액10 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (식염수 구연산 나트륨)3 M NaCl, 300 mM 구연산 나트륨
2X 카코딜 레이트 고정 용액< 강>독성 : < / 강> 적절한 보호 기능을 착용하십시오.200 mM 카코딜 산 나트륨, 200 mM 자당, 80 mM 아세트산 나트륨, 20 mM EGTA
1.1X 혼성화 완충액3.3X SSC, 55% 포름아미드, 11% 덱스트란 황산염
고정 용액<강한>독성: 적절한 보호를 착용하십시오. 4% 포름알데히드, 1X 카코딜레이트 고정 용액
PBSBTx1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx1X PBS, 1% Trition X-100
추출 버퍼 (PBSTx + Rnase)1X PBS, 1% Trition X-100, 100 & 마이크로; g/mL RNase
2X SSCT2X SSC, 0.1% 트윈 20
2X SSCT + 20% 포름아미드<강한>독성: 적절한 보호를 착용합니다. 2X SSC, 0.1% 트윈 20, 20% 포름아미드
2X SSCT + 40% 포름아미드<강한>독성: 적절한 보호를 착용합니다. 2X SSC, 0.1% 트윈 20, 40% 포름아미드
2X SSCT + 50% 포름아미드Toxic: 착용 적합한 보호구. 2X SSC, 0.1% 트윈 20, 50% 포름아미드
NameCompany카탈로그 번호Comments
Enzymes
AluINew England BiolabsR0137S
MseI뉴잉글랜드 바이오랩스R0525S
MspI뉴잉글랜드 바이오랩스R0106S
RsaI뉴잉글랜드 바이오랩스R0167S
BfuCI뉴잉글랜드 바이오랩스R0636S
100X BSA뉴잉글랜드 바이오랩스NEB 효소
10X NEB 버퍼 #2뉴잉글랜드 바이오랩과함께 제공제한 효소 분해 완충액. NEB 효소 포함
단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT) 400 U/&마이크로; lRoche / Sigma3333566001
TdT 버퍼Roche / SigmaTdT 효소
코발트 클로라이드Roche / SigmaToxic : < / strong>wear 적절한 보호 기능을 제공합니다. TdT 효소
RNase A (10 mg/mL)Thermo-ScientificEN0531
NameCompany카탈로그 번호Comments
Cytology Tools 등
ForcepsDumont#5 INOX, 바이오로지
9" 일회용 유리 파스퇴르 피펫Fisher13-678-20C
깊은 우물 접시 (3 웰)Pyrex7223-34
Fisherfinest 프리미엄 현미경 슬라이드Fisher Scientific22-038-104깊은 우물 접시를 덮는 데 사용
젖빛 유리 슬라이드, 25 x 75 mmVWR Scientific48312-002
유리 슬라이드, 3 x 1인치, 1mm 두께의 Thermo-Scientific3051
커버슬립, 10 x 10mm, No. 1.5Thermo-Scientific3405
텅스텐 바늘수제
Prolong GOLD 장착 매체분자 프로브P36930
압축 공기 다양한
NameCompany카탈로그 번호코멘트
Equipment
PCR machineVarious
Nanodrop 2000, spectrophotometerThermo-Scientificmicrovolume spectrophotometer
Vortexer실
탁상용 마이크로 분리기
탁상용 마이크로 중분리기; C각종
열 구획회전
장치 각종 혼성화 오븐 또는 인큐베이터각종
Nutator각종
A1RSi 레이저 스캐닝 confoalNikon40X 기름 계획 Fluor DIC (NA 1.3)
NameCompany카탈로그 번호코멘트
소모품 등
50 mL 원추형 튜브다양한
15 mL 원뿔형 튜브다양한
1.5 mL 마이크로퓨지 튜브다양한
500 µ l microfuge 관각종
200 µ l PCR 튜브
플라스틱 용기다양한 Drierite
코멘트
기타
HPLC 정제 5' 표지 올리고뉴클레오티드X 염색체의 359bp 위성 반복을 인식하는통합 DNA Technologies
Volocity Volocity 3D 이미지 분석 소프트웨어PerkinElmer버전 6.3
준비: 륨 HaeIII New England Biolabs R0108S 말 얕은 유리 해부 접시 를 살균하는 오토클레이브 맞춤형 온에서 다양한 4 °에서 다양한 꽉 끼는 뚜껑이있는 다양한 Kimwipes를 담기 위해 다양한 일회용 물티슈 파라 필름 다양한 파라핀 필름 < 강한> 이름 < / 강> < 강> 회사 < / 강> < 강>카탈로그 번호 < / 강> Cy3 표지 프로브

참고문헌

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Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes
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