Phthalic 산 에스테 르-바인딩 DNA Aptamer 선택, 특성, 및 전기 화학 Aptasensor 응용 프로그램

Summary

생체 외에서 선택 및 그룹 관련 phthalic 산 에스테 르-바인딩 DNA aptamers의 특성화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 전기 aptasensor에서 선택 된 aptamer의 응용 프로그램이 포함 되어 있습니다.

Abstract

지속적인 유기 오염 물질의 주요 그룹의 phthalic 산 에스테 르 (PAEs) areone. PAEs의 그룹 전용 탐지는 congeners의 급속 한 성장으로 인해 매우 원한다. 점점 더 인식 요소 바이오 센서 플랫폼에 적용 된 DNA aptamers 하지만 선택 aptamers PAEs, 등 매우 소수 성 분자 표적으로 보고 거의. 이 작업 그룹-특정 DNA aptamers PAEs 선택 하도록 설계 된 비드 기반 방법을 설명 합니다. 아미노 그룹 공업화 틸 프 탈 레이트 (DBP-NH₂) 앵커 대상 합성 했 고 에폭시 활성화 agarose 구슬에 움직일 immobilization 매트릭스의 표면에서 phthalic 에스테 르 그룹의 표시를 허용 하 고 따라서 그룹 전용 바인더의 선택. 자력 분리와 결합 하는 정량적 중 합 연쇄 반응에 따라 aptamer 후보자의 분리 상수 하 고. 상대 선호도 다른 PAEs에 aptamers의 선택도 경쟁 분석 실험에 의해 결정 되었다 aptamer 후보 DBP NH₂ 미리 경계 했다 연결 된 자석 구슬, 가진 외피에 상쾌한에 발표 테스트 PAEs 또는 다른 잠재적인 간섭 물질입니다. 경쟁 분석 결과 표면 동원 정지에 대 한 기능 그룹이 했다 PAEs 중 손쉬운 선호도 비교를 제공 하기 때문에 적용 되었다. 마지막으로 우리 전기 aptasensor의 제작을 시연 하 고 bis(2-ethylhexyl) 프 탈 레이트의 磁 및 선택적 검출을 위해 사용. 이 프로토콜 다른 소수 작은 분자의 aptamer 발견에 대 한 통찰력을 제공합니다.

Introduction

급속 한 경제 발전, 함께 산업화, 그리고 도시 건설, 환경 오염의 가속 그 어느 때 보다 더 심각 하다. 일반적인 환경 오염 물질 중 금속 이온, 독 소, 항생제, 농약, 내 분 비 분리기와 지속적인 유기 오염 물질 (Pop)을 포함합니다. 금속 이온과 독 소, 외 다른 오염 물질은 작은 분자는 꽤 congeners의 다양 한 구성 됩니다. 가장 독성 Pop 비페닐 (PCBs), 다 환 방향족 탄화수소 (PAHs), 폴 리 브롬 화 비페닐 에테르 (PBDEs), polychlorinated dibenzo-p-다이옥신 (PCDDs), polychlorinated dibenzofuran (PCDFs)를 포함 하는 예를 들어 고 phthalic 산 에스테 르 (PAEs)^1,-²모든 많은 congeners의 구성. 작은 분자 검출 크로마토그래피/질량 분석 기반 기술을 응용 프로그램^3,4,,56의 그들의 다양성 때문에 의해 주로 수행 되었습니다. 사이트 검색에 대 한 항 체 기반 방법을 최근 개발된^7,,89되었습니다 합니다. 그러나, 이러한 방법은 특정 느리기에 대 한 매우 구체적인 이기 때문에, 여러 테스트를 수행 합니다. 더 심각한 것은 소설 congeners 성장 빠른 시간에 그들의 항 체를 생성할 수 없습니다. 따라서, 한 테스트에 모든 congeners의 총 레벨 모니터링 하 그룹 관련 바이오 센서의 개발 환경 오염 상태를 평가 하기 위한 귀중 한 통계를 제공할 수 있습니다.

최근, 핵 산 aptamers 널리 적용 된 다양 한 바이오 센 싱 플랫폼 다양 한 이온과 단백질 및 세포^{10,11 작은 분자에서 대상 인식의 그들의 기능 때문에 인식 요소 ,12}. Aptamers는 시험관에 의해 호출 된 메서드 ligands의 체계적인 발전 지 수 농축 (SELEX)^13,14을 통해 식별 됩니다. SELEX는 약 10¹⁴-10¹⁵ 시퀀스 포함 임의의 합성 단일 가닥 oligonucleotide 도서관으로 시작 합니다. 무작위 라이브러리의 크기는 RNA 또는 DNA 후보 구조의 다양성을 보장합니다. 전형적인 SELEX 프로세스 라이브러리는 높은 친 화력 및 특이성 대상 시퀀스에 농축 될 때까지 농축의 여러 라운드로 구성. 최종 농축된 수영장 다음 시퀀스와 분리 상수 (K_d) 및 간섭 물질과 같은 다른 기술에 의해 결정 하는 잠재력에 대 한 선택 필터 바인딩, 친화성 크로마토그래피, 표면 플라스몬 공명 (SPR), 등. ¹⁵

매우 빈약한 물 가용성과 표면 동원 정지에 대 한 기능 그룹의 부족, pop aptamer 선택은 이론적으로 어렵습니다. SELEX에 대 한 중요 한 발전 aptamers 발견 가속화 했습니다. 그러나, 팝에 대 한 그룹별 aptamers의 선택은 하지 아직 알려졌다. 지금까지 특정 느리기에 대 한 높은 특이성으로 PCB 바인딩 DNA aptamers만 확인 된¹⁶되었습니다. PAEs는 주로 폴 리 염화 비닐 물자, 탄력 있는 플라스틱, 따라서 가소제 역할 하드 플라스틱에서 폴 리 염화 비닐을 변경에 사용 됩니다. 일부 PAEs 내 분 비 분리기로 확인 되었습니다, 심각한 손상을 일으킬 수 간 및 신장 기능, 남성 정자의 운동 성 감소 하 고 비정상적인 정자 형태와 고환 암¹⁷발생할 수 있습니다. 화합물-도 그룹 전용 PAE 바인딩 aptamers 보고 되었습니다.

이 작품의 목표 그룹-특정 DNA aptamers PAEs, 팝의 대표 그룹 등 매우 소수 작은 분자를 선택 하기 위한 대표적인 프로토콜을 제공 하는 것입니다. 우리는 또한 환경 오염 감지를 위한 선택 된 aptamer의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 이 프로토콜 다른 소수 작은 분자의 aptamer 발견에 대 한 지침과 통찰력을 제공합니다.

Protocol

1. 라이브러리 및 뇌관 설계 및 합성

1. 디자인 초기 라이브러리 및 뇌관.
   라이브러리 (풀₀): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-n 40를 자동차-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
   뇌관 (FP)를 전달: 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
   반전 뇌관 phosphorylated (포₄-라인란트): 5'-포₄-GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
2. 합성 풀₀, FP, 및 포₄-RP 표준 phosphoramidite 화학^18,,1920를 사용 하 여 표준-고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)²¹에 의해 모든 DNAs를 정화.
3. 수영장₀, FP, 및 포 reconstitute₄-RP nuclease 무료 학년에서 100 µ M, aliquot에서 물 및-20에서 그들을 저장 또는 최대 1 년-80 ° C.
   참고:이 좋습니다 수영장₀, FP, 및 포 저장 하₄-RP 10-20 µ L aliquots에 가능한 교차 오염을 방지.

2. 합성 앵커 대상 및 에폭시 활성화 Agarose 구슬에 그것의 동원 정지

1. 앵커 대상으로 아미노 그룹 공업화 틸 프 탈 레이트 (DBP-NH₂) 음성 합성.
   참고: 합성 및 DBP NH₂ 의 실험 내용은 문학²²에서 설명 되었습니다.
2. 앵커 대상 용 해도 대 한 적절 한 매체 대상 재고 솔루션을 준비 합니다. 이 연구를 위해 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 100 m m DBP NH₂ 재고 솔루션을 준비 하 고 4에서 솔루션을 저장 또는 최대 1 년 동안-20 ° C.
3. DBP NH₂ 제조 업체에서 수정 된 프로토콜에 따라 에폭시 활성화 agarose 구슬에 고정
   1. 그리고 0.1 g 동결 건조 분말 에폭시 활성화 agarose 구슬의 밖으로 무게 증류수에 중단. 20 mL 증 류 물 여러 aliquots에 추가 사용 하 여 1 시간을 위한 매체를 씻어. 씻어 0.2 M 나₂CO₃ (pH 12) 매체.
      참고: 매체 그것에 물을 추가한 후 즉시 부을.
   2. 500 µ L 커플링 버퍼 (0.2 M 나₂CO₃ 버퍼)에 DBP NH₂ (46.7 m g, 0.15 mmol)을 용 해.
   3. 혼합 매체를 가진 ligand를 포함 하는 결합 솔루션. 5 rpm에서 통을 사용 하 여 실 온에서 48 h에 대 한.
   4. 세척 제품 세 번 0.1 M 아세테이트 버퍼 (0.5 M NaCl, pH 4.5)을 사용 하 여 순차적으로 반복 하 고 0.2 M에서 각 씻어 주기 버퍼 (0.5 M NaCl, pH 12) 탄산염. 워시와 500 µ L의 최종 볼륨을 물에 제품을 일시 중단 합니다.
   5. 사용 하기 전에 4 ° C에서 제품을 저장 합니다.
   6. 원소 분석 대상 동원 정지의 성공 여부를 확인 합니다.

3입니다. SELEX

1. 매우 순수한 물 또는 20 mm Tris· nuclease 무료 학년 물에 PAE 바인딩 버퍼의 500 mL를 준비 HCl, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 5 m KCl m, 1mm CaCl₂, 1 %polyoxyethy-레네 (20) sorbaitan monolaurate, 및 0.03% 비 이온 성 표면 활성 에이전트 (pH 7.9). 개월 동안 20 ° C 보다 높은 온도에서 저장 및 살 균 0.22 μ m nitrocellulose 필터를 통해 버퍼를 필터링 합니다.
   참고: 그것은 PAE 바인딩 버퍼에서 PAEs의 좋은 분산 상태를 유지 하기 위해 중요 한입니다. 여러 종류의 계면 활성 제 용액에 PAEs의 가용성을 향상 시키기 위해 필요 합니다. 그러나, 계면의 수는 PAE 분자를 캡슐화 하는 계면 활성 제 micelles의 형성을 피하기 위해 최소한으로 유지 되어야 한다. 비 이온, 표면 활성 제 쉽습니다 20 ° C 보다 낮은 온도에서 침전 하 고 따라서 버퍼는 높이 온도 보다 20 ° c.에 저장 한다
2. PAE 바인딩 버퍼의 490 µ L에서 100 µ M 풀₀(10¹⁴-10¹⁵ 시퀀스 ~1.0 nmol) 10 µ L를 희석. 95 ° C 10 분 장소에서 물 목욕 세트에 얇은 원심 분리기 튜브에 5 분 동안 얼음에 튜브 수영장₀ aliquots (5 × 100 µ L)를 열 고 후 실 온 (25 ° C이이 작품에서)에서 5 분 동안 튜브를 품 어 합니다.
3. 선택의 첫 번째 라운드: 수영장₀ 과 DBP−NH₂−coated 매체의 부 화.
   1. DBP−NH₂−coated 매체의 200 µ L PAE 바인딩 버퍼의 500 µ L로 세 번 세척. 혼합 DBP−NH₂−coated 매체와₀ 수영장 하 고 가벼운 떨고 아래 1 시간 실 온에서 혼합물을 품 어.
   2. 별도 DBP−NH₂−coated 매체 aptamers와 언바운드 DNAs에서에 의해 구속 한 usingan 한 튜브 100 kDa의 분자 잘라. 4 ° c.에서 10 분 동안 9,168 × g에서 매체 PAE 바인딩 버퍼 및 원심 분리기의 500 µ L로 세 번 세척
4. 선택의 첫 번째 라운드: DBP−NH₂−coated 매체에서 aptamer 차입.
   1. 씻어 매체 및 열 떨고 아래 9 분 동안 90 ° C에 혼합물 PAE 바인딩 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다.
   2. 한에 의해 eluted DNAs를 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다. 세 번 더 바인딩된 DNAs를 복구 하려면이 차입 프로세스를 반복 합니다.
5. 선택의 첫 번째 라운드: PCR
   1. 작은 규모 PCR
      1. 소규모 PCR²³ (4 × 20 µ L aliquots) ~ 15-30을 사용 하 여 수행 주기. PCR 반응²⁴ 를 다음과 같이 설정: RNase 무료 물 6.5 µ L, 10 µ M 뇌관의 1 µ L (FP, 포₄-RP, 0.01 nmol), 1.5 µ L eluted 풀 섹션 3.4 (또는 부정적인 컨트롤로 RNase 무료 물), 및 10 µ L의 혼합 반응 혼합물을 포함 하 중 합 효소, 및 2 × PCR 반응 버퍼 (20 m m tris· dNTPs, 뜨거운 시작 HCl, 100 m m KCl, 3 m m MgCl₂, pH 8.3).
      2. 다음 설정을 가진 열 cycler를 사용 하 여 PCR을 실행: 95 ° c, 1 분; 1 주기 30의 주기 [95 ° C, 30 s. 56 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 72 ° C, 2 분 및 4 ° c.에서 개최의 1 주기 악기의 15, 20, 25, 확장 단계 20^일 s 및 30 주기 일시 중지 키를 눌러 실행 하는, 경우 악기 덮개를 열고, 한 튜브를 타고 PCR 재개를 다시 일시 중지 키를 누릅니다.
      3. 12% 변성 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)^25,26준비. 혼합 요소, 초 순수한 물, 10 × 트리 스/붕 소 산의 1 mL 6 mL의 4.8 g/에틸렌 diamine tetraacetic 산 (TBE), 40% 아크릴 3 mL, 10 µ L tetramethylethylenediamine (TEMED), 및 100 µ L 10% 염화 persulfate (AP)의 순서 대로. 잘 저 어을 1.5-2 h 젤 완전히 굳은 되도록 기다립니다.
      4. 사이클 최적화의 결과 분석: 각 PCR 제품의 1 µ L를 결합 하 여 RNA 선적 버퍼 (62.5 %formamide, 0.4 M 포름알데히드, 1.25×3-(N-morpholino) propansulfonic 산 버퍼, 0.02% 자일 렌 cyanol FF, 0.02 %bromophenol 파랑)의 5 µ L와 4 µ L의 RNase 무료 물; 10 분 동안 95 ° C에 혼합물을가 열 하 고 신속 하 게 얼음; 0 ° C에 냉각 실내 온도;에 5 분 동안 품 어 12%의 5 별도 우물으로 부하 변성 페이지; 수직 전기 시스템 1 × TBE buffer 170 V 45 분에에서 의해 전기를 실행 합니다.
      5. 전기 이동 법, 얼룩 1 × 핵 산 젤의 3 µ L로 젤 10 분, 1 × TBE 버퍼의 30 mL에 얼룩 그리고 젤의 이미지 후.
   2. 대형 규모 PCR: 원치 않는 부산물 없이 올바른 크기 표시에서 높은 강도 밴드를 생산 하는 사이클의 적절 한 수를 선택 합니다. 대규모 PCR (20 × 100 µ L aliquots) 조건 및 적절 한 수의 사이클 3.5.1 단원에 결정을 활용 하 여 수행 합니다.
      참고: 얻을 수 있는 단일 가닥 라이브러리의 최종 금액은 PCR, 아니라 서식 파일의 농도의 전체 볼륨에 비례 합니다. 일반적으로, 라이브러리의 1 nmol를, 단일 가닥 풀 2 mL PCR 필요 합니다. PCR은 매우 민감하고 외부 DNAs에 의해 쉽게 오염. 오염, 장갑을 끼고, 멸 균된 팁을 사용 하 여, 하지는 튜브에 뱉 고 원심 분리 이전 PCR 튜브의 뚜껑을 열지 않는 등의 기회를 줄이기 위해 조치를 취해야 한다.
6. 선택의 첫 번째 라운드: 에탄올 강수량으로 PCR 제품의 정화.
   1. PCR 혼합물의 2 개의 튜브를 결합 하 여 하나의 관 (200 µ L 각)으로. 모든 튜브에 대해 이것을 반복 합니다.
   2. 나트륨 아세테이트 (3 M, pH 5.2) 솔루션의 15 µ L, DNA/RNA 강수량 캐리어 솔루션, 4 µ L 및 2.5 배 사전 냉각된 에탄올의 볼륨-20 ° C에서 각 관에 추가 합니다. 균등 하 게 그들을 믹스.
      참고: DNA/RNA 강수량 운반대는에서 널리 이용 에탄올 강수량 실험 크게 낮은 농도에서 DNA/RNA의 복구 비율을 개선 하기 위해. 그것은 PCR 및 시퀀싱과 같은 다운스트림 응용 프로그램을 방해할 하지 않습니다.
   3. 4 ° C에서 20 분 동안 20,627 × g에서 혼합물을 원심 신중 하 게는 상쾌한 삭제 하 고 백색 침전을 떠나.
   4. 전 강 수를 씻어 각 관으로-20 ° C에서의 에탄올 용액을 냉각 하는 70%의 400 µ L를 추가 합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 20,627 × g에서 혼합물을 원심 신중 하 게는 상쾌한 삭제 하 고 백색 침전을 떠나. 두 번 더 세척 단계를 반복 합니다.
   5. 열고 튜브 커버; 녀석이 봉인 막; 투명 한 백색 침전 될 때까지 열 블록에 40 ° C에서 volatilize 에탄올을 하자. -20 ° c.에 침전을 저장
      참고: 순화 된 PCR 제품-20 ° c.에 저장 될 수 있다
7. 선택의 첫 번째 라운드: λ exonuclease 반응 phosphorylated 역방향 가닥 소화를 수행 하 여 단일 가닥 DNA 생성 (풍부한 풀₁세대).
   1. 작은 규모 λ exonuclease 반응
      1. 섹션 3.6에서에서 순화 된 PCR 제품을 포함 하는 1 개의 관에 RNase 무료 물 100 µ L를 추가 합니다. 와 동 튜브를 튜브에 침전을 완전히 해산.
      2. 5 원심 분리기 튜브를 준비 하 고 각 관으로 무료 물, 그리고 2 µ L 10 × 반응 버퍼 (670 m m 글리신-코, 25 m m MgCl₂ , 0.1% (v/v) 트라이 톤 X-100 pH 9.4)의 위의 솔루션의 RNase-11 µ L의 5 µ L를 추가 합니다.
      3. 물 또는 희석된 λ exonuclease 포함 된 솔루션 2 U, 5 U, U, 8 및 10 U λ exonuclease이이 튜브에 각각의 2 µ L를 추가 합니다. 잘 부드럽게 pipetting으로 솔루션을 믹스. 10 × 반응 버퍼 공급자 λ exonucleasefrom 함께 제공 됩니다.
      4. 37 ° C, 80 ° C에서 15 분에서 35 분에 대 한 튜브를 품 어 및 4 ° c.에서 개최
      5. 12% 기본 페이지를 준비 합니다. 매우 순수한 물, 10 × TBE, 40% 아크릴, 10 µ L TEMED의 그리고 10%의 100 µ L의 3 mL의 1 mL 6 mL를 혼합 AP, 그 순서 대로. 잘 저 어 하 고 젤 완전히 굳은 것을 보장 하기 위해 60-90 분을 기다립니다.
      6. 5 µ L 각 반응의 염료와 물의 RNase 무료, 4 µ L을 로드 하 고 12% 기본 페이지 (45 분 150 V)의 5 별도 우물으로이 혼합물을 로드의 1 µ L와 결합 하 여 반응의 결과 분석 합니다.
         참고: 20 bp 이중 가닥 DNA 사다리는 젤에 적재 될 수 있다도 하지만 그것은 필요 하지 않을지도 때문에 젤에 PCR 제품 및 생성 된 단일 좌초 라이브러리의 독특한 밴드 쇼.
         참고: λ exonuclease 반응은 우수한 구조 선택도 있다. (반대로 감각 가닥 5' 끝 인산 염 그룹으로 표시 됩니다) 더블-좌초 PCR 제품 꽤 넓은 농도 범위 (그림 4)에서 λ exonuclease의 단일 가닥 도서관으로 완전히 소화 될 수 있다. Λ exonuclease 완전히 작은 규모 λ exonuclease 반응에서 단일 가닥 DNA를 생성할 수 있는 최소 금액은 대규모 λ exonuclease 반응에도 사용 됩니다. Λ exonuclease의 구조 선택과 제품 수율을 잃지 않고 넓은 농도 범위에서 잘 작동 하는 이후, λ exonuclease의 높은 농도 또한 사용할 수 있습니다. Λ exonuclease 반응 소금의 높은 농도 의해 억제 됩니다. PCR 제품의 불완전 한 소화는 일반적으로 너무 많은 소금을 PCR 제품에서 존재 한 ㄴ 다는 것을 의미 합니다. 에탄올 강수량 (섹션 3.6)에 의해 PCR 제품의 정화 소 프로 파 놀 강수량에 매우 자주에 의해 순화 하는 PCR 제품 너무 많은 소금을 포함 하는 동안 일반적으로이 단계와 호환 됩니다.
   2. 대규모 λ exonuclease 반응: Λ exonuclease 완전히 대규모 λ exonuclease 반응에 대 한 단일 좌초 된 DNAs를 생성할 수 있는 최소 금액을 선택 합니다. 반응 비율이 조건에 따라 축척 됩니다. 예: 2 U λ exonuclease 필요한 최소 금액 인 경우에, 혼합 Rnase 무료 물 38 µ L, 버퍼 x 10의 10 µ L, DNA 풀₁ 의 50 µ L, 2 µ L 10 U / µ L λ exonuclease의.
8. 선택의 첫 번째 라운드: 에탄올 강 수에 의해 단일 가닥 풀₁ 의 정화.
   1. 3.6 단계의 지시를 따릅니다.
   2. 농도 260에 UV 흡수에 의해 풀₁ 정화 결정 nm.
   3. PAE 바인딩 버퍼의 적절 한 볼륨에 90% 정화 풀₁ reconstitute 선택의 다음 라운드에 대 한 얻은 충분 한 DNA 없는 경우 섹션 3.5 3.8.2 반복 합니다.
      참고: PAE 바인딩 버퍼의 볼륨 보통 다릅니다 200에서 500 µ L 도서관과 SELEX의 다음 라운드에서 라이브러리의 원하는 최종 농도의 양에 따라.
9. 두 번째, 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 SELEX의 라운드.
   1. 셋째, 넷째, 두 번째, 실시 그리고 ~ 300 pmol 라이브러리 선택 엄중을 증가 하기 위하여 입력 했다를 제외 하 고 동일한 절차를 수행 하는 이후 SELEX의 다섯 번째 라운드 (섹션 3.2-3.8), 위에서 설명한.
   2. 매체에 DNAs의 일반적인 흡수를 최소화 하기 위해 세 번째에서 30 분 동안 회전 통에 수정 되지 않은 매체와 수영장을 품 어 그리고 DBP−NH₂−coated 매체를 가진 외피 이전 선택 4 라운드.
      참고: SELEX 프로세스 때문에 젤으로 마이그레이션할 않았다 높은 분자량 제품의 다량에 의해 밝혀 DNAs 사이 심각한 crosslink 다섯 번째 라운드에서 종료.

4. 높 처리량 연속

1. 호환 뇌관으로 PCR 증폭에 의해 풀₄ 섹션 3.9.2에서에서 시퀀싱 준비.
   1. 디자인과 합성 6 인덱싱된 앞으로 뇌관 순서 분석을 촉진 하기 위하여 5 ' 끝에 nt.
      앞으로 뇌관 (FP-시퀀싱) 색인: 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3'
   2. 1000 µLPCR 반응을 다음과 같이 설정: RNase 무료 물 380 µ L, 각 10 µ M 뇌관의 50 µ L (FP-시퀀싱, 포₄-RP, 0.5 nmol), eluted 풀 섹션 3.9.2에서 20 µ L 고의 500 µ L dNTPs를 포함 하는 반응 혼합물을 혼합, 뜨거운 시작 하는 중 합 효소 그리고 2 × PCR 반응 버퍼. 약 수 10 PCR 튜브로 혼합물입니다. 3.5.1.2 섹션에 설명 된 대로 동일한 PCR 상태를 사용 합니다.
2. 시퀀싱 시설 요구 사항에 맞게 PCR 제품을 정화. 예를 들어, 제조업체의 지침에 따라 페이지 젤 DNA 복구 키트를 사용 하 여.
3. 시퀀싱 시설에 필요한 운송 조건 하에서 시퀀싱 시설 정화 PCR 제품 (~ 2 µ g)를 보냅니다. 예를 들어 철저 하 게 시퀀싱 시설에 얼음 팩으로 밀봉 하는 모자와 원심 분리기 튜브에 PCR 제품 배.
   참고: 시퀀스 시퀀스 된 수영장의 농축을 평가 하기 위해 각 시퀀스의 복사본 수에 따라 평가 결과 받았다. 최고 시퀀스 DBP-1 선정 됐다 (5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'). 그것의 친 화력 및 선택 다음 프로토콜 (섹션 5, 6)에 의해 측정 되었다. 전기 화학 바이오 센서에 응용 프로그램의 이후 섹션 7에서에서 시연 했다.

5. K_d 결정의 선정 Aptamer 후보자 Magnetic Bead-Based 정량 PCR (정량)를 사용 하 여

1. DBP-1-정량과 표준 phosphoramidite 화학을 사용 하 여 뇌관 synthesize 하 고 표준 HPLC에 의해 그것을 정화.
   Aptamer 후보 (DBP-1-정량): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
   앞으로 정량 (FP-정량)에 대 한 입문서: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
   반전 뇌관 정량 (라인란트-정량)에 대 한: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
   참고: 테스트 시퀀스의 뇌관 지역 수영장₀ 섹션 3에서에서 사용 된 그들에서 다르다. 뇌관 지역 변경의 목적은 혼자, 뇌관 영역을 제외한 핵심 시퀀스의 선호도 테스트 하는.
2. DBP NH₂ carboxylic 산 코팅 자석 구슬 제조 업체의 지침에 고정
   1. 워시 25 m m 2-(N-morpholino)로 두 번 carboxylic 산 코팅 자석 구슬 ethanesulfonic 산 (MES) (pH 5.0)를 사용 하 여 자석 구슬 (100 µ L)의 동일한 볼륨 pipetted 유리병, 중 (이상 끝 또는 이와 유사한) 좋은 혼합과 10 분.
   2. 즉시 사용 하기 전에, 50 mg/mL 찬 25 mM MES (pH 5.0)와 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 염 산 염 (EDC) 솔루션의 준비.
   3. 즉시 사용 하기 전에, 50 mg/mL 찬 25 mM MES (pH 5.0)와 N-hydroxysuccinimide (NHS) 솔루션의 준비.
   4. 씻어 구슬 100 µ L의 EDC 솔루션 및 보 건국 솔루션의 100 µ L를 혼합 하 고 느린 기울기 회전 실 온에서 30 분 동안 품 어.
   5. 부 화 후 4 분에 대 한 자석에 튜브를 넣어, 상쾌한, 삭제 하 고 구슬 찬 25 mm MES (pH 5.0) 100 µ L로 두 번 세척.
   6. 100 mM DBP NH₂ 재고 솔루션 및 느린 기울기 회전 5 rpm에서 실내 온도에 또는 4 ° C에서 2 시간 30 분 이상에 대 한 회전에서 활성화 된 구슬 25 m m MES (pH 5.0, 290 µ L) 6 µ L를 품 어.
   7. 부 화 후 4 분에 대 한 자석에 튜브를 넣어 고는 상쾌한 삭제. 워시 코팅된 구슬 4 번와 PAE 바인딩 버퍼 및 상점 4 ° C에서의 200 µ L와 구슬 사용까지 resuspend.
3. K_d를 결정 하기 위해 적정 곡선을 수집 합니다.
   1. 300에 1 오후에서 PAE 바인딩 버퍼에 다양 한 농도에서 DBP-1 솔루션 (500 µ L)의 시리즈를 준비 nM.
   2. DBP NH₂의 10 µ L 추가-자석 구슬 각 DBP-1 솔루션 5.2.7 섹션에 설명 된 대로 코팅. 회전에서 실 온에서 1 h에 품 어.
   3. 4 분에 대 한 자석에 튜브를 놓고는 상쾌한을 제거 합니다. 씻어 4 번을 사용 하 여 PAE 바인딩 버퍼의 200 µ L 구슬.
   4. 각 튜브를 PAE 바인딩 버퍼의 60 µ L를 추가 합니다. 자기 분리에 의해 eluted DBP-1를 포함 하는 상쾌한 95 ° C 15 분 수집에서 튜브를 품 어. 복구 더 바인딩된 DBP-1 하이 차입 과정을 반복 합니다.
   5. 약 elute 솔루션을 희석 하 고 실시간 정량 pcr 3 µ L. 정량 Pcr 반응에 다음과 같이 설정: RNase 무료 물 3 µ L, 10 µ M 뇌관의 2 µ L (FP, 포₄-RP, 0.01 nmol), 3 µ L의 eluted DBP-1, 희석 및 10 µ L의 혼합 dNTPs, 중 합 효소, 및 2 x PCR 반응 버퍼를 포함 하는 반응 혼합물.
   6. 정량 Pcr 열 cycler를 사용 하 여 다음 설정으로 실행 하 여 각 샘플에서 DBP-1의 숫자를 결정: 95 ° C, 30의 1 사이클 s; 30의 주기 [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 72 ° C, 30 s 및 4 ° c.에서 개최의 1 주기
   7. 적정 곡선을 플롯 하 고 1:1 바인딩 비율²⁷가정 곡선의 비선형 피팅 하 여 K_d 를 결정 합니다.

6. 상대적 선호도 및 경쟁 분석 실험에 의해 특이성 시험

1. DBP NH₂의 10 µ L 추가-자석 구슬 DBP-1 솔루션 (500 µ L, 1 µ M) 코팅. 회전에서 실 온에서 1 h에 품 어. 4 분에 대 한 자석에 튜브를 놓고는 상쾌한을 제거 합니다. 4 번 PAE 바인딩 버퍼의 200 µ L를 사용 하 여 구슬을 세척 하 고 PAE 바인딩 버퍼의 10 µ L에서 resuspend.
2. DBP NH₂의 10 µ L를 추가-각 10 µ M의 110 µ L DBP 1 코팅된 중간 연결 테스트 샘플 (DBP-NH₂, DBP, DEHP, 부 틸 벤 질 phthalate(BBP), 중 금속 이온, 등.) 자기 분리에 의해 1 h. 수집에 상쾌한에 대 한 실 온에서 품 어.
3. 약은 상쾌한을 희석 하 고 정량 정량화에 대 한 3 µ L. 정량 Pcr 반응에 다음과 같이 설정: RNase 무료 물 3 µ L, 10 µ M 뇌관의 2 µ L (FP, 포₄-RP, 0.01 nmol), 3 µ L의 eluted DBP-1, 희석 및 10 µ L의 혼합 dNTPs, 중 합 효소, 및 2 x PCR 반응 버퍼를 포함 하는 반응 혼합물.
4. 정량 Pcr 열 cycler를 사용 하 여 다음 설정으로 실행 하 여 각 샘플에서 DBP-1의 숫자를 결정: 95 ° C, 30의 1 사이클 s; 30의 주기 [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 72 ° C, 30 s 및 4 ° c.에서 개최의 1 주기
5. DBP-1 샘플의 구슬에서 DBP-1 PAE 바인딩 버퍼에 비즈에서 출시 수 출시의 수를 나누어 상대적 선호도 계산: 상대적 선호도 N_샘플/N_버퍼=.

7. 제조 및 DEHP 전기 화학 바이오 센서의 전기 화학 측정

1. Thiolated 코어 시퀀스 (HS-DBP-1)과 표준 phosphoramidite 화학을 사용 하 여 신호 감지기 (DBP-1-C-Fc) synthesize 하 고 표준 HPLC에 의해 그것을 정화.
   HS-DBP-1: 5'-HS-(CH₂)₆-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3 '
   DBP-1-C-Fc: 5'-GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT-(CH₂)₆Fc-3 '
   참고: 센서 프로브의 합리적인 디자인은 우리의 이전 pbulications^18,22에 설명 했다.
2. HS-DBP-1 및 DBP-1-C-Fc 100 µ M, aliquot에서 nuclease 무료 학년 물에서 다시 구성 하 고-20에서 그들을 저장 또는 최대 1 년-80 ° C.
3. 신중 하 게 5 분 동안 microcloth에 1, 0.3, 0.05 µ m Al₂O₃ 가루와 거울 같은 표면에 금 전극 폴란드어 그리고 초순 잔여 Al₂O₃제거 5 분에서 그것을 sonicate. 다음 1.2 V 0.4에서 35 연속 순환 voltammetry (CV) 검사와 전기 화학 연마 하 여 전극을 청소 (Hg Hg₂대 등₄) 0.5 M H₂에서 100 mV/s 등₄ .
4. 0.5 µ M의 HS-DBP-1과 0.5 µ M의 혼합물 준비 DBP-1-C-Fc 100 µ L 10 m m 인산 염 버퍼 1 M NaCl, pH 7.4 (PBS)를 포함 하. 10 분 동안 95 ° C에 물 목욕 세트에 얇은 원심 분리기 튜브에 혼합물을가 열 하 고 천천히 실내 온도에 혼합물을 냉각 하십시오.
5. 혼합물으로 트리 스-(2-carboxyethyl) phosphine 염 (TCEP, 10 m m, 재고 솔루션)의 1 µ L를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 실내 온도에서 보관.
6. 12 h, 위의 솔루션에 깨끗 한 금 전극을 담가 또는 실 온에서 하룻밤.
7. PBS 가진 전극 헹 구 고 담가 1 m m [(채널₂)₂(그리고₂채널₂)₆및₃]₂ 전극 (HS 예₆-오메) 1 헤에 대 한 PBS에 전극 PAE를 사용 하 여 철저 하 게 린스 버퍼 바인딩 및 PAE 바인딩 버퍼에 전극을 담가.
8. 대상 무료 PAE 바인딩 버퍼에서 백그라운드 구형 파 voltammetry (SWV) 검색을 가져가 라.
   1. 모든 실험 장비 청소: 전해 셀, 골드 작업 전극, 플래티넘 카운터 전극, 및 포화 calomel 참조 전극 (SCE).
   2. 설치 된 소프트웨어; SWV 측정에 대 한 실험적인 매개 변수를 설정 합니다.
      참고: 다음 실험 매개 변수 SWV 실험을 위해 사용 되었다: 잠재적인 범위: 0.7 V; 하-0.2에서 진폭 변조: 25 mV; 펄스 폭: 5 ms; 스캔 속도: 50 mV/s; 잠재적인 단계: 1 mV.
   3. 골드 전극, 플래티넘 카운터 전극과 SCE는 potentiostat를 작업을 연결 하 고 PAE 바인딩 버퍼를 포함 하는 전해에 넣어 이들 3 개의 전극.
   4. SWV 측정을 실행 합니다.
      참고: 한 번 SWV 측정 시작 SWV 곡선 됩니다 컴퓨터의 화면에 표시. 검사 검사는 일정 하 고 피크 높이 또는 모양에 더 변경 관찰 때까지 반복 됩니다.
9. 담가 DEHP의 특정 농도 포함 하는 PAE 바인딩 버퍼에 작업 전극 (예를 들어, 10 오후) 실 온에서 30 분. 전극 PAE 바인딩 버퍼를 사용 하 여 철저 하 게 헹 구 고 담가 PAE 바인딩 버퍼 카운터 전극과 SCE 전극. 7.8 섹션에 설명 된 대로 동일한 조건 하에서 SWV 곡선을 수집 합니다.
10. 제외 하 고 반복 단계 7.9, DEHP의 농도 (예를 들어 100 오후, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µ M) 순차적으로 증가 했다. 적정 곡선을 플롯.
11. 특이성 테스트: 제외 하 고는 DEHP를 포함 하는 PAE 바인딩 버퍼 PAE 바인딩 버퍼 원하는 농도에서 잠재적인 간섭 물질을 포함 하 여 대체 7.3-7.9, 단계를 반복 합니다.

Results

우리는 설계 및 아미노 그룹 공업화 틸 프 탈 레이트 (DBP-NH₂) 앵커 대상 (그림 1 층)으로 합성. 우리는 다음 PAEs 클래식 대상 immobilization 기반 방법 (그림 2)에 따라는 DBP NH₂ 앵커 대상으로 사용 하 여 DNA aptamer 선택을 수행 합니다. 각 라운드에서 파일럿 PCR PCR (그림 3)의 주기 수를 최적화 하는 변성된 페이지를 사용 하 여 수행 되었다. 변성된 페이지, 기본 페이지 대신이 우리와 다른 동료 들을 발견 했다 높은 사이클 숫자에서 네이티브 젤에 의심 되 고 분자량 부산물 실제로 가교 복합물에 의해 형성 하기 때문에 좋습니다. 적당 한 크기의 시퀀스입니다. 따라서, 변성된 페이지의 밴드 강도 진정으로 올바른 제품의 금...

Discussion

Aptamers의 뛰어난 이점 중 하나입니다 vivo에서 immunoreactions를 통해 항 체를 생성 하는 동안 그들은 체 외에서 방법을 SELEX 통해 식별 됩니다. 따라서, 항 체는 생리 적 조건에 제한 하는 반면 aptamers 잘 설계 된 실험 조건에서 원하는 대상으로 선택할 수 있습니다.

무료 시퀀스에서 바운드 시퀀스의 분리를 촉진 하기 위하여 몇 가지 수정 된 SELEX 최근 보고 되었습니다, 어떤 모 세관 전기 이동 법³⁰, 마이크로³¹, 자석 / 아크릴 구슬 / agarose 구슬¹⁴, 등, nitrocellulose 필터 또는 선호도 열 보다 효율적인 분리를 달성을 대체 했다. 이러한 기법 중 구슬 기반 방법을 가장 널리 사용 된 aptamer 선택 때문에 그들의 간단한 작은 분자 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV-2550	Shimadzu, 일본		프로토콜, 섹션 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler, PTC0200	BIO-RAD		섹션 3.5.1.2 및 3.5.2
C1000 Touch	BIO-RAD		섹션 5.3.6 및 6.3
VMP3 다중 채널 전위차	Science, Claix, France		섹션 7.4, 7.8 및 7.11
에폭시 활성화 세파로스 6B	GE Healthcare(미국 뉴저지주 피스카타웨이	10220020	argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads	Invitrogen, USA	420420	magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start Version	Takara,Dalian,China	R028A	polymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing Membrane	Bemis, USA	PM-996	section 3.6.5
Lambda Exonuclease	Invitrogen, USA	EN0561	section3.7.1.2.The 10 × 반응 버퍼는 공급자에 의해 λ 엑소뉴클레아제와 함께 제공됩니다.
Dr. GenTLE Precipitation Carrier Takara	, Dalian, China	9094	section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B511135	section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Invitrogen, USA	1811838	nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II	Takara, Dalian, China	RR820A	중합효소 혼합 중합효소 및 dNTP, 섹션 5.3.5
2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES)	시그마-알드리치	CAS: 1132-61-2	섹션 5.2.1
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염(EDC)	인비트로겐, 미국	CAS: 25952-53-8	섹션 5.2.2
N-하이드록시숙신이미드(NHS)	시그마-알드리치	6066-82-6	섹션 5.2.3
메르 캅토 헥산올 (MCH)	시그마 - 알드리치	CAS : 1633-78-9	섹션 7.7
금 전극	상하이 Chenhua	CHI101	섹션 7.4.- 7.11
트리스 (2- 카르 복시 에틸) 포스핀 하이드로 클로라이드 (TCEP)	시그마 - 알드리치	CAS : 51805-45-9	섹션 7.5
O- (2- 메르 캅토 에틸) -O'- 메틸 -헥사 - (에틸렌 글리콜)	시그마 - 알드리치	CAS : 651042-82-9	섹션 7.7
디 에틸 헥실 프탈레이트 (DEHP)	중국 국립 계측 연구소	CAS : 117-81-7	섹션 7.11
트윈 20	시그마 -알드리치	CAS : 9005-64-5	폴리 옥시 에티 렌 (20) 소르 바이탄 모노 라우 레이트
트리톤 X-100	시그마 알드리치	CAS : 9002-93-1	비이온 계 활성제
PBS	시그마-알드리치	P5368	10 mM 인산염 완충제 1M NaCl, pH 7.4 함유