생체 외에서 선택 및 그룹 관련 phthalic 산 에스테 르-바인딩 DNA aptamers의 특성화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 전기 aptasensor에서 선택 된 aptamer의 응용 프로그램이 포함 되어 있습니다.
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방법 논문
Phthalic 산 에스테 르-바인딩 DNA Aptamer 선택, 특성, 및 전기 화학 Aptasensor 응용 프로그램
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
지속적인 유기 오염 물질의 주요 그룹의 phthalic 산 에스테 르 (PAEs) areone. PAEs의 그룹 전용 탐지는 congeners의 급속 한 성장으로 인해 매우 원한다. 점점 더 인식 요소 바이오 센서 플랫폼에 적용 된 DNA aptamers 하지만 선택 aptamers PAEs, 등 매우 소수 성 분자 표적으로 보고 거의. 이 작업 그룹-특정 DNA aptamers PAEs 선택 하도록 설계 된 비드 기반 방법을 설명 합니다. 아미노 그룹 공업화 틸 프 탈 레이트 (DBP-NH2) 앵커 대상 합성 했 고 에폭시 활성화 agarose 구슬에 움직일 immobilization 매트릭스의 표면에서 phthalic 에스테 르 그룹의 표시를 허용 하 고 따라서 그룹 전용 바인더의 선택. 자력 분리와 결합 하는 정량적 중 합 연쇄 반응에 따라 aptamer 후보자의 분리 상수 하 고. 상대 선호도 다른 PAEs에 aptamers의 선택도 경쟁 분석 실험에 의해 결정 되었다 aptamer 후보 DBP NH2 미리 경계 했다 연결 된 자석 구슬, 가진 외피에 상쾌한에 발표 테스트 PAEs 또는 다른 잠재적인 간섭 물질입니다. 경쟁 분석 결과 표면 동원 정지에 대 한 기능 그룹이 했다 PAEs 중 손쉬운 선호도 비교를 제공 하기 때문에 적용 되었다. 마지막으로 우리 전기 aptasensor의 제작을 시연 하 고 bis(2-ethylhexyl) 프 탈 레이트의 磁 및 선택적 검출을 위해 사용. 이 프로토콜 다른 소수 작은 분자의 aptamer 발견에 대 한 통찰력을 제공합니다.
서론
급속 한 경제 발전, 함께 산업화, 그리고 도시 건설, 환경 오염의 가속 그 어느 때 보다 더 심각 하다. 일반적인 환경 오염 물질 중 금속 이온, 독 소, 항생제, 농약, 내 분 비 분리기와 지속적인 유기 오염 물질 (Pop)을 포함합니다. 금속 이온과 독 소, 외 다른 오염 물질은 작은 분자는 꽤 congeners의 다양 한 구성 됩니다. 가장 독성 Pop 비페닐 (PCBs), 다 환 방향족 탄화수소 (PAHs), 폴 리 브롬 화 비페닐 에테르 (PBDEs), polychlorinated dibenzo-p-다이옥신 (PCDDs), polychlorinated dibenzofuran (PCDFs)를 포함 하는 예를 들어 고 phthalic 산 에스테 르 (PAEs)1,-2모든 많은 congeners의 구성. 작은 분자 검출 크로마토그래피/질량 분석 기반 기술을 응용 프로그램3,4,,56의 그들의 다양성 때문에 의해 주로 수행 되었습니다. 사이트 검색에 대 한 ....
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프로토콜
1. 라이브러리 및 뇌관 설계 및 합성
-
디자인 초기 라이브러리 및 뇌관.
라이브러리 (풀0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-n 40를 자동차-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
뇌관 (FP)를 전달: 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
반전 뇌관 phosphorylated (포4-라인란트): 5'-포4-GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3' - 합성 풀0, FP, 및 포4-RP 표준 phosphoramidite 화학18,,1920를 사용 하 여 표준-고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)21에 의해 모든 DNAs를 정화.
- 수영장0, FP, 및 포 reconstitute4-RP nuclease 무료 학년에서 100 µ M, aliquot에서 물 및-20에서 그들을 저장 또는 최대 1 년-80 ° C.
참고:이 좋....
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결과
우리는 설계 및 아미노 그룹 공업화 틸 프 탈 레이트 (DBP-NH2) 앵커 대상 (그림 1 층)으로 합성. 우리는 다음 PAEs 클래식 대상 immobilization 기반 방법 (그림 2)에 따라는 DBP NH2 앵커 대상으로 사용 하 여 DNA aptamer 선택을 수행 합니다. 각 라운드에서 파일럿 PCR PCR (그림 3)의 주기 수를 최적화 하는 변성된 페이지를 사용 하 여 수행 되었다. 변성된 페이지, 기본 페이지 대신이 우리와 다른 동료 들을 발견 했다 높은 사이클 숫자에서 네이티브 젤에 의심 되 고 분자량 부산물 실제로 가교 복합물에 의해 형성 하기 때문에 좋습니다. 적당 한 크기의 시퀀스입니다. 따라서, 변성된 페이지의 밴드 강도 진정으로 올바른 제품의 금.......
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토론
Aptamers의 뛰어난 이점 중 하나입니다 vivo에서 immunoreactions를 통해 항 체를 생성 하는 동안 그들은 체 외에서 방법을 SELEX 통해 식별 됩니다. 따라서, 항 체는 생리 적 조건에 제한 하는 반면 aptamers 잘 설계 된 실험 조건에서 원하는 대상으로 선택할 수 있습니다.
무료 시퀀스에서 바운드 시퀀스의 분리를 촉진 하기 위하여 몇 가지 수정 된 SELEX 최근 보고 되었습니다, 어떤 모 세관 전기 이동 법30, 마이크로31, 자석 / 아크릴 구슬 / agarose 구슬14, 등, nitrocellulose 필터 또는 선호도 열 보다 효율적인 분리를 달성을 대체 했다. 이러한 기법 중 구슬 기반 방법을 가장 널리 사용 된 aptamer 선택 때문에 그들의 간단한 작은 분자 .......
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공개 사항
저자는 경쟁 금융 관심을 선언합니다.
감사의 글
우리는 국립 자연 과학 재단 (21675112), 베이징 교육 위원회 (KZ201710028027)와 Yanjing 젊은 학자 프로그램의 수도 사범 대학의 과학 및 기술 계획의 프로젝트에서에서 재정 지원에 대 한 감사.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| UV-2550 | Shimadzu, 일본 | 프로토콜, 섹션 3.8.2 | |
| DNA Engnine Thermal cycler, PTC0200 | BIO-RAD | 섹션 3.5.1.2 및 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | 섹션 5.3.6 및 6.3 | |
| VMP3 다중 채널 전위차 | Science, Claix, France | 섹션 7.4, 7.8 및 7.11 | |
| 에폭시 활성화 세파로스 6B | GE Healthcare(미국 뉴저지주 피스카타웨이 | 10220020 | argarose beads, section 2.3 and 3.3 |
| Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads | Invitrogen, USA | 420420 | magnetic beads,section 5.2. and 5.3 |
| Premix Taq Hot Start Version | Takara,Dalian,China | R028A | polymerase, section 3.5.1.1 |
| PARAFILM Sealing Membrane | Bemis, USA | PM-996 | section 3.6.5 |
| Lambda Exonuclease | Invitrogen, USA | EN0561 | section3.7.1.2.The 10 × 반응 버퍼는 공급자에 의해 λ 엑소뉴클레아제와 함께 제공됩니다. |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier Takara | , Dalian, China | 9094 | section 3.6.2 and 3.8.1 |
| UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B511135 | section 4.2 |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Invitrogen, USA | 1811838 | nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5 |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara, Dalian, China | RR820A | 중합효소 혼합 중합효소 및 dNTP, 섹션 5.3.5 |
| 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES) | 시그마-알드리치 | CAS: 1132-61-2 | 섹션 5.2.1 |
| 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염(EDC) | 인비트로겐, 미국 | CAS: 25952-53-8 | 섹션 5.2.2 |
| N-하이드록시숙신이미드(NHS) | 시그마-알드리치 | 6066-82-6 | 섹션 5.2.3 |
| 메르 캅토 헥산올 (MCH) | 시그마 - 알드리치 | CAS : 1633-78-9 | 섹션 7.7 |
| 금 전극 | 상하이 Chenhua | CHI101 | 섹션 7.4.- 7.11 |
| 트리스 (2- 카르 복시 에틸) 포스핀 하이드로 클로라이드 (TCEP) | 시그마 - 알드리치 | CAS : 51805-45-9 | 섹션 7.5 |
| O- (2- 메르 캅토 에틸) -O'- 메틸 -헥사 - (에틸렌 글리콜) | 시그마 - 알드리치 | CAS : 651042-82-9 | 섹션 7.7 |
| 디 에틸 헥실 프탈레이트 (DEHP) | 중국 국립 계측 연구소 | CAS : 117-81-7 | 섹션 7.11 |
| 트윈 20 | 시그마 -알드리치 | CAS : 9005-64-5 | 폴리 옥시 에티 렌 (20) 소르 바이탄 모노 라우 레이트 |
| 트리톤 X-100 | 시그마 알드리치 | CAS : 9002-93-1 | 비이온 계 활성제 |
| PBS | 시그마-알드리치 | P5368 | 10 mM 인산염 완충제 1M NaCl, pH 7.4 함유 |
참고문헌
- Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
- Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B.
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