방법 논문

역동적이 고 전기 이동 산란 분석 바인딩 DNA-마그네틱 입자

DOI:

10.3791/56815

⸱

2017년 11월 9일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, 2Central European Institute of Technology, Brno University of Technology

이 논문에서

요약

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이 프로토콜 자석 입자의 합성 및 역동적이 고 전기 이동 산란을 통해 그들의 DNA 바인딩 속성의 평가 설명합니다. 이 방법은 그들의 증가할수록 입자 크기에서 변화를 모니터링에 집중 하 고는 입자 표면의 제타 전위 주요 바인딩에 DNA와 같은 재료의 역할.

초록

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자성 입자를 사용 하 여 DNA의 분리는 생명 공학 및 분자 생물학 연구에 높은 중요성의 필드입니다. 이 프로토콜 통해 동적 산란 (DL) 및 전기 이동 산란 (ELS) 바인딩 DNA-마그네틱 입자의 평가 설명 합니다. DL 분석 입자 크기, 증가할수록, 잠재적인 제타 등 입자의 물리 화학적 특성에 귀중 한 정보를 제공 합니다. 후자의 설명 표면 입자는 DNA와 같은 재료의 정전기 바인딩에 주요 역할을 담당을 합니다. 여기, 비교 분석 3 화학 수정 미, 나노 입자와 DNA 바인딩 및 차입에 대 한 그들의 효과 이용 한다. 화학 수정에 의해 분기 polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate 및 (3-aminopropyl) triethoxysilane 조사. 이후 DNA 음 전 전시, 입자 표면의 제타 전위의 DNA 바인딩 시 줄어 전망 이다. 클러스터의 형성 입자 크기에 영향을 또한 한다. 격리에서 이러한 입자의 효율성과 DNA의 차입을 조사 하기 위하여 입자는 낮은 pH (~ 6), 이온 강도 및 탈수 환경에 DNA와 혼합 됩니다. 입자는 자석에 세척 되 고 다음 DNA는 eluted Tris HCl 버퍼에 의해 (pH = 8). DNA 복사 번호 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)를 사용 하 여 추정 된다. 제타 전위, 입자 크기, 증가할수록 및 PCR 양적 평가 하 고 비교 됩니다. DL는 통찰력과 지원 DNA 격리에 대 한 입자의 심사 과정에 새로운 관점을 추가 하는 분석 방법 이다.

서론

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DNA 분리 분자 생물학에서 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 핵 산 추출 방법의 개발 유전체학, metagenomics, epigenetics, 및 transcriptomics의 신흥 분야에 큰 영향을가지고. DNA 분리 등 의료 (법의학/진단 도구와 전조 생체), 바이오 응용 프로그램 및 환경 응용 프로그램 (metagenomic 생물 다양성, 병원 체, 정도와 감시)의 넓은 범위가 있다. 정화 하 고 다른 비늘 같은 혈액, 소변, 토양, 나무, 그리고 샘플의 다른 종류와 다른 자료에서 DNA를 분리 하는 수요 증가 되었습니다. 1 , 2 , 3 , 4

나노 및 마이크로 크기의 입자는 DNA 분리 및 특히 그들의 높은 표면적 때문에 적합 때 그들은 자기장에 의해 움직일 수 있다. 입자 크기, 충전 등의 물리 화학적 특성 크게 대상 생체를 바인딩할 그들의 능력을 좌우할 수 있다. 5 추가 바인딩 생체의 향상 그리고 입자를 안정화, 다른 화학 수정 (표면 코팅) 활용할 수....

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프로토콜

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1. 마그네틱 나노 입자 합성

    1. FeCl 3의 추가 20 mmol 시트르산 (MNPs)와 자성 나노 입자의 합성 안정화
    2. ∙ 6 H 2 O (5.406 g) 및 FeCl의 10 mmol 2 ∙ 4 H 2 O (1.988 g) deoxygenated 이중 증 류 물 (ddd) 20 mL에. 투명 한 솔루션을 얻을 때까지 기계적인 교 반기를 사용 하 여 N 2 분위기에서 비 커에 적극적으로 솔루션을 얻은 볶음.
    3. 빠른 기계적 교 반, 아래 150 mL의 1 M NH 4 오, 드롭 들러 떨어지고 퍼 널 (1 시간 또는 더 필요한 경우)를 사용 하 여 추가. 모든 NH 4 오 추가 되는 솔루션 screwable 그릇에 전송 합니다. 30 분에 75 ° C에서 선박 및 열 솔루션을 스크류
      주의: NH 4 오는으로 분류 부식성 환경에 대 한 위험.
      참고: 높은 학년 28% NH 4 deoxygenated 물을 사용 하 여 물에 오에서에서 NH 4 오 솔루션 준비.

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결과

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화학 합성 및 자성 입자의 수정에 대 한 여기에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 6 마그네틱 입자 합성 되었고 DNA 바인딩 분석. 분석 요약 표 1에 표시 됩니다. 바인딩 솔루션과 물에서 입자의 크기를 비교 하 여 그것은 분명 모든 입자 2-22 겹으로 솔루션 바인딩 집계. 어떤 입자는 더 DNA;의 더 많은 주름을 집계 그러나이 되지 직접 상관 DNA 검색 양이 많은 PCR (표 1)에 의해 감지. 제타 잠재적인 (10 ~ 2 분 간격으로 측정) 세 입자; 보여주었다 DNA 날카로운 드롭 대 컨트롤에 입자의 비교 즉: MNPs_APTES, MMPs_TEOS 및 MMPs_APTES (그림 2). 시간이 지남에 따라 잠재적인 제타 동향도 전에 그들은 대부분의 경우 (그림 3) 안정화는 처음 세 개의 수치.......

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토론

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이 프로토콜에서 제타 잠재적인 통해 자기 입자를 DNA 바인딩 설명 하는 이론적 원리 질문에서 했다. 프로토콜 합성 및 자성 나노 입자와 미의 수정에 설명합니다. DNA 제어 및 바인딩 솔루션의 준비를 위한 방법 또한 설명 합니다. 여기에 표시 된 두 가지는 DNA 입자 상호 작용의 심사에 대 한: 양이 많은 PCR 그리고 DL 접근. DL의 입자의 물리 화학적 변화 세 가지 지표를 제공 합니다: 입자 크기, 증가할수록 색인 및 잠재적인 제타. 입자 크기 변화는 직접 집계 또는 분해 작용을 나타냅니다. 증가할수록 인덱스 값 monodispersed에서 배열 하는 시스템에서 입자의 분포에 설명 합니다 (인덱스 < 0.05) 높은 polydispersed를 (색인 > 0.7). 제타 잠재적인 입자 어디 매우 긍정적인 입자 표시 값 보다 30 mV와 매우 부정적인 입자 값 표시-30 보다 큰 표면 충전에 따라 분류할 수 있다 뮤직 비디오. 예측, 상대적으로 솔루션 바인딩 polycharged 자석 입자의 zeta 잠재력.......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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체코 과학 재단 (프로젝트가 CR 17-12816S) 및 CEITEC 2020 (LQ1601)에 의해 금융 지원은 크게 인정 했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
철 (III) 염화물 육수화물시그마 -알드리치207926자분 합성
철 (II) 염화물 사수화물시그마 -알드리치380024자분 합성
철 (II) 황산 헵타 하이드레이트시그마 -알드리치F8263자분 합성
아세톤펜타10060-11000자분 합성
구연산나트륨 이수화물시그마-알드리치W302600자분립 합성
테트라에틸 오르토실리케이시그마-알드리치131903자분 합성
(3-아미노프로필)트리에톡시실란시그마-알드리치440140자분 합성
폴리에틸렌이민, 분지, 평균 Mw ~25,000시그마-알드리치408727자성 입자 합성
수산화암모늄 용액Sigma-Aldrich221228-M 자분 입자 합성
EthanolPenta71250-11000자분 합성
질산 칼륨Sigma-AldrichP6083자분 합성
수산화 칼Sigma-Aldrich1.05012자분 합성
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)Spectrum labsG235063자분 합성
오버헤드 교반기witeg Labortechnik GmbHDH. WOS01035자분 합성
WaterbathMemmert GmbH + Co.84198998자분 합성
SonicatorBandelin795자분 합성
BRAND UV 큐벳 마이크로Sigma-AldrichBR759200-100EA크기 측정용 큐벳
UV 큐벳 마이크로 용 브랜드캡 Sigma-AldrichBR759240-100EA크기 측정용 큐벳 캡
접힌 모세관 제타 셀MalvernDTS1070제타 전위 측정을 위한 큐벳
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600크기 및 제타 전위 측정을 위한 장치
Infinite 200 PRO
NanoQuant 기기		Tecan396 227 V1.0, 04-2010DNA 농도 측정을 위한 장치
SYBR Green Quantitative RT-PCR KitSigma-AldrichQR0100PCR kit
Mastercycler pro S 기기: Eppendorf6325 000.013Thermocycler
MinElute 키트Qiagen28004DNA 정제 키트
, 아세트산나트륨Sigma-AldrichS7670DNA 결합
트 륨 , , , , ,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
  2. Loonen, A. J. M., et al.

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재인쇄 및 허가

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