Method Article

Cardiomyocyte 시스템 생물학에서 세포 아키텍처의 역할을 연구 하기 Cardiomyocyte의 구조적으로 현실적인 유한 요소 형상 모델 생성

DOI:

10.3791/56817

⸱

April 18th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Structure and Mechanobiology Group, University of Melbourne, 2Systems Biology Laboratory, Melbourne School of Engineering, University of Melbourne, 3Department of Biomedical Engineering, University of Melbourne, 4School of Mathematics and Statistics, Faculty of Science, University of Melbourne, 5Department of Engineering Science, University of Auckland, 6Advanced Microscopy Facility, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 7ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, University of Melbourne, 8School of Medicine, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 9Living Systems Institute, University of Exeter

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 전자 현미경 검사 법 그리고 confocal 현미경 검사 법 심상에서 cardiomyocytes의 세포내 구조의 공간적 상세한 유한 요소 모델을 생성 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 이 공간 세부 모델의 파워는 칼슘 신호 및 생체에서 사례 연구를 사용 하 여 보여 줍니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3 차원 (3D) 영상 기술 전자 단층 촬영 등의 출현으로 시리얼-블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 법 그리고 confocal 현미경 검사 법, 과학계는 큰 데이터 집합에 액세스할 수 전례 없는 서브 마이크로미터에서 건축 개장 특징 해상도 cardiomyocyte 기능 건강 및 질병에 있는 변화를 동반 한다. 그러나, 이러한 데이터 집합 조사 cardiomyocyte 함수에 개장 하는 세포질 건축의 역할에 대 한 아래에 활용 되었습니다. 이 프로토콜의 목적은 cardiomyocyte 고해상도 전자 현미경 검사 법 그리고 confocal 현미경 이미지를 사용 하 여의 정확한 유한 요소 모델을 생성 하는 방법을 개요입니다. 세포질 건축의 상세 하 고 정확한 모델 cardiomyocyte 생물학, 실험 혼자 올릴 수 보다 더 많은에 대 한 새로운 통찰력을 제공 하기 위해 상당한 잠재력이 있다. 이 방법의 계산 cardiomyocyte는 cardiomyocyte의 한 통합 하 고 상세한 모델을 개발 하는 열 대권 외의 두 개의 서로 다른 이미지 형식에서 정보를 융합 하는 능력에 있다. 이 프로토콜은 전자 단층 촬영과는 cardiomyocyte의 반 sarcomere 유한 요소 모델을 개발 하기 위해 성인 남성 Wistar (알 비 노 쥐의 특정 품종에 대 한 이름) 쥐 cardiomyocytes의 confocal 현미경 이미지를 통합 하는 단계를 설명 합니다. 한 정확 하 고, 고해상도 묘사를 포함 하는 3 차원 유한 요소 모델을 생성 하는 절차 (순서 ~ 35 nm) 미토 콘 드리 아, myofibrils cardiomyocyte에 필요한 칼슘을 풀어 ryanodine 수용 체 클러스터 배포의 myofibril와 cytosolic 구획 sarcoplasmic 망상 네트워크 (SR)에서 수축. 생성 된 모델 여기 그림 가로 관 건축 또는 sarcoplasmic으로 네트워크의 세부 정보를 포함 하지 않습니다 이며 따라서는 cardiomyocyte의 최소한의 모델. 그럼에도 불구 하 고, 모델 이미에 적용할 수 있는 시뮬레이션 기반에 대 한 조사 역할의 셀 구조를 보여 줍니다 및 다음 표시 되는 두 개의 사례 연구를 사용 하 여 논의 칼슘 신호 및 미토 콘 드리 아 생체에는 자세한 프로토콜입니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

흥분-수축 커플링 (ECC)에 중요 하 고 복잡 한 cardiomyocyte 막의 전기 흥분 및 각 박동 동안 셀의 후속 기계 수축 사이의 커플링을 말합니다. 수학적 모델 활동 전위1,2,3, 생체 신호 cytosolic 칼슘을 조절 하는 류의 생화학 프로세스의 정량적 이해 개발에 중요 한 역할을 이후 수축 성 힘 세대입니다. 같은 모델도 성공적으로 예측 하나 하트 비트에 대 한 변경 또는이 생 화 확 적인 과정의 몇 가지 변경4,5를 받 다. cardiomyocyte의 높은 조직 열 대권 외 점점 셀 및 전체 심장의 정상적인 수축 성 기능에 중요 한 역할을 인정 받고 있습니다. 실제로, 형태학 및 심장 열 대권 외의 구성 요소의 조직 변경 비6,7, 심장 마비 그리고 당뇨병 심근8등 질병 조건에서 생 화 확 적인 변화에 동시에 발생합니다. 이러한 구조적인 변화는 변화에 대 한 사소한, 적응, 또는 병 적인 응답 생화학 조건 여전히 크게 알 수 없는9입니다. 형태와 생물학에서 기능 사이의 본질적으로 밀접 한 결합 실험 연구 혼자 개장 하는 구조와 cardiomyocyte 기능 사이의 상관 관계 보다 더 깊은 통찰력을 제공할 수 없습니다 의미 합니다. 잘 공부 생화학 프로세스 함께 하위 세포 구성 성분의 구조 어셈블리를 통합할 수 있는 수학적 모델의 새로운 세대는 관계의 종합적, 정량적 이해를 개발 하는 데 필요한 구조 사이, 생화학, cardiomyocytes에 수축 성 힘. 이 프로토콜 같은 수사를 위해 사용 될 수 있는 cardiomyocytes의 구조적으로 정확한 유한 요소 모델을 생성 하는 데 사용할 수 방법을 설명 합니다.

지난 10 년간 본 3D 전자 현미경10, confocal11및 슈퍼 해상도 현미경12 의 나노 및 마이크로 스케일 어셈블리에 대 한 전례 없는, 고해상도 통찰력을 제공 하는 중요 한 발전은 cardiomyocyte의 하위 세포질 구성 요소입니다. 최근, 이러한 데이터 집합 cardiomyocyte 열 대권 외의13,14,,1516의 계산 모델을 생성 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 모델 만들 유한 요소 계산 메시 생화학 프로세스 및 cardiomyocyte 수축 시뮬레이션할 수 유한 요소 방법17, 라는 잘 설립 엔지니어링 시뮬레이션 메서드를 사용 합니다. 그러나, 이러한 모델은 해상도 현미경 메서드는 이미지 데이터 집합에 제공할 수 있는 세부 사항에 의해 제한 됩니다. 예를 들어 전자 현미경의 셀 구조를 나노미터 수준의 세부를 생성할 수 있습니다 하지만 그것은 이미지 모델을 만드는 데 필요한 것입니다 내에서 특정 단백질을 파악 하기가 어렵습니다. 최고 해결책 광학 현미경 해상도 50 순서에서 높은 콘트라스트 이미지를 제공할 수 있는 다른 한편으로만 선택 몇 분자의 구성 요소는 셀의 nm. 만 이러한 이미징 형식에서 상호 보완적인 정보를 통합 하 여 둘러볼 수 있습니다 하나 현실적으로 기능의 감도 변화 구조에. 상호 빛과 전자 현미경 검사 법은 여전히 일상적인 절차 그리고 그것은 여전히 제한만 제한 된 수의 구성 요소 면역 형광 보기에서 스테인드 하 고 전자 현미경 보기와 상관 수를 겪을 것입니다.

이 프로토콜 선물 통계적 방법19 를 사용 하 여 분석 하 고 계산 다른 심장에 대 한 전자 현미경 정보 이온 채널의 공간 분포에 가벼운 현미경 검사 법 정보를 융합 하는 새로운 접근 방식을18 열 대권 외의 구성 요소, myofibrils 미토 콘 드리 아 등입니다. 이 생 화 확 적인 과정의 생물 모델 cardiomyocyte 수축 조절 하는 생 화 확 적인 프로세스에 cardiomyocyte 하위 세포 조직의 역할을 연구 하기 사용 될 수 있는 유한 요소 모델을 생성 합니다. 예를 들어이 프로토콜에서 건강 한 모델을 만드는 데 사용할 수 하 고 당뇨병 동물에서 관찰 되는 심장 세포 기능에 구조 리 모델링의 효과 연구를 당뇨병 심장 myocytes streptozotocin 유발 모델8. 제시 방법의 통계 자연의 추가적인 이점은 또한 프로토콜에서 설명 된다: 방법을 유한 요소 기 하 도형 셀 구조에 실험적으로 관찰 된 변화를 밀접 하 게 모방의 여러 인스턴스를 생성할 수 있습니다.

개요, 프로토콜 단계 포함 됩니다: (i) 충분 한 해상도 및 대비; 3D 이미지를 생성 하는 전자 현미경에 대 한 심장 조직의 준비 (ii) 재건 및 3D 이미지 스택 3D 전자 현미경 재건 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 전자 현미경 검사 법 데이터에서의 시장 세분화 라는 아이 모드20; (iii)를 사용 하 여 iso2mesh21 입력;으로 세그먼트 데이터를 사용 하 여 유한 요소 메쉬 생성 (4) 사용 하 여 새로운 알고리즘 및 코드 유한 요소 메쉬에 이온 채널의 분포를 매핑하는 데.

각 단계에 대 한 접근의 전제는 프로토콜 내에서 설명 하는 및 대표 결과 동반 숫자에서 제공 됩니다. ECC, 뿐만 아니라 미토 콘 드리 아 생체 칼슘의 공간적 역학 공부 하 생성 된 공간 상세한 모델을 사용 하는 방법을 지정 하는 개요 요약. 프로토콜의 현재 제한의 일부는 그들을 극복 하 고 더 심장 시스템 생물학에 세포 구조의 역할의 정량적 이해를 사전에 진행 되 고 새로운 개발 뿐만 아니라, 설명 되어 있습니다. 다른 세포 유형의 유한 요소 모델을 만들 이러한 메서드를 일반화 수 어떻게도 해결 됩니다.

이 프로토콜의 사용자 기존 전자 현미경 이미지 스택에 액세스할 경우 단계 1와 단계 2의 개조 부분 건너뛸 수 있습니다. 경험된 많은 전자 microscopists와 공동으로 그들의 데이터를 획득 하려는 사용자는 토론 하 고 고정 및 수집을 위한 최적의 프로토콜을 결정 하기 위해 전문가와 1 단계에서 착 절차를 비교 하실 수 있습니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명 된 모든 메서드는 오클랜드 동물 윤리 위원회와 캘리포니아 대학 샌디에고 제도 동물 보호와 사용 위원회, 조직 프로토콜은 원래 개발의 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 실험 준비

  1. 표 1에 따라 pH 7.4에서 cacodylate 버퍼 0.15 M과 0.3 M 나트륨의 재고 솔루션을 준비 합니다.
  2. 준비도 정착 액 (2 %paraformaldehyde (PFA) + 2.5%도 + 0.15 M 나트륨 cacodylate 버퍼 pH 7.4에에서 0.2% 타 닌 산) 표 1에 나열 된 구성 요소를 사용 하 여.
    1. 지속적인 교 반으로 열판에 60 ° C에서 증류수 20 mL에 PFA 가루 2g을 디졸브.
    2. 솔루션은 분명 때까지 1m NaOH 솔루션을 추가 합니다.
    3. 솔루션의 온도 40 ° c 때까지 기다려 다음 10 mL의 글과 0.3 M 나트륨 cacodylate의 20 mL를 추가 합니다.
    4. 타 닌 산의 0.2 g을 추가 하 고 솔루션에 용 해.
    5. 0.15 M 나트륨 cacodylate의 50 mL를 추가 합니다.
    6. 같은 날에 사용 하는 경우에, 정착 액의 3 개 또는 4 개의 20 mL 섬광 튜브 4 ° C, 또는 얼음에 냉장고에 저장 합니다.
  3. 표1에서 제조 법에 따라 20 m m 2, 3-butanedione monoxime (BDM), Tyrode의 솔루션을 준비 합니다.
  4. 증기 찬 장 안에 Langendorff 장치를 구성 합니다.
    1. 두 개의 다른 쌈 스탠드, 약 70 cm 높이 스탠드 기지에서 하 두 100 mL 플라스틱 주사기 튜브 클램프.
    2. 플라스틱 주사기 튜브 및 그림 1에서 보듯이 3 m m 내부 직경 튜브와 3 방향 자 지를 사용 하 여 커넥터 튜브를 연결 합니다.
    3. 심장 관류 고정을 위한 연결 하는 것입니다 어디 튜브 커넥터의 하단에 3 m m-외경 정 맥에 맞게.
  5. Tyrode의 솔루션 및 37 ° c.에 통 솔루션 주사기 튜브를 채우기
    1. 그들을 통해 주사기 솔루션을 전달 하 여 튜브 내 기포를 제거 합니다.

2. Cardiomyocyte 열 대권 외의 전자 현미경 검사 법 데이터 수집

  1. 절단 및 심장의 화학 정착에 대 한 동물을 준비 합니다.
    참고:이 프로토콜은 성인 남성 Wistar (알 비 노 쥐의 특정 품종에 대 한 이름) 쥐 심장 조직을 처리 하는 단계를 자세히 설명 합니다. 프로토콜 심장 조직 다른 종에서 공급 하는 경우 수정이 필요할 수 있습니다.
    1. 복 주입을 통해 250 U/mL 덤플링의 0.5 mL와 쥐 (몸 무게에 의해 200-250 g) 하 여 동물을 anesthetize. 10 분 기다립니다 다음 pentobarbital (210 mg/kg의 몸 무게)의 복 주사로 쥐를 치료 합니다.
    2. 발가락 핀치 반사를 테스트 하 여 마 취의 적절 한 학위를 확인 합니다.
    3. 자 궁 경부 전위에 의해 동물을 안락사.
    4. 이전에 게시 정돈 기사와 비슷한 해 부 절차를 사용 하 여 심장22,23, 장소 차가운 식 염 수에 추수.
    5. 오름차순 대동맥을 분리 하 고 cannulate. 그는 정 맥의 끝 바로 위에 앉아 반 달 밸브 관상 동맥 분기를 확인 하십시오. 오름차순 대동맥 주위 단단히 스레드 넥타이.
    6. 중력 구동 Langendorff 장치 시스템 (그림 1)의 기초 위에 ~ 70 cm에서 운영 하는 정 맥을 연결 합니다.
    7. Perfuse Tyrode의 솔루션을 2-3 분 20 m m BDM (myosin 억제제)를 포함 하 여 심장 Langendorff 시스템에는 자 지를 트위스트.
    8. 트위스트 2 %paraformaldehyde, 2.5%도, 및 0.15 M 나트륨 cacodylate에서 10 분 동안 37 ° C에 0.2% 타 닌 산의 정착 액으로 살포 하려면 자 지. 성공 하면 마음 것 창백한 갈색으로 바뀌고 뻣 뻣 하 고 고무 되.
    9. 고 해 부 조직 블록 왼쪽된 심 실 (측면) 무료 벽에서 면도날을 사용 하 여, 조직 블록 약 1 m m3 크기에.
    10. 2 헤에 얼음 같은 정착 액의 사전 냉각된 20 mL 섬광 튜브에서 샘플 튜브에 가능한 많은 샘플을 저장 고는 샘플 솔루션에 잠긴가 게.
      주의: 그것은 샘플을 아래 100% 탈수 단계 이후까지 차가운 유지 하는 것이 중요입니다.
  2. 추가 고정 고 전자 현미경에 대 한 샘플의 얼룩이 지기.
    1. 유리 비 커에 0.15 M 나트륨 cacodylate 버퍼의 100ml를 부 어 하 고 얼음에 냉각 하십시오.
    2. 4% 오스뮴 tetroxide 그리고 0.3 M 나트륨 cacodylate, 칼륨 ferrocyanide 2% 칼륨 ferrocyanide 2% 오스뮴 tetroxide와 0.15 M 나트륨 cacodylate에 포함 된 중 금속 얼룩 솔루션의 0.08 g의 추가 의해 다음의 동일한 볼륨을 준비 합니다. 차가운 얼음에 솔루션.
    3. 밖으로 정착 액을 플라스틱 하 고 충분 한 찬 0.15 M 나트륨 cacodylate 버퍼 튜브에 샘플을 잠수함으로 대체. 5 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다.
    4. 2.2.3 단계 초과 정착 액 제거를 0.15 M 나트륨 cacodylate와 4 번 더 반복 합니다.
      주의: 작은 파편 샘플을 들어갈 수 있는 조직 블록 단면 중 다이아몬드 칼을 망칠 수 있기 때문에 유리 펫을 사용 하지 마십시오. 미리 샘플에 그들을 추가 하기 전에 얼음에 모든 솔루션을 중요 하다. 그것은 또한 중요 한 샘플 남아 있는 솔루션으로 덮여 모든 시간 (부분 범위를 더 이상 몇 초 지속의 아주 짧은 기간 동안 수 있습니다 짧게 용납 솔루션 교류 중). 세척 또는 교체 솔루션 때 이전 솔루션을 제거한 후 새로운 솔루션 신속 하 게 추가 합니다. 세척 사이 얼음에 섬광 튜브를 유지. 참고가이 단계 구분, 조직 블록 시간 아닙니다는 약간 이상 하 고, 필요한 경우 세척 될 수 있다.
    5. 얼음 처럼 차가운 중 금속 얼룩 솔루션 나트륨 cacodylate 버퍼를 교체 하 고 밤새 얼음에 저장. ferrocyanide 손으로; 유리병을 흔들어 잘 혼합 되도록 솔루션 검정 설정 해야 합니다.
      주의: 오스뮴은 독성이 있기 때문에이 단계를 수행할 때 증기 두건에서 작동 합니다.
    6. UA 솔루션 주식의 동일한 볼륨 및 두 배 증류수를 사용 하 여 2 %4% 수성 uranyl 아세테이트 (UA) 재고 솔루션 (표 1)을 묽 게 하십시오 그리고 얼음에 그것을 진정.
    7. 0.15 M 나트륨 cacodylate 버퍼 얼음 냉각 중 금속 얼룩 바꿉니다 그리고 얼음에 5 분 동안 품 어 샘플.
    8. 어떤 초과 중 금속 얼룩 솔루션을 씻어 얼음에 단계 2.2.7 4 번 더 반복 합니다.
    9. 샘플 4 시간, 2 분 대기 기간 사이 물에 씻어 정화 (충분 한는 이중 증 류).
    10. 순화 된 물 대체 얼음 2 %UA 샘플 품 어 얼음에 60-120 분.
    11. 5 20 mL 섬광 튜브 (충분히 샘플 잠수함) 에탄올의 탈수 단계에서 사용 될 얼음에 식혀. 6 튜브는 증류수에 에탄올의 증가 비율: 20%, 50%, 70%, 90%, 및 100%.
    12. 에탄올 튜브 함께 얼음에 다른 20 mL 섬광 유리병과 멋진에 순수한 아세톤을 붓으십시오.
    13. 샘플 정화 물에 4 시간 2 분 대기 기간 초과 UA 씻어 얼음에 린스.
  3. 샘플 에탄올에서 탈수.
    1. 연속적으로 얼음에 다음과 같이 샘플 유리병 내 솔루션을 대체 하 여 냉 에탄올 시리즈에 탈수: 10 분;에 대 한 20% 에탄올 50% 에탄올 10 분; 70% 에탄올 10 분; 10 분;에 대 한 90% 에탄올 다음 10 분에 100% 에탄올 두 번.
    2. 최종 100% 에탄올 냉각된 순수한 아세톤 대체 하 여 실내 온도에 샘플을 전환 하 고 10 분 동안 실내 온도 실험실 벤치에 샘플 유리병을 놓습니다.
    3. 튜브 내에서 관찰은 결로 제거를 위해 상 온에서 순수한 아세톤에 하나 더 많은 10 분 워시를 수행 합니다. 동안 잠복기, 아세톤 또는 수 지 솔루션을 확인 합니다.
    4. 튜브에 순수한 아세톤을 50: 50 순수한 아세톤 및 에폭시 수 지 (에폭시 수 지 부품 제조 업체에 의해 명시 된 대로 비율)으로 바꿉니다. 동일한 일괄 처리에서 모든 구성 요소를 사용 합니다. 로 터에 수 지 가득 샘플 튜브를 하룻밤 둡니다.
  4. 수 지에 샘플을 포함 합니다.
    1. 75%는 수 지 (25% 아세톤)와 50: 50 수 지를 교체 하 고 3 h, 뒤에 실 온에서 4 h에 대 한 100% 수 지에 추가 부 화/침투에 대 한 품 어.
    2. 신선한 100% 수 지, 100% 수 지를 대체 하 고 조직 샘플에 하룻밤 수 지의 깊은 침투에 대 한 샘플 튜브를 둡니다.
    3. 샘플 튜브에서 오븐-친화 하는 컨테이너에 배치 하 고 평면 기반; 알루미늄 또는 박 베이킹 컵 사용할 수 있습니다이 위해 예를 들면.
    4. (샘플의 변위를 피하기 위해)을 부 어 부드럽게 신선한 샘플 (따라서 수 지에 샘플 포함) 수 지 및 수 지 및 48 h에 대 한 60 ° C에서 오븐에서 샘플 유해.
  5. 다시 이미지 셀 단면에 수 지 블록을 방향을 정하십시오.
    1. 셀 방향24평가 하기 위해 유리 칼으로는 ultramicrotome를 사용 하 여 수 지 블록에서 1 µ m 두께 테스트 섹션을 가져옵니다.
    2. 20 대 한 두꺼운 테스트 섹션 얼룩 s 1% 톨루엔 블루와 1% 붕 사.
    3. 근육 세포 방향 밝은 분야 현미경 검사.
    4. 얼룩진된 테스트 섹션의 이미지에서 유추 하는 방향에 따라, 다시 방향을 경도 또는 비스듬히 지향 ( 그림 2A와 유사한) 횡단면 (에서 삭감 될 것 이다 그래야 세포 유리 칼에 노출 되어 있는지 확인 하려면 블록 수 지 비슷한 그림 2B).
  6. 이미지 조직 섹션 전자 단층 촬영을 사용 하 여입니다.
    1. 구하는 반 얇은 섹션 (~ 300 nm) 방향도 조직의 다이아몬드를 사용 하 여 블록 칼 및 구리 격자25에 섹션을 전송.
    2. 2 %UA 사토 리드25두꺼운 부분 얼룩.
    3. 섹션25의 양쪽에 콜 로이드 골드 입자를 적용 합니다.
    4. -70 °에서 70 °25영사 된 이미지의 단일 또는 이중 축 기울기 시리즈의 집합을 가져옵니다.
  7. 아이 모드20 를 사용 하 여 3D 이미지 스택 (단일 전자 단층 촬영의 3 차원 정보를 제공 하는 2D 이미지의 시리즈)를 재구성 하는 셀의. 이 재건된 스택 다음 단계에서 세그먼트 것입니다.

3. 세그먼트 Myofibrils와 EM 3D 이미지 데이터 집합에서 미토 콘 드리 아 지역

  1. 아이 모드 프로그램 "3dmod"를 실행 합니다.
  2. 3dmod 그래픽 사용자 인터페이스 내에서 ".rec"의 주소를 입력 또는 3D를 포함 하는 ".mrc" 파일 재구성 (2.7 단계에서 생성 된) 셀의 이미지 데이터 집합 항목 상자에 "이미지 파일:", "확인"을 누릅니다.
  3. "파일" 메뉴에서 새로운 모델을 선택한 다음 "저장 모델"을 사용 하 여 적절 한 이름을 가진 파일을 저장... "파일" 메뉴 항목.
    참고: 아이 모드에서 개체 "개체" 구성 하는 세그먼트 구성 요소 컬렉션을 포함할 수 있습니다. 기본적으로 새 모델 id "#1" 새 개체를 포함합니다.
  4. "특별 한" 메뉴에서 "그리기 도구"를 선택 합니다. 이 새로운 도구 모음 그림 3A에 표시 된 것과 비슷한 열 것 이다.
    참고: 다른 세포 기관이 경계 주위 윤곽선을 만드는 데 사용할 수 있는 여러 도구가 있습니다. 이러한 도구를 사용 하는 방법에 대 한 더 많은 도움 아이 모드20 설명서에서 찾을 수 있습니다.
  5. "그리기 도구" 메뉴에서 "조각" 옵션을 선택 하 고 이미지 창; 위로 마우스를 이동 마우스 포인터를 중심으로 원형 윤곽 표시 됩니다.
  6. Mitochondrion (이미지 파일, 그림 3A에서 녹색 등고선으로 경계 설정에 의해 볼 수 있듯이 어두운 지역)를 통해 마우스 가운데 단추를 누른, 그것의 경계를의 모양으로 원 윤곽선의 경계를 끕니다.
  7. Mitochondrion 경계의 컨투어링 완료 되 면, 가운데 버튼을 해제 하 고 각 mitochondrion 데이터에 대 한 단계 3.6를 반복 합니다. 각 윤곽선 동일한 개체 내에서 새 윤곽으로 아이 모드에 의해 자동으로 인식 됩니다.
  8. 아래는 "편집 | 개체 "메뉴,"새로운 "를 선택 하는 새 개체를 만들려고 합니다. 이 자동으로 하나씩 개체의 총 수를 증가 하 고이 숫자는 새 개체를 할당.
  9. 3.6, 3.7 세그먼트를 myofibril 윤곽을 저장 단계를 반복 합니다.
  10. 단계 3.8, 단계 3.6, 뿐만 아니라 셀 경계 세그먼트에 다음 반복 합니다.
  11. "파일" 메뉴에서 모델 파일을 저장 합니다.
  12. 그림 4A-C에서 볼 수 있듯이 이진 마스크에 그룹화 하는 각 개체를 변환 하려면 명령줄 창에서 다음 명령을 실행 합니다.
    1. 모델 "imodextract 개체 modelfile outputmodelfile" "개체"가 추출 될 개체의 수에서에서 특정 개체를 추출 합니다.
    2. 해당 개체에 대 한 마스크를 만들기: imodmop-마스크 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
    3. Tif 스택 파일 변환: mrc2tif-s outputmask.mrc outputmask.tif

4. 세그먼트 구성 요소에서 유한 요소 메쉬 작성

  1. Iso2mesh 체적 사면체 유한 요소 메쉬 TIFF 이미지 스택 변환을 자유롭게 사용할 수 있는 MATLAB 프로그램 이다. 다운로드 하 고 iso2mesh.sourceforge.net에서 MATLAB 경로에 iso2mesh를 추가 합니다.
  2. 소스 코드와 github 웹사이트 https://github.com/CellSMB/RyR-simulator에서 메시에 RyR 클러스터 시뮬레이션 데이터 다운로드.
  3. (그림 5) CardiacCellMeshGenerator MATLAB 응용 프로그램을 시작 합니다.
  4. GUI의 왼쪽 상단에 3 개의 푸시 버튼을 사용 하 여 MATLAB으로 다른 세포 기관이 컴포넌트 마스크를 로드 합니다.
  5. Myofibrils와 미토 콘 드리 아 그림 6A와 같이 사이 간격을 정하는 다른 바이너리 이미지 스택을 만듭니다.
    1. ImageJ를 엽니다.
    2. 파일을 사용 하 여 | 대화 상자를 열고, 프로그램에 myofibrils 및 미토 콘 드리 아 tiff 스택 로드.
    3. 선택 하 여 이미지 추가 플러그인을 시작할 "프로세스 | 계산기 플러스 ".
    4. I1 myofibril 이미지 스택을 선택, mitochondria i2,으로 스택 이미지 "Add" 연산자를 선택 하십시오. "확인"을 클릭 합니다.
    5. 4.5.4의 결과 나타내는 새로운 이미지 스택 나타나면 선택 합니다 "편집 | 반전 " 그림 6A와 비슷한 이미지 스택 생산.
  6. CardiacCellMeshGenerator 프로그램에 "RyRGapsFile" 버튼을 누르면 myofibrils와 미토 콘 드리 아 사이 간격의 바이너리 이미지 스택을 포함 하는 파일을 로드 합니다.
  7. GUI에서 "메쉬 생성"을 눌러. 이 iso2mesh 명령 v2m 비슷한 그림 4E사면체 메시 생성을 'cgalmesh' 옵션을 사용 하 게 됩니다. 3 파일이이 단계 끝에 출력 될 것입니다:.ele 파일,.face 파일 및 요소, 얼굴, 구성 하는 노드를 구성 하는 노드 목록과 노드 좌표를 포함 하는.node 파일 각각.

5. 수학적으로 유한 요소 망에 대 한 관심의 이온 채널의 다양 한 공간적 밀도 지도.

  1. Gui 생성 RyR 시뮬레이터 입력을 표시 하는 버튼을 누르면 RyR 시뮬레이터에 대 한 필요한 입력을 생성 합니다.
    참고: 버튼 4 단계에서 다음 정보를 사용 하 여 입력을 생성 하는 함수 generateRyRsimulatorInputs.m를 일으킬 것 이다:
    (1) outDir: RyR 클러스터 시뮬레이션에 필요한 출력 파일 위치.
    (2) imres: 이미지 스택의 3 개의 방향에서 픽셀 해상도.
    (3) myofibril_file: 4B 그림과 같은 바이너리 이미지 스택을 포함 하는 파일.
    (4) sarcolemma_file: 4A 그림과 같은 바이너리 이미지 스택을 포함 하는 파일.
    (5) ryrgaps_file: 5A 그림과 같은 바이너리 이미지 스택을 포함 하는 파일.
    1. 이 기능을 실행 한 후 다음 파일 outDir 경로로 지정 된 디렉터리 내에서 생성 된 확인:
    • d_axial_micron.txt z 디스크의 위치와 이미지 스택에 픽셀의 나머지 사이 축 거리를 나타냅니다.
    • d_radial_micron.txt z 디스크 평면에 픽셀을 가능한 RyR 클러스터 위치 집합에서 각 픽셀에서 유클리드 거리 (축 구성 요소 제외)을 나타냅니다.
    • W_micron.txt RyR 있어야 클러스터에 대 한 모든 가능한 위치의 공간 좌표 목록을 나타냅니다.
    • 폴더에 나머지 3 파일 "_micron" 픽셀 좌표 형태로 쓰여지는 되었습니다이 파일에서 값을 표시 하는 대신 접미사 "_pixel"를 포함 합니다.
  2. Myofibrils의 바이너리 이미지 스택에 RyR 클러스터 배포판을 시뮬레이션 합니다.
    1. "오픈 RyR-R에서 시뮬레이터"를 표시 하는 버튼을 눌러 R 프로그램을 시작 하려면.
    2. R-gui에서 선택 "파일 | 열기"찾을 파일"설정입니다. R "RyR 시뮬레이터 패키지 (RyR-시뮬레이터/소스/설정. R)입니다.
    3. 또한 파일 ryr 시뮬레이터-병렬 열. R (RyR 시뮬레이터/소스/ryr-시뮬레이터-병렬에 위치. R). 환경 처럼 Rstudio (https://www.rstudio.com) 또는 일반 커맨드 라인 인터페이스를 사용할 수 있습니다, 예를 들어 셸 또는 명령 창에서 R64 명령을 사용 하 여.
    4. 설정에서 매개 변수를 변경 합니다. R으로 아래 파일.
      1. 5.1.2 RyR 클러스터 및 myofibrils의 실험적으로 획득된 confocal 이미지 스택에 대 한에 나열 된 파일이 들어 있는 폴더 주소에 Path2를 설정 합니다.
        참고: github 저장소 폴더 입력-파일/마스터-셀 이전에 수집한 이미지 스택 생성 된 파일에 이미 포함 되어 있습니다.
      2. 5.1.2 단계에서 생성 된 파일의 저장 위치 폴더 주소에 Path4을 설정 합니다.
      3. 사용자 시뮬레이션된 RyR 클러스터 위치 저장을 원하는 폴더에 Path3 포인트를 설정 합니다.
      4. N (일반적으로 200 ~ 300의 범위)에 모델에서 시뮬레이션 RyR 클러스터의 수를 설정 합니다.
      5. Etol, 설정, RyR 클러스터의 실험적으로 측정 된 공간 분포와 RyR 클러스터의 시뮬레이션 모델 공간 분포의 차이 대 한 허용 오차를 설정 합니다.
      6. RyR 시뮬레이터 etol 값을 만족 하는 시뮬레이션된 RyR 클러스터 패턴을 찾을 수를 취해야 하는 시도의 수를 제한 하는 numIter를 설정 합니다.
        참고: etol 및 numIter 값을 설정 내에 전형적인 값으로 설정 되었습니다. R 파일입니다.
      7. NumPatterns 다른 RyR 클러스터 패턴을 시뮬레이션 하는 사용자가 수 설정 (일반적으로, 그것은 유용한 연습 통계 신뢰에 대 한 99 패턴 시뮬레이션).
      8. NumCores R 포인트 패턴 시뮬레이션을 처리 하는 빠른 병렬에 대 한 여러 CPU 스레드 (코어)를 사용 하 여 사용할 수 있도록 설정 합니다.
    5. 다음 패키지는 패키지 설치 관리자를 사용 하 여 설치 되어 있는지 확인 하십시오 r: 눈, doSNOW, doparallel, foreach, 반복기, 및 rgl gui.
    6. R 명령 창에서 다음 명령을 입력 하 여 시뮬레이터를 실행: 소스 (' ryr 시뮬레이터 병렬 경로. R', chdir = TRUE)
      참고: RyR 시뮬레이터 프로그램의 출력은 N 행에 좌표 목록을 포함 하는.txt 파일 (numPatterns 파일 생성 됩니다)의 목록을 하 고 x, y 및 z 좌표 N의 대표 하는 3 열 시뮬레이션 RyR 클러스터.
  3. 공간 밀도 CardiacCellMeshGenerator를 사용 하 여 계산 모델에로 포인트를 매핑하십시오.
    1. 표시 단추를 선택 하 여 "RyR 포인트 파일 선택", 그런 RyR 시뮬레이터에서 출력 했다에서 시뮬레이션된 RyR 클러스터 배포 텍스트 파일을 선택.
    2. MATLAB에서 gui "RyR 밀도 매퍼"를 실행 합니다. 이 단계 5.3.1 4.8 구형 커널 강도 견적 방법26라는 메서드를 사용 하 여 단계에서 생성 된 유한 요소 메쉬에.txt 파일에 시뮬레이션된 RyR 클러스터의 공간적 위치 지도.
      참고:이 단계에서 출력 계산 메쉬 노드의 각 단위 구면 볼륨당 이온 채널의 숫자 밀도 대 한 값의 목록을 포함 하는.txt 확장명을 가진 파일입니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 몇 가지 주요 단계의 대표적인 결과 제공 하는 그림 2 - 그림 7 : (i) 시각화 및 전자 현미경 횡단면 뷰;에 대 한 조직 블록을 reorienting (ii) 생성 3 차원 전자 현미경 이미지 스택; (iii) 세그먼트 하위 세포 열 대권 외의의; 세포에 대 한 (4) iso2mesh;를 사용 하 여 유한 요소 메쉬 생성 (v) 시뮬레이션 메시;에 RyR 클러스터의 실제 분포 (6) 전산 메쉬 이상의 공간 밀도로 공간 배급이 매핑 옵니다.

그림 2 표시 셀 때 경도 중심을 표시 하는 방법을 보여 주는 전형적인 밝은 필드 이미지 (그림 2A

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

위의 프로토콜 cardiomyocyte 열 대권 외의 기하학적 소설 유한 요소 모델을 생성 하는 주요 단계를 설명 합니다. 메서드 다른 현미경의 (또는, 원칙적으로, 다른 데이터) 계산 퓨전 modalities를 cardiomyocyte 역학 공간 셀 아키텍처의 세부 정보를 포함 하는 보다 포괄적인 전산 모델을 개발 하는 것을 수 있습니다. 현재는 cardiomyocyte의 같은 모델을 만드는 데 사용할 수 없습니다 다른 프로토콜이입니다.

1 단계는 관류 고정을 위한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 심장 수 수 excised, 작은 조각으로 해 부 및 정착 액에. 그러나,이 과정은 신속 하 게 할 수 있다 하 고 결과, 샘플의 크기에 따라 다양 한 수 있습니다. 저자의 경험에서 관류는 조직과 세포에는 정착 액의 철저 한 침투를 보장합니다. 저자 또한 이전 Krebs Henseliet 솔루션 마음을 마음을 끼얹는다는 고정 하기 전에 비트. 이 정착 하기 전에 작업 심장에 측정을 사용...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 왕 사회의 뉴질랜드 마 즈 빠른 시작 그랜트 11-UOA-184, 인간 프론티어 과학 프로그램 연구 그랜트 RGP0027/2013와 오스트레일리아 연구 위원회 발견 프로젝트 교부 금 DP170101358에 의해 지원 되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<강>재료
나트륨 염화시그마-알드리치746398
염화칼슘그마-알드리치C8106
염화마그네슘시그마-알드리치M2393
중탄산나트륨시그마-알드리치S5761
염화칼륨시그마-알드리치P5405
포도당, 시그마-알드리치D9434
수산화나트륨시그마-알드리치S8045
프로베네시드, 시그마-알드리치P8761
2,3-부탄디온 모노심, 시그마-알드리치B0753
25% 글루타르알데히드 EM 등급(500ml 병)머크354400-500ML
파라포름알데히드시그마-알드리치P6148
타닌산시그마-알드리치403040-500G100g EM 등급
카코딜산나트륨시그마-알드리치C0250
인산염 완충 식염수(PBS)시그마-알드리치P4593
오스뮴 테트록사이드시그마-알드리치75632-10ML물 4%, 5ml 병(또는 10ml 병) 또한 사용 가능)
우라닐 아세테이EM Sciences2240025g 병
칼륨 페로시아나이드Merck Millipore104973
톨루엔 블루시그마-알드리치T3260
붕사시그마-알드리치S9640붕
에탄올 시그마-알드리치792780다른 비율로 희석 순수한 물
AcetoneEM SciencesRT10017
Resin kitEM Sciences14040ACM Durcupan works well
염산Sigma-AldrichH98921Normal solution
Equipment
UltramicrotomeLeicaEM UC7
Transmission electron 현미경ThermoFisher ScientificTecnai F30http://www.leica-microsystems.com/
레토르트 스탠드ProscitechT752
튜빙BioStrategy75831-346langendorff 관류 장치, 3mm 직경이 권장되지만 필수는 아닙니다
경우 스톱콕SDRQP13813; 제품은 예시일 뿐이며 사용자는 선택할 수 있습니다
레토르트 스탠드 클램프ProscitechT715
플라스틱 주사기SDRQPC1108langendorff 장치의 솔루션
캐뉼레이션 실크 봉합사, 7-0TeleFlex15B051000langedorff 장치에 심장을 묶기 위해
캐뉼라3mm 외경의 강철 바늘로 만든
고무 페트리 접시 매트ProscitechH068고정 심장 박리 시 도마로 사용
, 면도날ProscitechL056EM 가공을 위해 고정 심장을 작은 블록으로 절단
유리병,조직 고정 및 처리 중 용액 보관용BioStrategy89000-236
비커BioStrategy213-0477임시 및 관류
중 용액 보관용섬광 바이알BioStrategy548-2170EM 처리 중 조직 샘플용
해부 키트ProscitechT161동물 해부
주사기 필터ProscitechWS3-02225S우라닐 아세테이
정제용 알루미늄/실버 호일 베이킹 컵모든 베이킹 제품 매장에서
Dupont Diamond 나이프BioStrategy102680-78035도 각도 버전은 최상의 단면을 생성합니다.
콜로이드 골드BBI 솔루션EM. GC1515 nm 콜로이드 골드
EM 메쉬 그리드ProscitechGCU150다양한 크기를 테스트 할 수 있습니다 : GCU150h, GCU200h 예를 들어
플라스틱 처리 피펫ProscitechLCH20은수지 소프트웨어로 작업 할 때 플라스틱 일회용품을 사용하는 것이 가장 좋습니다
SerialEM
University of Boulder단층 촬영 획득
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMODUniversity of Boulder이미지 정렬 및 세분화
iso2mesh는 http://iso2mesh.sourceforge.net
Fiji 또는 이와 유사한 이미지 처리 소프트웨어ImageJFiji는 이진이미지 조작을 위해 https://fiji.sc 에서 사용할 수 있는 Just Image J입니다. 스택
RyR-Simulator 코드/데이터CellSMB 그룹
https://github.com/CellSMB/RyR-simulator 사용 가능 CardiacCellMeshGeneratorCellSMB 그룹은"gui-version" 폴더 아래에 RyR-Simulator와 함께 제공
-통계 소프트웨어R-project
spatstatR-project에서 다운로드R 프로그램을 통해 설치
rglR-projectR 프로그램을 통해 설치
doparallelR-projectR 프로그램을 통해 설치
각 R-projectR프로그램을 통해 설치
doSNOWR-projectR 프로그램
반복자를프로그램을 통해 R-project
물 시, , , , , 트 산 나트륨. Langendorff 튜빙의.: , , , EM, , 트 인 R https://www.r-project.org 통해 설치 R 설치 R 프로그램을 통해 설치

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