바이러스 성 transcriptional 팩터리는 세포질 RNA 중 합 효소 II 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 전사를 증가 함께 풍성 하 게 이산 구조. 여기, 적극적으로 면역 형광 얼룩이 지 고 제자리에서 RNA 교 잡의 조합에 의해 3D 핵 공간에서 바이러스 성 염색 질을 속기의 사이트를 찾을 하는 방법을 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
그것은 잘 알려진 유전자의 공간과 일시적인 규칙 경 세 적절 한 유전자 발현의 중요 한 부분입니다. 따라서, 어디 고 때 전사 일어나 핵 공간 내에서 이해 하 고 episomes 같은 세포의 핵 내에서 감염 사이 관계를 시각화 하기 위해 중요 한 아니다. 여기, 면역 형광 검사 (IFA)와 RNA-물고기 왔다 combinedto 식별 적극적으로 속기 Kaposi의 육 종 관련 herpesvirus (KSHV) episomes. KSHV 대기 시간 관련 핵 항 원 (라 나), 얼룩이 지기에 의해 바이러스 episomes는 핵 내에서 존재 하는 곳을 찾을 수입니다. 또한, 생산적인 감염 동안에 표시 됩니다, 바이러스 성 유전자의 intron 지역 대상으로 RNA-물고기 프로브를 설계 하 여 초기 RNA 사본 있을 수 있습니다. 이 조합의 분자 프로브를 사용 하 여, 큰 바이러스 성 녹음 방송 공장 조립 시각화 하 고 분석 KSHV 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 발현의 공간 규정 가능 하다. 포함 하 여 안티-RNA 중 합 효소 II 항 체 얼룩이 지기, 하나 또한 RNA 중 합 효소 II (RNAPII) 집계 및 재 활성화 하는 동안 KSHV 전사 사이 협회를 시각화할 수 있습니다.
서론
그것은 점점 더 분명 핵의 spatiotemporal 조직 진핵생물에서 정밀 하 게 조정 된 유전자 발현 조절에 중요 한 역할을 담당 하 게 되었다. 대부분 조직의 특정 유전자 많은 염색체를 통해 배포 됩니다 하 고 동기적으로 조정된 방식으로1특정 자극에 반응 하기 위하여 통제 될 필요가 있다. 셀 활성화 chromatin 허브 (ACH)을 함께 데리고의 유전자 및 그들의 cis 규정 구성 요소 특정 핵 공간1방법으로 생성 합니다.
그것은 또한 입증 되었습니다 다양 한 연구에 의해 그 핵 보이지만 매우 조밀 하 고 점성, 생물학적 활성 분자 통과할 수 핵 오히려 신속 하 게 보급2를 통해. 이 임시 속성 때문 대부분 DNA 의무적인 단백질 ' 점프 '를 그들의 길은 매우 적응 하 고 다양 한 핵2수 있는 핵 공간 느낌 사이트 바인딩 사이트 바인딩에서.
생체 내에서 핵의이 동적 동작에도 불구 하 고 핵 기관 막 없이 같은 (하지만에 국한 되지 않음) 핵소체 Cajal 몸과 promyelocytic 백혈병 핵 시체 (PML-NB....
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프로토콜
주의:이 절차에 사용 된 셀 라인 전염 성 바이러스를 포함, 조심 하 고만 레벨 2 BSL 시설 이상 진행.
1. 세포 준비 및 유지 보수
- 문화 체육-K-RTA BCBL-1 셀 (또는 다른 KSHV 감염 PEL 셀 라인) 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린 스 글루타민 솔루션 보충 RPMI1640 매체에.
- 지속적으로 성장 하 고 2-4 일 마다 1: 4의 비율에 의해 셀을 분할 하려면 확인 하 고 5% 이산화탄소 (CO2), 37 ° C에서 세포 성장.
- 모니터 셀 문화는 가벼운 현미경으로 매일 좋은 세포 성장 및 형태학, 그렇지 않으면 것이 좋습니다 세포 배양을 다시 시작 하거나 셀 문화 조건에 따라 조정할 것인지.
2. 티 미 딘 동기화 및 용균성 유도
- 10 cm 배양 접시, 접시 TREx-K-Rta BCBL-1 셀에 갓 준비 미디어 (미디어의 1 x 106 셀/2 mL)
- 200mm 티 미 딘을 추가 (최종 농도: 2 mM) 요리, 혼합 하 고 18 h에 품 어.
- 원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 ....
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결과
BCBL-1 셀 사용 되 고 라 나와 K-Rta RNA (그림 1) 스테인드 했다 약간 요약된 프로토콜 수행 되었다. 이 실험 검사 바이러스 episomes 적극적으로 베 끼고는 및 셀의 인구에 KSHV 재 자극에 응답의이를 수 있습니다. 그림 1에서 화살표로 표시 된 셀에 밀접 하 게 일치 (로 표시 라 나) 바이러스 episomes의 분포 지역에 고유 K Rta 형광 KSHV 게놈 가까이 일어나 활성 전사에 대 한 증거입니다. 동일한 샘플에서는 그림 1 에서 화살촉에 의해 의미 하는 것과 같은 셀 관찰할 수 있습니다, 많은 약한 및 확산 K Rta 형광 크게 중복 되지 않는 그 라 나로 전시 하는. 이것은 일반적인 찾는 내 세포의 인구는 다시 활성화 자극에 응답의 정도에 상당한 변화 보여줍니다.
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토론
특이 한 상황에 맞게 변경 될 수 있는 프로토콜의 몇 가지 측면을 확인 하 고 있습니다. 고정 및 permeabilization 버퍼의 선택 또한 변경 될 수 있습니다. 고정 버퍼에 대 한 paraformaldehyde도 효과적 이며 에탄올 permeabilization 사용할 수 있습니다.
PBS는 것이 좋습니다 그것 포름알데히드 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 부재에 항 체를 사용 하지 않도록 설정 하지만 글리신 PBS 단계를 건너뛸 수 있습니다 경우에 coverslips은 철저 하 게 충분 한 세척 된다, 글리신과 포름알데히드를 냉각 하 고 프로토콜에서 차단 솔루션으로 서 소 혈 청 알 부 민을 사용 하지 않습니다. 파일럿 연구는 RNA 저하 때문에 아마도 약한 RNA 물고기 신호를 보여준 이즈미 야 실험실에서 실시. 1 차 항 체에 대 한 차단, 필요한 경우 RNase 무료 BSA를 사용 하는 것이 좋습니다. 과거의 경험, 그것은 발견 되었다 항 체 특정 경우에, BSA.......
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공개 사항
이 문서의 저자는 금융 관계 또는 관심사의 경쟁 충돌 있다.
감사의 글
이 연구는 미국의 암 사회 연구 학술 상 (RSG-13-383-MPC)와 건강의 국가 학회 교부 금 (R01-DE025985)에 의해 지원 되었다. 이 작품 또한 지원 되었다 미국 농 무부 (2015-67015-23268 및 2014-67015-21787) 및 캘리포니아 대학에서에서 새로운 연구 이니셔티브 부여에서 교부 금에 의해 데이비스.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RPMI 매체 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | 37°C로 가열해야 합니다. C |
| 태아 소 세럼 | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| 펜 스트렙 글루타민 (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| 티미딘 | 시그마 알드리치 | T9250 | |
| 둘베코 s 인산염 완충 용액 | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | 시그마 알드리치 | P1585 | |
| 소듐 부티레이트 | Sigma Aldrich | B5887 | |
| 포름알데히드 솔루션 | Sigma Aldrich | 252549 | 부식성, 독성, 건강 위험 |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | 급성 독성 |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | 가연성, 독성 |
| 메탄올 | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II 항체 클론 CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, baker에서 전송' s 효모 (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| 식염수 시트르산 나트륨 버퍼 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | ||
| 포름아미드 | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% 용액 | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4',6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade 시약 | Life Technologies | S36936 | |
| 마이크로 커버 유리 22x22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D 이미징 소프트웨어 | ||
| DeltaVision 현미경 | |||
| Superfrost/Plus 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-15 |
참고문헌
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291
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재인쇄 및 허가
