기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

요약

바이러스 성 transcriptional 팩터리는 세포질 RNA 중 합 효소 II 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 전사를 증가 함께 풍성 하 게 이산 구조. 여기, 적극적으로 면역 형광 얼룩이 지 고 제자리에서 RNA 교 잡의 조합에 의해 3D 핵 공간에서 바이러스 성 염색 질을 속기의 사이트를 찾을 하는 방법을 설명 합니다.

초록

그것은 잘 알려진 유전자의 공간과 일시적인 규칙 경 세 적절 한 유전자 발현의 중요 한 부분입니다. 따라서, 어디 고 때 전사 일어나 핵 공간 내에서 이해 하 고 episomes 같은 세포의 핵 내에서 감염 사이 관계를 시각화 하기 위해 중요 한 아니다. 여기, 면역 형광 검사 (IFA)와 RNA-물고기 왔다 combinedto 식별 적극적으로 속기 Kaposi의 육 종 관련 herpesvirus (KSHV) episomes. KSHV 대기 시간 관련 핵 항 원 (라 나), 얼룩이 지기에 의해 바이러스 episomes는 핵 내에서 존재 하는 곳을 찾을 수입니다. 또한, 생산적인 감염 동안에 표시 됩니다, 바이러스 성 유전자의 intron 지역 대상으로 RNA-물고기 프로브를 설계 하 여 초기 RNA 사본 있을 수 있습니다. 이 조합의 분자 프로브를 사용 하 여, 큰 바이러스 성 녹음 방송 공장 조립 시각화 하 고 분석 KSHV 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 발현의 공간 규정 가능 하다. 포함 하 여 안티-RNA 중 합 효소 II 항 체 얼룩이 지기, 하나 또한 RNA 중 합 효소 II (RNAPII) 집계 및 재 활성화 하는 동안 KSHV 전사 사이 협회를 시각화할 수 있습니다.

서론

그것은 점점 더 분명 핵의 spatiotemporal 조직 진핵생물에서 정밀 하 게 조정 된 유전자 발현 조절에 중요 한 역할을 담당 하 게 되었다. 대부분 조직의 특정 유전자 많은 염색체를 통해 배포 됩니다 하 고 동기적으로 조정된 방식으로¹특정 자극에 반응 하기 위하여 통제 될 필요가 있다. 셀 활성화 chromatin 허브 (ACH)을 함께 데리고의 유전자 및 그들의 cis 규정 구성 요소 특정 핵 공간¹방법으로 생성 합니다.

그것은 또한 입증 되었습니다 다양 한 연구에 의해 그 핵 보이지만 매우 조밀 하 고 점성, 생물학적 활성 분자 통과할 수 핵 오히려 신속 하 게 보급²를 통해. 이 임시 속성 때문 대부분 DNA 의무적인 단백질 ' 점프 '를 그들의 길은 매우 적응 하 고 다양 한 핵²수 있는 핵 공간 느낌 사이트 바인딩 사이트 바인딩에서.

생체 내에서 핵의이 동적 동작에도 불구 하 고 핵 기관 막 없이 같은 (하지만에 국한 되지 않음) 핵소체 Cajal 몸과 promyelocytic 백혈병 핵 시체 (PML-NB) 여전히 존재. 그것은 탠덤 DNA 반복 (핵소체), rRNA (핵소체) 및 coilin (Cajal 몸) 또는 PML 등 구조 단백질 같은 메커니즘의 다양 한 통해 단백질 (PML-NB)는 이러한 구문을 함께^3,4,5 . 이러한 구조와 전사 공장 등 다른 교회 역할 뿐만 아니라 필수 구성 요소의 현지 농도 증가 하지만 단백질 및 궁극적으로 만들 그들 내에서 핵 산의 구성 조절 건설 기계는 효율적인 세포 기능⁶중앙 사이트입니다.

머릿속으로 하는 핵 구조 형태 epigenetics 공부 하는 연구원에 게 풍부한 정보를 제공 언제, 어디. 바이러스학의 관점에서 KSHV, 같은 latently 감염된 바이러스의 재 활성화 크게 변경 핵의 풍경과 전사 세포 유전자에서 주로 바이러스 성 유전자, 궁극적으로 이동 핵 효소의 분포를 완전 한 기능 바이러스 자손^7,8생산. KSHV는 바이러스 성 유전자 발현을 촉진 하기 위하여 세포 유전자 식 기계를 어떻게 조작 합니까? 이러한 정보에는 일시적인 세포 유전자 규제 메커니즘에 빛 창 고 수 있습니다.

다른 모든 herpesviruses KSHV는 용균성 복제 및 지연 시간 이라는 두 개의 라이프 사이클. KSHV는 주로 대기 시간 관련 유전자^9,10를 제외 하 고는 대부분의 바이러스 성 유전자의 식 입 막 음, 대기 시간 단계에 상주 합니다. KSHV 생산 대기 시간 동안 대기 핵 항 원 (라 나), constitutively 바이러스 성 게놈을 결속 하 고 인간 염색체¹¹에 바이러스 chromatin tethers 관련. 바이러스 성 게놈과 라 나의 친밀 한 관계 때문에 IFA와 DAPI를 사용 하 여 얼룩을 바이러스 성 episomes 호스트 chromatin 관계 했다 찾을 수 있다.

공부 하 고 단일 episome 수준과 감염 된 세포에 바이러스 성 다른 episomes와 협회에 KSHV 재 활성화, 적극적으로 베 끼 기 바이러스 chromatin에 제자리에 찾을 전략 설립 되었습니다. 따라서, 라 나 및 RNAPII IFA intron RNA-물고기와 결합 했다, KSHV K Rta는 주요 바이러스 성 단백질의 intron 지역 (정확한 프로브 시퀀스 이즈미 야 연구소의 최신 간행물⁸에서 찾을 수 있습니다)에 바인딩되는 RNA-물고기 프로브를 생성 하 여 필수 고 KSHV 다시 활성화-그것은 식별 가능한 충분 한 전사 찍고 실제로 어디 장소^{8,11,12,,1314,15} . 이 intron RNA-물고기 기술 연구원을 어디 mRNA 접합 이며 세포질^16,17수출 직전 변하게 되는 시각화 수 있습니다.

KSHV phorbol 에스테 르 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) 등을 포함 한 다양 한 화학적 자극에 의해 활성화 될 수 있습니다 및 또한 KSHV 낙 산 염 나트륨 같은 히스톤 deacetylase 억제 물의 overexpression에 의해 활성화 유도 될 수 있다 바이러스 성 녹음 방송 인수, K-Rta¹⁹입니다. 연구원은 성공적으로 다시 활성화¹⁸유도 전에 셀의 사이클을 동기화 하 여 KSHV 재 활성화의 효율성 증가. 따라서, 이러한 특정 연구에 대 한 셀 더블 티 미 딘 블록 (아래에 설명 된 프로토콜)를 사용 하 여 및 짧은 시간에 대 한 TPA와 아목시실린과 (Dox) 알을 품을 동기화 했다. Doxycyline는 이러한 실험에 활용 셀 라인 doxycycline 유도할 수 있는 K-Rta 카세트 cDNA에서 복제 했다 하 고 K-Rta의 intron 지역에 포함 되지 않습니다 때문에 사용 되었다. 다시 활성화할 수 있지만 K-Rta 식 유도 KSHV 사용 하 여, 그것은 입증 된 다른 연구자는 다양 한 다른 생 화 확 적인 요인으로 인해 K-Rta 식 혼자 판명 미약한 재 자극²⁰. 이들의 모두를 결합 하 여, 시간의 짧은 기간에 마약 외피를 제한 하 여 강력한 하지만 지나치게 인공 KSHV 재 이미징 달성 되었다.

라 나, RNAPII, 라벨링 후 K-Rta introns 그리고 DNA로이 문서에 설명 된, 3D 형광 이미징 widefield deconvolution 현미경을 사용 하 여 수행 되었다. 이미징 소프트웨어와 처리 후 활성 바이러스 episomes의 공간적 분포는 제대로 평가할 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여, 활성 chromatin 허브 및 다른 핵 구조 형성의 근본적인 성격에 관한 중앙 질문 공부 될 수 있다. 동일한 규제 요소를 처리 하는 단일 셀에 있는 동일한 바이러스 episomes spatiotemporal 유전자 규제 메커니즘의 이해를 깊게 하는 독특한 연구 도구를 나타낼 수 있습니다.

이미징 여러 세포 표본을 다른 시간 지점에서 고정 본질적으로 동적 분자 과정의 특성의 한계는 형광 분포에서 미묘한 또는 소규모 변화 감지 되지 않습니다 또는 하 찮은 것으로 간주. 희소 한 경우에 모든 세포 관찰 같은 미묘한 변화를 표시 하지 않는 한 이것은 사실 이다. 따라서, 활성 바이러스 성 전사 및 다른 핵 구조의 전체 spatiotemporal 관계 비판적으로 계산 해야 고정 된 이미지를 사용 하 여 합니다. 이러한 기술적 과제를 해결 하기 위해 가장 좋은 방법은 이미지 라이브 세포 바이러스 episomes을 표시 하 고 시간이 지남에 주요 세포질 효소의 위치에 따라입니다.

프로토콜

주의:이 절차에 사용 된 셀 라인 전염 성 바이러스를 포함, 조심 하 고만 레벨 2 BSL 시설 이상 진행.

1. 세포 준비 및 유지 보수

1. 문화 체육-K-RTA BCBL-1 셀 (또는 다른 KSHV 감염 PEL 셀 라인) 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린 스 글루타민 솔루션 보충 RPMI1640 매체에.
2. 지속적으로 성장 하 고 2-4 일 마다 1: 4의 비율에 의해 셀을 분할 하려면 확인 하 고 5% 이산화탄소 (CO₂), 37 ° C에서 세포 성장.
3. 모니터 셀 문화는 가벼운 현미경으로 매일 좋은 세포 성장 및 형태학, 그렇지 않으면 것이 좋습니다 세포 배양을 다시 시작 하거나 셀 문화 조건에 따라 조정할 것인지.

2. 티 미 딘 동기화 및 용균성 유도

1. 10 cm 배양 접시, 접시 TREx-K-Rta BCBL-1 셀에 갓 준비 미디어 (미디어의 1 x 10⁶ 셀/2 mL)
2. 200mm 티 미 딘을 추가 (최종 농도: 2 mM) 요리, 혼합 하 고 18 h에 품 어.
3. 원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 갓 준비한 미디어 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 갓된 미디어에 resuspend.
4. 8 h S-단계를 종료를 셀 수 있습니다.
5. 티 미 딘을 추가 (최종 농도: 2 mM), 혼합 및 16 h에 대 한 품 어.
6. 원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 갓 준비한 미디어 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 갓된 미디어에 resuspend.
7. 바이러스 재 활성화를 유도, 세포 배양에 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, 최종 농도 20 ng/mL)와 아목시실린과 (DOX, 최종 농도가 100 ng/mL)을 추가 하 고 혼합 4 h에 대 한 품 어. K-Rta 유도할 수 있는 카세트 없이 셀 라인, TPA (최종 농도 20 ng/mL 및 나트륨 낙 산 염 (1mm))를 사용 하 여 다시 활성화 자극.
8. 원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 완전 한 문화 미디어에 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 완전 한 문화 미디어에 resuspend.
9. 24 h에 대 한 성장 하는 세포 수 있습니다.

3. 고정 및 Permeabilization

참고: 계속 하기 전에 확인 고정 솔루션 (DEPC 처리 PBS에 3.7% 포름알데히드), diethyl pyrocarbonate 처리 인산 염 버퍼 식 염 수 (DEPC-PBS), 글리신 DEPC PBS (글리신의 최종 농도: 100 m m) permeabilizating 솔루션 (50% 아세톤, 50% 메탄올) 준비 된다. 일반적으로, 각 슬라이드 필요 적어도 0.5 백만 셀, 필요한 경우 증식 되며 포함 다시 추가 셀 위 세포가 건강 한 경우에 특히.

1. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포를 수집 합니다.
2. 원심 200 x g. 세척에서 2 분 동안 셀 셀 3 번 살 균 DEPC PBS의 1 mL. DEPC PBS의 1.2 ml에서 resuspend.
3. 6 잘 플레이트의 바닥에 coverslips (실험적인 체제에 의해 결정)의 적절 한 수를 놓습니다.
4. 플라스틱 셀에 각 coverslip DEPC PBS 혼합물의 200 µ L, 각 슬라이드에 적어도 0.5 백만 셀 인지 확인 합니다. 2 분 해결 하기 위해 세포를 허용 하 고 발음만 세포의 얇은 층을 떠나 초과 DEPC PBS. 그것은이 과정에서 제거 되 고 셀에 대 한 정상입니다.
   주의: PFA는 독성, 적절 한 보호를 착용.
5. 신중 하 게 각 커버 슬립 솔루션 (DEPC PBS에 3.7% 포름알데히드) 해결의 1 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 해결 하기 위해 셀 수 있습니다.
6. Coverslips DEPC PBS로 3 회 세척.
7. 글리신 DEPC PBS의 1 mL를 신중 하 게 추가 (글리신의 최종 농도: 100 mM) 각 커버 슬립. 5 분 동안 담금질 하기 위해 셀 수 있습니다.
8. 1 분 Aspirate 초과 DEPC PBS에 단단히 하지만 부드럽게 손을 흔들 또는 5 분 통에 DEPC PBS와 어느 곳의 1.5 mL를 추가 합니다. 수 셀을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 3 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.
9. 신중 하 게 각 커버 슬립 솔루션 (50% 아세톤, 50% 메탄올) permeabilizing의 1 mL를 추가 합니다. 15 분 동안 permeabilize를 셀 수 있습니다.
   참고:이 시점에서 coverslips는 더 이상 일주일에 보다는-20 ° C 냉장고에 저장할 수 없습니다. 동결 방지 하거나 이미지 품질을 신속 하 게 저하 될 수 있습니다 냉동 실에서 보낸 시간을 최소화 합니다. 있는지 확인 그 때 셀 남아 냉장고에에서 젖은 고는 그들이 제대로 리하이드레이션 DEPC PBS를 가진 후 냉장고에서 제거 하 고 메탄올/아세톤에 덮여.
10. 5 분 통에 어느 장소와 DEPC PBS의 1.5 mL를 추가 또는 단단히 악수 하지만 손에 부드럽게 1 분에 대 한 발음 초과 DEPC PBS, 셀을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 3 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.

4. 아일랜드와 RNA-물고기

참고: RNA 물고기 프로브 라벨 및 준비에 관한: 대는 K-Rta 959 기본적인 쌍, 31 다른 프로브 intron 했다 생성 약 50%의 콘텐츠 20 기본적인 쌍 각, GC를 포함 했다. 프로브 및 재고 솔루션 각각 100 µ M와 2.5 µ M 농도, aliquoted 했다.

1. 필요한 실험 정보 레이블 현미경 슬라이드 또는 구별할 수 라벨의 일종.
2. 축축한 종이 수건으로 sealable 플라스틱 컨테이너의 하단 라인.
3. 1 차적인 항 체 솔루션을 준비 (1.5 µ L 라 나 항 체, RNA Pol II 항 체의 0.75 µ L, 베이커의 3 µ L의 tRNA, 30 µ L까지 DEPC PBS 효 모), 각 coverslip 존재에 대 한 제조 법을 곱하면. 각에 1 차적인 항 체 솔루션의 장소 30 µ L 현미경 슬라이드 표시.
   1. 처음 관심의 1 차적인 항 체를 적정 하 고 최적의 금액을 사용 합니다. 반드시 사용 순화 IgG, 세럼 (ascites 액체) RNase의 다량을 포함할 수 있습니다.
4. 레이블이 지정 된 현미경 슬라이드에 coverslip (셀 솔루션을 직면 하 고)를 놓고 축축한 종이 수건으로 컨테이너에 슬라이드를 이동 합니다. 조심 하지 거품을 소개 합니다. 커버 플라스틱 랩으로 컨테이너의 외관. 1 시간 동안 37 ° C로 설정 하는 인큐베이터에 컨테이너를 이동 합니다.
5. 준비 물고기 워시 버퍼 (2 x 염 분 나트륨 구 연산 염 버퍼 (SSC) (최종), 10 %formamide, 90% DEPC dH₂O).
6. 준비 하는 교 잡 버퍼 x 2 (4 x SSC, 20 %dextran 황산).
7. 이차 항 체와 물고기 intron 프로브 버퍼 준비 (2 교 잡 버퍼 (최종 1 Hyb 버퍼 x) x의 20 µ L, 베이커의 효 모의 4 µ L tRNA (최종 10%), formamide (마지막 10%), K-Rta intron 프로브의 4 µ L (최종 125 nM), 0.8 µ g의 이차 항 체, DEPC dH₂ 최대 40 µ L O)입니다. 필요한 모든 슬라이드에 대 한 제조 법을 곱하면 됩니다.
8. 부 화, 후 3 번 5 분 6 잘 플레이트에서 DEPC PBS로 세포 세척.
9. 3 시간 5 분 대 한 물고기 워시 버퍼 씻어. 물고기 세척까지 버퍼에 유지 coverslip 혼합물의 둘째 항 체와 intron 프로브 (단계 4.7) 준비 완료.
10. 깨끗 한 유리 슬라이드 교 잡에 대 한 1 차적인 항 체 외피에 대 한 사용.
11. 이차 항 체와 물고기 intron 프로브 솔루션 각 유리 슬라이드에 포함 된 40 µ L를 배치 합니다.
12. 거품을 소개를 하지 않도록 주의 수 버퍼, 위에 셀 면 슬라이드에 세포와 coverslips을 놓습니다.
13. 하단에 축축한 종이 수건으로 플라스틱 용기에 슬라이드를 놓습니다. 최초의 플라스틱 포장 및 알루미늄 호 일 플라스틱 용기 포장.
14. 16-24 h에 대 한 37 ° C에서 슬라이드와 컨테이너를 품 어.
15. 부 화, 후 신중 하 게는 coverslip 유리 슬라이드 가장자리에서 슬라이드 다시 위로 향하도록 6 잘 플레이트에 넣어 그리고 물고기 워시 버퍼 3 회에서 5 분 동안 6 잘 플레이트 세포를 씻어.
16. 2 번 2와 셀 세척 x SSC.
17. 2로 DAPI (1:1, 000)를 추가 x SSC 및 실 온에서 5 분 동안 앉아 있게.
18. 2 번 2와 셀 세척 x SSC.
19. 교 잡, 사용 유리 슬라이드를 청소 하 고 유리 슬라이드에 솔루션 설치 10 µ L을 추가.
20. 장착 솔루션에 coverslips 뒤집어를 놓습니다. 조심 하지 거품을 소개 합니다.
21. 연구소 조직으로 부드럽게 셀 스쿼시 주의 초과 설치 솔루션을 제거 합니다.
22. 매니큐어를 사용 하는 coverslips의 가장자리 주위에 충분 한 레이어를 적용 하 고 건조를 허용.
23. 형광 현미경 검사 법 수행을 계속 진행 합니다.

5. 3D 형광 현미경 검사 법

참고: 프로토콜 사용 하는 형광 현미경 시스템의 유형을 변화할 것 이다, 하는 동안 다음 단계 정량 분석에 대 한 최적의 이미지 데이터의 수집을 위해 도움이 됩니다.

1. 고정된 샘플을 pretreat 고 형광 photobleaching 이미징 동안 지연 방지 페이드 미디어에 탑재.
2. 모든 셀 (또는 셀 핵)을 캡처할 수 있습니다 (예: 60 X 1.42 한다 기름 침수 렌즈), 높은 품질 목표를 사용 하 여 보기의 필드에.
3. 노출 매개 변수 (예를 들어, 전원을, 노출 시간 긍정 및 부정적인 컨트롤 샘플을 사용 하 여 각 형광 색 채널에 대 한) 설정 합니다. 형광 이미지를 취득 합니다.
   참고: 하나의 형광 라벨을 포함 하는 긍정적인 컨트롤 샘플도 색상 채널 사이 "누화"의 레벨을 사용 해야 합니다. 이미지 고정된 셀 표본에 대 한 형광 전원을 줄일 수 있습니다 (약간 더 긴 노출 시간)와 photobleaching를 최소화 하기 위해.
4. 이미징 프로토콜 설정 된 후 유지 동일한 노출 매개 변수 연구에서 모든 샘플에 대 한 일관성 있는-이미지 데이터를 정확 하 게 분석 하 고 비교할 수 있도록.
5. 사후 수집 이미지 처리 및 3 차원 재구성을 수행 합니다. 식별 RNA 물고기 신호 (적색)에 의해 K-Rta 사본, 면역 형광 (녹색), 및 핵 chromatin 라 나 분자 (해당 되는 경우) DAPI (파란색)으로 물.
   참고: 있는 K-Rta와 라 나 공동 클러스터는 세포 핵의 지역 따라서 바이러스 성 녹음 방송 공장 및 복잡 한 복제와 관련 된 것으로 믿어진다.

결과

BCBL-1 셀 사용 되 고 라 나와 K-Rta RNA (그림 1) 스테인드 했다 약간 요약된 프로토콜 수행 되었다. 이 실험 검사 바이러스 episomes 적극적으로 베 끼고는 및 셀의 인구에 KSHV 재 자극에 응답의이를 수 있습니다. 그림 1에서 화살표로 표시 된 셀에 밀접 하 게 일치 (로 표시 라 나) 바이러스 episomes의 분포 지역에 고유 K Rta 형광 KSHV 게놈 가까이 일어나 활성 전사에 대 한 증거입니다. 동일한 샘플에서는 그림 1 에서 화살촉에 의해 의미 하는 것과 같은 셀 관찰할 수 있습니다, 많은 약한 및 확산 K Rta 형광 크게 중복 되지 않는 그 라 나로 전시 하는. 이것은 일반적인 찾는 내 세포의 인구는 다시 활성화 자극에 응답의 정도에 상당한 변화 보여줍니다.

토론

특이 한 상황에 맞게 변경 될 수 있는 프로토콜의 몇 가지 측면을 확인 하 고 있습니다. 고정 및 permeabilization 버퍼의 선택 또한 변경 될 수 있습니다. 고정 버퍼에 대 한 paraformaldehyde도 효과적 이며 에탄올 permeabilization 사용할 수 있습니다.

PBS는 것이 좋습니다 그것 포름알데히드 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 부재에 항 체를 사용 하지 않도록 설정 하지만 글리신 PBS 단계를 건너뛸 수 있습니다 경우에 coverslips은 철저 하 게 충분 한 세척 된다, 글리신과 포름알데히드를 냉각 하 고 프로토콜에서 차단 솔루션으로 서 소 혈 청 알 부 민을 사용 하지 않습니다. 파일럿 연구는 RNA 저하 때문에 아마도 약한 RNA 물고기 신호를 보여준 이즈미 야 실험실에서 실시. 1 차 항 체에 대 한 차단, 필요한 경우 RNase 무료 BSA를 사용 하는 것이 좋습니다. 과거의 경험, 그것은 발견 되었다 항 체 특정 경우에, BSA...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI 매체 1650 GlutaMAX	Gibco by Life Technologies	61870-036	37°C로 가열해야 합니다. C
태아 소 세럼	Omega Scientific Inc.	FB-11
펜 스트렙 글루타민 (100x)	Gibco by Life Technologies	10378-016
티미딘	시그마 알드리치	T9250
둘베코 s 인산염 완충 용액	Gibco by Life Technologies	14190-144
TPA	시그마 알드리치	P1585
소듐 부티레이트	Sigma Aldrich	B5887
포름알데히드 솔루션	Sigma Aldrich	252549	부식성, 독성, 건강 위험
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma Aldrich	D-5758	급성 독성
Glycine	Sigma Aldrich	410225
Acetone	Sigma Aldrich	179124	가연성, 독성
메탄올	Fisher Chemical	67-56-1
KSHV/HHV-8 ORF73	Advanced Biotechnologies	13-210-100
Anti-RNA Polymerase II 항체 클론 CTD4H8	EMD Milipore	05-623
Ribonucleic acid, baker에서 전송' s 효모 (S. cerevisiae)	Sigma Aldrich	9014-25-9
식염수 시트르산 나트륨 버퍼 20x (SSC)	Thermo Fisher Scientific
포름아미드	Sigma Aldrich	295876
Omnipur Dextran Sulfate, 50% 용액	EMD Milipore	1916C093
DAPI (4',6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306
slowFade Gold antifade 시약	Life Technologies	S36936
마이크로 커버 유리 22x22	Matsunami	C022221
VoloCITY		3D 이미징 소프트웨어
DeltaVision 현미경
Superfrost/Plus 현미경 슬라이드	Fisher Scientific	12-550-15