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방법 논문

조 혈 줄기와 뿌리를 Quantitate를 생체 외에서 시험의 개발 세포 (HSPCs) Zebrafish 태아를 개발

7.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56836

⸱

2017년 11월 30일

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

이 논문에서

요약

여기, 우리는 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs) 배아 zebrafish quantitate 간단한 방법을 제시. 천연된 제 브라에서 HSPCs는 지원 요소, 성숙한 혈액으로 차별화와 스에 도금. 혈액의 검출 결함 및 심사 실시 쉽게 마약을 수 수 있습니다.

초록

조는 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs) 성숙한 혈액을 구성 하는 다른 세포 계보의 무리로 분화 하는 필수적인 세포 프로세스입니다. 격리 및 식별이이 HSPCs의 어렵습니다 때문에 정의 된 전 게시물 사실상; 그들은 특정 세포 계보에 그들의 감 별 법 후만 정의할 수 있습니다. 지난 몇 년간 제 브라 (Danio rerio) 조 연구에 모델 생물 되고있다. Zebrafish 태아 utero 전, 개발 하 고 48 h 후 수정 (hpf)에 의해 확실 한 HSPCs. 분석 HSPC 차별화를 평가 하기 위해 생성 된 이식 활용 확산 기능 개발 된 이후 confocal 현미경 검사 법으로 특수 유전자 변형 라인 시각화 뿐만 아니라 조 혈 시스템의 재구성. 그러나, 이러한 분석 비용 금지, 기술적으로, 어렵고 많은 실험실에 대 한 시간이 소모 되는. HSPCs를 평가 하기 위해 생체 외에서 모델의 개발 비용 효과적이 고, 빨리, 그리고 이전에 비해 적은 어려움 설명 방법, 신속 하 게 HSPC 생물학에 영향을 주는 mutagenesis와 약 스크린을 평가 하기 위해 실험실을 수 있도록. 이 소설 체 외에서 분석 결과 HSPCs를 평가 하는 도금 해리 전체 zebrafish 태아 및 HSPC 차별화 및 확산 촉진 추가 외 인 요인에 의해 수행 됩니다. 배아는 단일 세포로 해리 하 고 단일 조상 세포에서 발생 하는 콜로 니 형성 단위 (CFUs)을 생성 하는 그들을 원인이 HSPC 지원 식민지 자극 요인으로 도금. 이 분석 실험 분자 통로의 더 주의 깊은 검사 HSPC 확산, 차별화, 및 그것의 dysregulation 척추 조의 토대를 이해 하는 연구자 수 있도록 규칙에 대 한 책임을 허용 해야 동안에 질병.

서론

조는 다양 한 생명체의 생존에 필요한 성숙한 혈액 세포를 만드는 과정입니다. 성숙한 혈액을 구성 하는 발달 제한 된 세포 유형의 다양 한으로 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 분화에 관련 된 주요 발달 과정 이다. 이러한 HSCs 시스템은 결코 소진 하 고 그들은 죽을 때까지 초기 배아 개발에서 유지 해야 갱신 자가 해야 합니다. 척추 동물, 지속적인 차별화 및 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs)의 확산 하는 데 필요한 포스트 mitotic 혈액 세포의 대부분을 보충 적절 하 게 매일 재활용 되 고. HSCs 제한 조상 세포;의 하위 집합에 첫 번째 차별화 하 여 성숙한 혈액 세포 생성 일반적인 림프 창시자 (CLPs)1, 결국 T, B, NK 세포를 생산, 그리고 granulocytes, 적혈구, macrophages, 및 없으며 생성 하는 일반적인 골수성 창시자 (CMPs)2 . 이러한 창시자 특정 세포 계보를 생성 하는 최선을 다하고 있습니다 및 추가 골수성 erythroid 창시자 (Mep) 적혈구와 혈소판, 또는 granulocyte 생성 하는 등 더 발달 제한 조상 세포로 분화 대 식 세포 창시자 (GMPs) basophils, 호 산 구는 고 대 식 세포, 호 중구,2를 생성 하는. 식별 하 고 이러한 창시자 분리 중요 한 분자 경로 식별 조 혈 분화에 관련 된 있으며이 조상 세포를 제대로 하지 못할 때 발생 하는 백혈병 등 많은 조 혈 질환 차별화.

지난 몇 년간 zebrafish (Danio rerio) 모델 시스템 배아 및 성인 조 혈 연구에 대 한 주요 연구 도구 되고있다. Zebrafish 순종 유전자 분석 하 고 비슷한 맥 관 구조와 인 간에 게 조 혈 시스템 phylogenetically 낮은 척추 모델 종. Zebrafish 태아 전 utero, 개발 하 고 48 시간 게시물 내 수정 (hpf) 생성 HSPCs3,,45,6,,78. Zebrafish는 또한 높은 다 산, 여 성과 단일 클러치에 100 달걀에 누워 큰 샘플 크기와 실험적인 복제 허용. Zebrafish 태아는 광학 투명, 조 혈 시스템의 미세한 시각화에 대 한 허용 합니다. HSCs runx1같은 표시 zebrafish의 여러 형광 유전자 변형 라인: EGFP 물고기9, cd41: EGFP 물고기10및 kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 더블 양성 동물, HSC 출현과 확장 vivo에서3,4,7,8,의 라이브, 실시간 시각화를 위한 허용 9. Zebrafish의 빠른 생성 시간 및 개발 utero 전 을 주도하 고 있다 mutagenesis 연구11,12,13,,1415 에 약물의 사용 16,17,18,,1920 인간의 혈액 질환에 대 한 치료 약속을 잡고 화합물에 대 한 검사. 전반적으로, 조 혈 시스템, 존재의 유전자 변형, 선과 빠른 재생 시간을 쉽게 개발의 보존이 했다는 제 브라는 저렴, 신속 하 고, 유연 하 고 이상적인 조 혈 연구에 대 한 모델을.

포유류 조 혈 시스템에서 분리 하 고 테스트 HSCs의 수많은 방법이 개발 되었습니다. 수사 경과 염료25,26에 HSCs의 능력을 악용 뿐만 아니라 마크 HSCs21,22,,2324, 세포 표면 수용 체의 결합을 이용할 수 있다. 후에 그들은 분류는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 그들의 물리적 분리 수 있습니다. 셀은 HSC 임을 증명 해 내 생 HSPCs, 상 상속 HSCs, 이식 장기, 다중 계보 재구성 모든 혈액 세포 유형 성숙 관찰 하 고 파괴 하는 호스트 동물 필요 합니다. 조 혈 모 세포 및 면역 이식에 대 한 일치를 촉진 하는 타고 난된 마우스 긴장에 대하여 수많은 세포 표면 항 체는이 분석 실험 쥐에서 잘 작동 합니다. 그러나, 몇 가지 zebrafish 조 혈 모 세포 표면 항 체 생성 된27, 식별 및 격리 HSCs의 방해 되었습니다. Zebrafish HSCs를 분리 하 고 하는 가장 일반적인 방법은 유전자 변형 동물, 그것에 의하여 셀 특정 발기인 순서 운전 형광 단백질의 표정은. 연구 시각 있고이 기술을3,4,,89를 이용 하 여 현미경으로 등 쪽 대동맥의 복 부 벽에 HSCs를 열거. 다른 실험실 zebrafish28,29 의 클론 변종 생성 하 고 일치 하는 MHC 동물30성공적인 이주를 수행 했습니다. 그러나, 이러한 기술은 비용 많은 실험실에 금지, 기술적으로 어려운 이며 시간이 소요. 이러한 문제를 해결 하기 위해 실험실 여러 생체 외에서 분석 실험을 존재, 확산 속도, 그리고 HSPCs31,,3233의 분화 능력에 대 한 테스트 생성 34,,3536. 이 분석 실험 쇼 확산 및 HSPCs 시험관에31,32,33,,3435,36의 구조의 차별화 조 혈 결함36, 그리고 발견 하 고 cytokines33,,3435테스트는 효율적인 방법. 그들은 또한 유전자 HSPC 생물학31,32에 대 한 책임을 식별 하기 위해 활용 되었습니다. 이 연구에서 우리 걸릴이 분석 한 단계 더 나아가, 발전 zebrafish 태아에 있는 HSPCs의 정량 수 있도록. 이 분석 실험 또한 돌연변이 동물에 HSPCs의 수를 quantitate에 이용 될 수 있다 고 동물 조 혈 파괴 약물 치료. 본질적으로,이 분석 실험은 빠르고, 현재 몇 가지 기술 과제, 되며 quantitate HSPC 숫자, 그들의 확산을 시험 하 고 차별화에 블록을 조사 하는 저렴 한 방법.

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프로토콜

캘리포니아 주립 대학, 치 코, 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 자문 위원회는 모든 방법을 아래에 설명 된 승인.

1. 블리치 48 hpf Zebrafish 태아

  1. 와 함께 15 cm (w) x 15 c m (l) x 7 cm (h) 플라스틱 용기 3 세척 스테이션 만들기: 1) 1000 mL 배아 매체 (E3, 표 1참조) 표 백제 5%의 1 mL, 2)와 함께 살 균 E3와 함께 3) 살 균 E3. 각 컨테이너에 배아 잠수함 솔루션의 500 mL 있는지 확인 하십시오.
    참고: 테스트 각 조건에 대해 적어도 10 배아 필요할 것 이다. 이 세척 절차는 최대 200 배아를 수용할 수 있습니다.
  2. 전송 피 펫과 배아 차 여과기에 놓고 5 분 (내부 배아)와 차 여과기를 제거 하 고 세척 역 5 분;에 대 한 # 2에 대 한 세척 역 # 1에에서 계란을 잠수함 마지막 5 분 동안 세척 역 # 3를 반복 합니다.
  3. 마지막 세척 후 깨끗 한 10 cm 배양 접시에 거꾸로 그것을 선회 하 고 부드럽게 배아를 rinsing 하 여 차 여과기에서 린스 배아에서 살 균 e 3와 차 여과기 및 전송 피 펫.

2. Dechorionate 배아

  1. 전송 피 펫와 함께 제거와 페 트리 접시에서 가능한 많은 e 3를 삭제 하 고 추가 dechorionation 프로 테아 제 (10mg/mL)의 500 μ 배아. 5 분 부드럽게 누릅니다 완전히 제거 하는 chorions를 페 트리 접시의 측면에 대 한 실 온에서 품 어.
  2. 혈 청 학적인 피 펫으로 메 마른 E3 효소 희석의 20 mL를 추가 합니다. 정착, 배아를 허용 하 고 전송 피 펫으로 E3를 제거 합니다. 3 번 dechorionation 효소의 모든 흔적을 제거 하려면이 세 단계를 반복 합니다.

3. 배아 샘플 준비

  1. P1000 피 펫을 사용 하 여 단일 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 10 배아를 놓습니다.
  2. 피 펫과 e 3를 제거 하 고 삭제.
    주의: 플라스틱 주의 배아 수 쉽게 전치 하 고 다음 세척 단계 삭제.

4. 배아를 분리에 대 한 준비

  1. 층 류 두건에 샘플을 전송 하 고 1 mL을 추가 하 여 태아를 씻어 살 균 E3. 배아 튜브의 하단에 정착 하 고 상쾌한 P1000 피 펫과 제거를 허용 합니다. 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다.
  2. 마지막 세척 후 e 3를 제거 하 고 삭제 합니다. E3 점액 코팅 (및 포자, 효 모, 또는 박테리아에 갇혀 있을 수 있습니다) 배아 zebrafish를 둘러싼 제거 하에 10 m m dithiothreitol (DTT)의 1 mL를 추가 합니다. Microcentrifuge 튜브 가로로 층 류 두건은 25 분에 실 온에서 품 어.

5. 배아 분리

  1. 샘플 3 번 (캘리포니아2 + , 마그네슘2 +)와 함께 살 균 DPBS의 1 mL로 씻는 다. 마지막 세척 후 (캘리포니아2 + , 마그네슘2 +)와 함께 DPBS의 500 μ를 추가 하 고 추가 5 mg/mL (26 U/mL) 분리 효소의 5 μ.
    주의:이 효소 필요 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 그래서는 DPBS 이러한 이온을 포함 하는 것을 확인 하십시오.
  2. 층 류 두건에서 60 분 장소 샘플에 대 한 180 rpm에서 수평 궤도 통에 37 ° C에서 샘플을 품 어와 샘플은 완전히 해리까지 한 P1000와 배아를 triturate.
    주의: 주기적으로 그들은 해리 될 때 결정 하는 배아를 확인 합니다. 배아 솔루션 있어야 어느 정도의 조직. 그것은 완전히 동질적인 해서는 안됩니다. 수-다이제스트 ( 보충 그림 1참조) HSPCs 파괴 됩니다.

6입니다. 천연된 배아의 준비

  1. 5 mL 폴리스 티 렌의 최고 저수지에 피 펫 10 해리 배아 라운드 35 μ m 셀 스 트레이너 캡 하단 튜브.
  2. 피 펫와 린스 (Ca2 + 나 가진 Mg2 +) 살 균 PBS와 전송 솔루션 5 mL를 포함 하는 폴리스 티 렌 관을 배양 튜브 단계 6.1에서에서 셀 필터링. 액체의 4 mL 5 mL 폴리스 티 렌 튜브에 존재 하는 때까지 반복 합니다.
    참고: PBS, DPBS, 또는 다른 isotonic 버퍼 솔루션 사용할 수 있습니다이 단계에서 그들은 포함 되지 않은 Ca2 + 또는 Mg2 + 로
  3. 4 ° C와 5 분 무 균된 셀 샘플을 펠 렛 300g x 튜브 원심 피 펫, 제거와 상쾌한 라운드 하단 튜브에서 삭제. 튜브의 하단에 수송과 세포를 방해 하지 않는 주의 하십시오. PBS의 100 μ 셀 resuspend

7입니다. 스 준비

  1. 완전 한 스 (표 1) 재고 솔루션 x 1을 생성 하 고 메 마른 라운드-하단 14 mL 튜브 3 mL 주사기와 바늘 16 G 2.5 mL을 추가. 한 튜브를 사용 하 여 테스트 하는 각 조건에 대 한.
  2. Cytokines, 작은 분자, 또는 다른 에이전트 각 샘플에 조사를 추가 합니다.
    1. 골수성 차별화에 대 한 1% 잉어 혈 청 및 0.3 mg/mL 재조합 zebrafish granulocyte 콜로 니 자극 인자 (Gcsf)34 스 매체를 추가 합니다. 참조 Svoboda 외. 37 잉어 혈 청 및 재조합 cytokines 생성 하는 방법에 전체 설명
    2. Erythroid 차별 화를 위한 스 보통 1% 잉어 혈 청 및 0.1 mg/mL 재조합 zebrafish erythropoietin (Epo)38 을 추가 합니다.
    3. Multilineage 창시자 검사, Epo, Gcsf를 추가 합니다.
      주의: Cytokines 및 첨가제 해야 하지 총 총 볼륨의 10% 이상으로 매체 개별 식민지 분별 충분히 점성 되지 않습니다.

8입니다. 스 천연된 배아의 추가

  1. 피 펫을 사용 하 여, 재조합 cytokines와 잉어 혈 청을 준비 스의 표면에 해리 10 태아의 100 μ를 추가 합니다. 캡 뚜껑 하 고 완벽 하 게 균질 샘플을 부드럽게 소용돌이. 각 튜브는 이제 10 배아의 천연된 조직이 있어야 합니다.
  2. 3 mL 주사기와 바늘 16 G, 2 별도 35 mm 페 트리 접시에 샘플의 aliquot 1 mL을 사용 하 여. 샘플 페 트리 접시에 걸쳐 완전히 분산 된 다는 것을 확인 하십시오. 각 샘플에 대해 반복 합니다.
  3. 15 cm 배양 접시에 스에 셀 35 m m 접시를 놓습니다. 각 15 cm 접시 한 35mm 페 트리 접시를 샘플 축이다 살 균 물 5 mL를 추가 합니다. 7-10 일 동안 32 ° C, 5% CO2 에서 품 어.

9. HSPC 파생 된 콜로 니 형성 단위 (CFUs)의 시각화

  1. 7 일 잠복기 후 시각화 및 열거형에 대 한 40-100 X에는 거꾸로 한 현미경에 샘플을 배치 합니다. 이 시점에서 개별 식민지 절연 한 피 펫을 하 고 얼룩 및 유전자 분석 대상이 될 수 있습니다.

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결과

배아 zebrafish에 HSPC 숫자를 평가 하기 위해 48 hpf 배아 소화, exogenous 지원 조 혈 성장 인자, 스에 도금 되었고 7 일 (그림 1A)에 대 한 인 큐베이 팅. 7 일 후, 콜로 니 형성 단위 (CFUs) 열거 (그림 1B)과 이미지 (그림 1C) 했다. 제어 함으로써 추가 다른 cytokines, 한 식민지 생산의 종류를 제어할 수 있습니다: Epo erythroid 차별 화를 위한 필요는 및 Gcsf는 골수성 차별화 필요. 혈 청 잉어는 태아 둔감 한 혈 청의 사용 포유류 조직 문화; 그것은 일반적인 성장 요인의 소스입니다. 그림 1, E...

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토론

Zebrafish 모델 시스템은 원시적이 고 확실 한 척추 조 공부, 효과적, 효율적이 고 저렴 한 모델이 되었다. 빠르고, 저렴 한, 그리고 몇 가지 기술적인 어려움을 제시 하는 분석 실험의 세대는 작은 분자를 테스트, 돌연변이 배아를 분석 하 고 분자 경로 HSPC 생물학에 대 한 중요 한 elucidating 활용할 수 있습니다. 생체 외에서 도금 HSPCs의 성인 제 브라에서 mutagenesis, cytokines, 그리고 조 혈 결함을 공부 하는 효과적인 방법입니다. 이 프로토콜은 그 연구를 구축 하지만 배아 zebrafish를 활용 하 여. 배아 zebrafish에 이러한 분석을 적용 빠른 데이터 수집, 적은 물리적 공간, (마약), 스크린에 대 한 더 적은 약물의 사용의 사용과 테스트 mRNA overexpression 또는 특정 유전 통로의 morpholino (MO) 최저 허용 합니다. 중요 한 것은, 그것은 또한 조만 초기 척추 개발 하는 동안 발생 하는 단계의 연구 수 있습니다.

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

건강의 국가 학회에 의해 제공 된 자금 (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S.에), 생명 공학에서 연구 및 교육을 위한 캘리포니아 주립 대학 프로그램 (CSUPERB: D.L.S. 척추 조 혈 틈새의 분자 제어) 캘리포니아 주립 대학 치 코 (A.C.B.) 하에서 대학원 사무실에서.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Iscove의 MDM StemCell Technologies에 함유된 소 혈청 알부민 10% 9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+Life Technologies14080-055
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Life Sciencessh30256.01
  DMEM 500 mL코닝 셀그로우10-017-CV&
nbsp; Ham's F12 500 mLCorning CellGrow10-080-CV
FBS 500 mLGemini Bio-Products100-108
HEPES 100 mL (1 M)Gibco life technologies15-630-080
페니실린/스트렙토마이신(5000 U/mL
및 5000 mg/mL) with L-글루타민(200 mM)		Corning Mediatech30-009-CI
겐타마이신 설페이트 10 mL (50 mg/mL)코닝 Mediatech30-005-CR
1.5mL MCF 튜브FisherBrand05-408-129
3mL 23gx1 주사 바늘(Luer Lock 포함BD Safety Glide305905
5mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브(셀 스트레이너 캡 포함Corning Falcon
Methocel MCSigma-Aldrich64630
14mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브코닝 팔콘352057
10mm 폴리스티렌 easygrip 페트리 접시Corning Falcon351008
Librease TMRoche Sigma-Aldrich5401119001해리 프로테아제
PronaseRoche Sigma-Aldrich11459643001dechorionation 프로테아제
15cm 페트리 접시Corning Falcon351058
AB제브라피쉬 국제자원센터(ZIRC)ZL1제브라피쉬 균주 사용
디티올트레이톨(DTT)시그마-알드리치646563
) ) 352235

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