조 혈 줄기와 뿌리를 Quantitate를 생체 외에서 시험의 개발 세포 (HSPCs) Zebrafish 태아를 개발

요약

여기, 우리는 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs) 배아 zebrafish quantitate 간단한 방법을 제시. 천연된 제 브라에서 HSPCs는 지원 요소, 성숙한 혈액으로 차별화와 스에 도금. 혈액의 검출 결함 및 심사 실시 쉽게 마약을 수 수 있습니다.

초록

조는 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs) 성숙한 혈액을 구성 하는 다른 세포 계보의 무리로 분화 하는 필수적인 세포 프로세스입니다. 격리 및 식별이이 HSPCs의 어렵습니다 때문에 정의 된 전 게시물 사실상; 그들은 특정 세포 계보에 그들의 감 별 법 후만 정의할 수 있습니다. 지난 몇 년간 제 브라 (Danio rerio) 조 연구에 모델 생물 되고있다. Zebrafish 태아 utero 전, 개발 하 고 48 h 후 수정 (hpf)에 의해 확실 한 HSPCs. 분석 HSPC 차별화를 평가 하기 위해 생성 된 이식 활용 확산 기능 개발 된 이후 confocal 현미경 검사 법으로 특수 유전자 변형 라인 시각화 뿐만 아니라 조 혈 시스템의 재구성. 그러나, 이러한 분석 비용 금지, 기술적으로, 어렵고 많은 실험실에 대 한 시간이 소모 되는. HSPCs를 평가 하기 위해 생체 외에서 모델의 개발 비용 효과적이 고, 빨리, 그리고 이전에 비해 적은 어려움 설명 방법, 신속 하 게 HSPC 생물학에 영향을 주는 mutagenesis와 약 스크린을 평가 하기 위해 실험실을 수 있도록. 이 소설 체 외에서 분석 결과 HSPCs를 평가 하는 도금 해리 전체 zebrafish 태아 및 HSPC 차별화 및 확산 촉진 추가 외 인 요인에 의해 수행 됩니다. 배아는 단일 세포로 해리 하 고 단일 조상 세포에서 발생 하는 콜로 니 형성 단위 (CFUs)을 생성 하는 그들을 원인이 HSPC 지원 식민지 자극 요인으로 도금. 이 분석 실험 분자 통로의 더 주의 깊은 검사 HSPC 확산, 차별화, 및 그것의 dysregulation 척추 조의 토대를 이해 하는 연구자 수 있도록 규칙에 대 한 책임을 허용 해야 동안에 질병.

서론

조는 다양 한 생명체의 생존에 필요한 성숙한 혈액 세포를 만드는 과정입니다. 성숙한 혈액을 구성 하는 발달 제한 된 세포 유형의 다양 한으로 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 분화에 관련 된 주요 발달 과정 이다. 이러한 HSCs 시스템은 결코 소진 하 고 그들은 죽을 때까지 초기 배아 개발에서 유지 해야 갱신 자가 해야 합니다. 척추 동물, 지속적인 차별화 및 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs)의 확산 하는 데 필요한 포스트 mitotic 혈액 세포의 대부분을 보충 적절 하 게 매일 재활용 되 고. HSCs 제한 조상 세포;의 하위 집합에 첫 번째 차별화 하 여 성숙한 혈액 세포 생성 일반적인 림프 창시자 (CLPs)¹, 결국 T, B, NK 세포를 생산, 그리고 granulocytes, 적혈구, macrophages, 및 없으며 생성 하는 일반적인 골수성 창시자 (CMPs)² . 이러한 창시자 특정 세포 계보를 생성 하는 최선을 다하고 있습니다 및 추가 골수성 erythroid 창시자 (Mep) 적혈구와 혈소판, 또는 granulocyte 생성 하는 등 더 발달 제한 조상 세포로 분화 대 식 세포 창시자 (GMPs) basophils, 호 산 구는 고 대 식 세포, 호 중구,

프로토콜

캘리포니아 주립 대학, 치 코, 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 자문 위원회는 모든 방법을 아래에 설명 된 승인.

1. 블리치 48 hpf Zebrafish 태아

1. 와 함께 15 cm (w) x 15 c m (l) x 7 cm (h) 플라스틱 용기 3 세척 스테이션 만들기: 1) 1000 mL 배아 매체 (E3, 표 1참조) 표 백제 5%의 1 mL, 2)와 함께 살 균 E3와 함께 3) 살 균 E3. 각 컨테이너에 배아 잠수함 솔루션의 500 mL 있는지 확인 하십시오.
   참고: 테스트 각 조건에 대해 적어도 10 배아 필요할 것 이다. 이 세척 절차는 최대 200 배아를 수용할 수 있습니다.
2. 전송 피 펫과 배아 차 여과기에 놓고 5 분 (내부 배아)와 차 여과기를 제거 하 고 세척 역 5 분;에 대 한 # 2에 대 한 세척 역 # 1에에서 계란을 잠수함 마지막 5 분 동안 세척 역 # 3를 반복 합니다.
3. 마지막 세척 후 깨끗 한 10 cm 배양 접시에 거꾸로 그것을 선회 하 고 부드럽게 배아를 rinsing 하 여 차 여과기에서 린스 배아에서 살 균 e 3와 차 여과기 및 전송 피 펫.

결과

배아 zebrafish에 HSPC 숫자를 평가 하기 위해 48 hpf 배아 소화, exogenous 지원 조 혈 성장 인자, 스에 도금 되었고 7 일 (그림 1A)에 대 한 인 큐베이 팅. 7 일 후, 콜로 니 형성 단위 (CFUs) 열거 (그림 1B)과 이미지 (그림 1C) 했다. 제어 함으로써 추가 다른 cytokines, 한 식민지 생산의 종류를 제어할 수 있습니다: Epo erythroid 차별 화를 위한 필요는 및 Gcsf는 골수성 차별화 필요. 혈 청 잉어는 태아 둔감 한 혈 청의 사용 포유류 조직 문화; 그것은 일반적인 성장 요인의 소스입니다. 그림 1, E.......

토론

Zebrafish 모델 시스템은 원시적이 고 확실 한 척추 조 공부, 효과적, 효율적이 고 저렴 한 모델이 되었다. 빠르고, 저렴 한, 그리고 몇 가지 기술적인 어려움을 제시 하는 분석 실험의 세대는 작은 분자를 테스트, 돌연변이 배아를 분석 하 고 분자 경로 HSPC 생물학에 대 한 중요 한 elucidating 활용할 수 있습니다. 생체 외에서 도금 HSPCs의 성인 제 브라에서 mutagenesis, cytokines, 그리고 조 혈 결함을 공부 하는 효과적인 방법입니다. 이 프로토콜은 그 연구를 구축 하지만 배아 zebrafish를 활용 하 여. 배아 zebrafish에 이러한 분석을 적용 빠른 데이터 수집, 적은 물리적 공간, (마약), 스크린에 대 한 더 적은 약물의 사용의 사용과 테스트 mRNA overexpression 또는 특정 유전 통로의 morpholino (MO) 최저 허용 합니다. 중요 한 것은, 그것은 또한 조만 초기 척추 개발 하는 동안 발생 하는 단계의 연구 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Iscove의 MDM StemCell Technologies에 함유된 소 혈청 알부민 10%		9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+	Life Technologies	14080-055
HyClone PBS (1x)	GE Healthcare Life Sciences	sh30256.01
DMEM 500 mL	코닝 셀그로우	10-017-CV&
nbsp; Ham's F12 500 mL	Corning CellGrow	10-080-CV
FBS 500 mL	Gemini Bio-Products	100-108
HEPES 100 mL (1 M)	Gibco life technologies	15-630-080
페니실린/스트렙토마이신(5000 U/mL 및 5000 mg/mL) with L-글루타민(200 mM)	Corning Mediatech	30-009-CI
겐타마이신 설페이트 10 mL (50 mg/mL)	코닝 Mediatech	30-005-CR
1.5mL MCF 튜브	FisherBrand	05-408-129
3mL 23gx1 주사 바늘(Luer Lock 포함	BD Safety Glide	305905
5mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브(셀 스트레이너 캡 포함	Corning Falcon
Methocel MC	Sigma-Aldrich	64630
14mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브	코닝 팔콘	352057
10mm 폴리스티렌 easygrip 페트리 접시	Corning Falcon	351008
Librease TM	Roche Sigma-Aldrich	5401119001	해리 프로테아제
Pronase	Roche Sigma-Aldrich	11459643001	dechorionation 프로테아제
15cm 페트리 접시	Corning Falcon	351058
AB	제브라피쉬 국제자원센터(ZIRC)	ZL1	제브라피쉬 균주 사용
디티올트레이톨(DTT)	시그마-알드리치	646563