바이오-레이어 간섭계 분석 결과 의해 작은 분자와 이온 채널 단백질의 상호 작용 활동을 캡처

요약

여기에 프로토콜 작은 분자 지질 ligand phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍₂)을 정제 hEAG1 이온 채널 단백질의 상호 작용을 설명합니다. 측정 씨 소설 작은 분자 이온 채널 ligand 심사에 대 한 잠재적인 방법이 될 수 보여 줍니다.

초록

바이오-레이어 간섭계 (BLI) 분석 결과 단백질-단백질 및 단백질 작은 분자 상호 작용을 측정 하기 위한 유용한 도구입니다. 여기, 우리가 먼저 인간 EAG1의 상호 작용을 공부 하이 소설 레이블 없는 기술의 응용 프로그램 설명 (hEAG1) 채널 단백질 작은 분자 핍₂. hEAG1 채널 암 및 신경 질환의 어떤 종류에 관련 된 몇 가지 이득의 기능 돌연변이 탈 선 overexpression 때문에 잠재적인 치료 표적으로 인식 하고있다. 우리는 포유류 안정적인 식 시스템에서 hEAG1 채널 단백질을 순화 하 고 씨에 의해 핍₂ 와 상호 작용을 측정. HEAG1 단백질 및 PIP₂ 간의 바인딩의 활동의 성공 측정 씨 분석 결과 이온 채널 약리학에 소설 작은 분자 ligand 심사에 사용 되는 잠재적인 높은 처리량 접근 방식을 보여 줍니다.

서론

타겟팅 작은 분자와 세포 표면 수 이온 채널 단백질 ligand 심사 및 생물 학적 약물 발견^1,2,3에 대 한 엄청난 잠재력을 제공 합니다. 따라서, 적절 한 도구 이온 채널 및 작은 분자와 그들의 해당 기능 간의 상호 작용을 공부 하 고 필요 합니다. 패치 클램프 기록 이온 채널의 기능 분석 결과에 독특하고 대신할 기술 될 입증 되었습니다. 그러나, 다른 기술을 요구 작은 분자 이온 채널을 직접 대상 여부 결정. 전통적으로, 방사성 ligand 바인딩 분석 결과 바인딩 사이의 작은 분자 및 그 대상 이온 채널 단백질의 활동을 관찰 하기 위해 사용 되었다. 그러나,이 기술의 사용 제한 됩니다 자사의 요구 사항으로 인해 방사성 라벨 및 탐지에. 또한, 연구에 작은 ligand를 필수 단계 알려진된 특정 ligand 없이 이온 채널의 많은 종류에서는 사용 하 여 방지할 수 있습니다. 일부 레이블 없는 기법 NMR 분광학, 엑스레이 회절, 미 thermophoresis (MST)⁴ 및 표면 플라스몬 공명 (SPR) 등 단백질 작은 분자 상호 작용을 측정 하기 위해 사용 되었습니다. 하지만 이러한 유형의 분석 실험 일반적으로 전체 길이 단백질, 역학, 낮은 처리량 및 높은 비용⁵의 낮은 해상도 얻을 하는 데 어려움 때문에 충분 한 정보를 제공할 수 없습니다. 이러한 기술을 달리 바이오-레이어 간섭계 (BLI)의 표면에 단백질 샘플의 작은 금액을 immobilizing 여 단백질 작은 분자 상호 작용 검출을 위한 이러한 단점을 극복 하기 위해 새로운 레이블 없는 방법론으로 나오고 있다 바이오 센서와 광학 변경 측정 신호^6,7. 유망한 바이오 센서 플랫폼으로 라스 기술은 이미 인간 단일 클론 항 체 CR8020⁸ 등 수용 성 단백질 자연 물으로 작은 분자의 상호 작용을 관찰 하 수행 되 고 상세한 분석 결과 절차에 보고 되었습니다는 이전 기사⁹. 새로운 치료 목표 발견을 위한 이온 채널 단백질의 중요 한 역할을 인정 하지만 이온 채널 단백질 작은 분자 상호 작용 분석 결과 라스에 기반 하지 설명 하고있다.

인간 에테르 일품- 채널 (hEAG1) 다양 한 종류의 암 세포와는 채널 a 잠재적인 치료 타겟이 많은 암과 신경 장애^{10,11의 중앙 신경 조직 표현 12,,1314}. 우리 실험실에서 electrophysiological 연구 phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍₂) hEAG1 채널¹⁵의 억제 효과 확인 했습니다. 직접 씨 기술을 사용 하 여 hEAG1와의 상호 작용 특히 특정 ligands를 부족 그 채널에 대 한 이온 채널 단백질 작은 분자 화합물 상호 작용의 다른 유형에 대 한 모델 수 핍₂ 테스트, 우리의 결과에 따라. 씨 분석 결과의 지침에 따라 우리는 hEAG1 단백질 biotinylated를 준비 하 고 그들을 움직일 streptavidin (SA)의 표면에 바이오 센서 팁 다음 상호 작용 그들 핍₂ 솔루션 사이의 직접 바인딩을 관찰 하는 단백질 그리고 지질은. 핍₂ 의 첨부 hEAG1 단백질 코팅된 표면, 표면에 층의 두께를 증가, 후는 직접 스펙트럼 변화를 연결 하 고 실시간¹⁶에서 측정 될 수 있다. 바인딩 활동 협회 단계에서 긍정적인 변화 및 부정적인 변화 분리 단계에서 확인할 수 있습니다. 이 원리에 따르면 우리는 HEK 239T 안정 식 시스템에서 기능 hEAG1 이온 채널 단백질을 정화 하는 상태를 유지 하는 생체 외에서 기능, 친 화력 정화 방법을 사용 하 여 다음의 바인딩의 활동을 측정 다른 농도₂, 핍 고 electrophysiological 측정¹⁵에 관측 된 semblable 운동 데이터를 굴복. 씨에서 결과 및 electrophysiological 측정 사이 가까운 통신 처음으로 이온 채널 막 단백질 작은 분자 상호 작용에 대 한 적절 한 분석 도구로 서 씨의 적합성을 보여 줍니다.

프로토콜

참고: 지속적으로 플래그 태그 hEAG1 채널 단백질 표현 HEK 293T 세포 라인 transfecting pCDH lentiviral 플라스 미드 HEK 293T 세포 다음으로 원심 C-말단에 플래그 hEAG1의 DNA 순서를 포함 하 여 구성 되어 있는 puromycin 저항 선택 이전¹⁵를 설명합니다.

1. 친 화력 정화 HEK 293T 세포에서 hEAG1 채널 단백질 플래그 태그의

1. 셀을 안정적으로 표현 hEAG1 채널 액체 질소에서 따뜻한 물 (37 ° C)에 신속 하 게 녹여 10 cm 접시에 셀 (약 5 x 10⁶ 세포 냉동) 씨. 셀 성장 Dulbecco의 수정이 글의 (DMEM)에서 하룻밤 매체 8 mL 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 단위/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스, 4 mM L-글루타민 보충 하 고 다음 날 매체를 변경.
2. 형광 현미경을 사용 하 여 셀의 높은 비율을 안정적으로 표현 hEAG1 채널 자란 시스템 다는 것을 확인 하 여 이러한 HEK 293T 세포의 GFP 형광을 확인 하십시오. 기 하 급수적으로 성장 셀 0.25 %trypsin 실내 온도 thenadd의 혈 청에 포함 된 문화 소화 종료 2 mL에 1 분의 1 mL을 trypsinize. 포함 하는 완전 한 DMEM 매체의 15 mL 15 cm 접시에 세포 현 탁 액의 400 μ를 전송 합니다. 총에서 4 개의 15 cm 요리를 준비 합니다.
3. 후 2-3 일 문화 셀 약 90%에 도달 하면 이러한 셀을 수확 confluency.
   1. 세포에서 성장 매체를 제거 하 고 염 분의 인산 염 버퍼 4 mL로 두 번 그들을 씻어 (1 x PBS, pH = 7.4).
   2. 세척 후 PBS를 버리십시오.
   3. 셀 및 전송 1 mL와 긁힌 것된 셀 15 mL 튜브에 플라스틱을 사용 하 여 각 요리에 대 한 2 mL 1 x PBS로 세포를 다쳤어요.
   4. 420 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 세포 현 탁 액을 원심
   5. 가만히 따르다와 삭제는 상쾌한.
   6. 세포의 용 해 버퍼 (10 mM HEPES, 1.5 m m MgCl₂, 10 m m NaCl, 1 %NP-40, pH 7.0, 포함 된 완전 한 protease 억제제)의 총 4 mL에 셀 펠 릿 얼음과 소용돌이 철저 하 게는 lysate 모든 10 분에 30 분 동안 resuspend.
   7. 세포 lysate 4 ° c.에 12000 x g에서 10 분 원심
   8. 5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 즉각적인 사용을 위해 얼음에 그것을 유지.
4. 반대로 플래그 M2 선호도 수 지를 준비 합니다.
   1. 철저 하 게 반대로 플래그 M2 선호도 젤의 병은 젤 구슬의 통일 정지 되도록 부드러운 반전에 의해 수 지 (저장소 버퍼에서 50% 서 스 펜 션으로 제공)를 일시 중단 합니다.
   2. 즉시 냉장된 1.5 mL 튜브에 서 스 펜 션의 400 μ를 전송.
   3. 30 s 8, 000 x g 4 ° C에 대 한 현 탁 액을 원심 하 고 신중 하 게를 저장소 버퍼 상쾌한 삭제.
   4. 수 지에 500 μ 1 x PBS를 추가 하 고 1 mL 피 펫으로 펠 릿을 일시 중단 합니다. 다음 30 s 8, 000 x g 4 ° C에 대 한 현 탁 액을 원심 하 고 표면에 뜨는 PBS를 신중 하 게 삭제. 이러한 반복 세척 단계 저장 된 버퍼를.
5. 500 μ 단백질 추출 상쾌한 준비 단계 1.3.8 펠 릿을 일시 중단 하 고 새로운 냉장된 5 mL 튜브에 정지를 전송 하는 수 지 펠 릿을 추가 합니다. 다시 왼쪽 아니 젤 구슬 있는지 확인 하려면이 단계를 반복 합니다. 왼쪽된 단백질 추출 혼합물에 추가 합니다.
6. 캡처 플래그 융해 단백질을 4 ° C에서 8 rpm에서 통에 하룻밤 혼합물을 품 어.
7. 1에서 10 분, 4 ° c.에 000 x g 12 h 배양 후 혼합물을 원심
8. 삭제는 상쾌한 고 세 번 1 x PBS의 500 μ와 펠 릿을 세척. 즉각적인 사용을 위해 얼음에 그것을 유지.
9. 차입 플래그 hEAG1 단백질 펩 티 드 기 x 3.
   1. 3 X 플래그 차입 솔루션을 준비 합니다. 500 μ 재고 솔루션에서 3 X 플래그 펩타이드 분해 (0.5 M Tris HCl, 1 M NaCl, pH = 7.5) 8 μ g/μ의 농도에.
   2. 200 ng/μ 최종 농도 솔루션 PBS의 390 μ를 플래그 차입 솔루션 x 10 μ 3를 추가 합니다.
   3. 단계 1.8에서 젤 구슬에 3 x 플래그 차입 솔루션의 400 μ를 추가 합니다.
   4. 2 h 4 ° c.에 대 한 8 rpm에서 통에 샘플을 품 어
   5. 30 수 지 원심 s 8, 000 x g.
   6. 신선한 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 즉각적인 사용을 위해 4 ° C에서 그것을 저장.

2. 농도 분석 결과 및 정화 플래그 확인 퓨전 hEAG1 BCA 단백질 분석 실험 키트와 서 부 럽

1. 제조업체의 지침을 따르면 BCA 단백질 분석 실험 키트를 사용 하 여 순화 된 단백질의 농도 결정 합니다.
2. 서쪽 분석 30 μ 샘플을 사용 하 여 확인 앞에서 설명한¹⁵안티 플래그 항 체를 사용 하 여 관심 단백질 정화 했다.

3. 씨 분석 결과 대 한 정화 채널 단백질 비타민 b 복합체와 라벨

1. 5 mg/mL PBS에 biotin 재고 솔루션을 준비 합니다. 각 테스트 (두 바이오 센서), PBS에 순화 된 단백질의 바람직 N 맨끝 biotinylation를 달성 하기 위해 20 μ g 순화 단백질에 biotin의 3 어 금 니 과잉을 추가 합니다.
2. 적어도 30 분 동안 얼음에 어둠 속에서 샘플을 품 어.
3. 샘플 희석 (SD) 버퍼 준비: 0.02% 폴 20 및 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA, pH 7.4)와 PBS.
4. SD 버퍼에 순화 된 채널 단백질의 버퍼를 변경 하는 적용을 수행 합니다. 30 kDa의 분자량 컷오프와 한 장치를 사용 하 여, SD 버퍼를 추가 하 고 12, 000에서 샘플 centrifuging 여 언바운드 biotin 제거 g, 4 ° c.에서 10 분 x
5. 200 μ SD 버퍼 필터 장치에 추가 된 ultrafiltrate 외 장치, 원심 분리기 튜브에서 제거 하 고 centrifuging 12000 x g, 4 ° c.에서 10 분에 샘플 적어도 세 번이이 작업을 반복 합니다.
6. 교환 버퍼 수집 샘플, 반전 삽입 필터 장치 1.5 mL 튜브와 2000 x g, 4 ° c.에 5 분에서 centrifuging 즉각적인 사용을 위해 얼음 샘플을 유지.

4. 분석 결과 대 한 핍₂ 솔루션의 준비

1. 이온된 H₂O의 핍₂ (1mm)의 재고 솔루션을 준비 하 여 앞에서 설명한¹⁷얼음에 30 분 동안 sonicating. -20 ° C에서 유리 튜브에서 솔루션을 저장 하 고 활발 한 vortexing에 의해 실험 직전 최종 농도에 희석.

5. 라스 분석 결과

1. 장비를 켜고 하 기계 BLI 연구 하기 전에 30 분 이상 장비를 prewarm를 "준비" 상태에서 "악기 상태" 창을 확인 하십시오.
2. 데이터 수집 소프트웨어를 열기 전에 악기의 문이 닫혀 있는지 확인 하 고 실험 마법사에서 "새로운 동역학 실험"을 선택 합니다.
3. 96 잘 접시에 버퍼, 부하, 및 샘플 선택 마우스 오른쪽 클릭 하 여 사용할 수 우물을 정의 합니다. 샘플 우물로 biotinylated 플래그 퓨전 hEAG1 단백질의 농도의 단위를 입력 모 랄 (10 μ g, 0.09 μ M).
4. 기준선, 로드, 협회와 분리를 포함 분석 결과 단계를 정의 합니다. 시험 단계를 선택 하 고 해당 열을 두 번 클릭. 분석 결과 정의의 중복 컨트롤 센서에 대 한 설정 됩니다. 1000 rpm을 설정 합니다. 초기 계획 단계에 대 일 분 및 로드, 협회, 및 분리, 5-10 분을 각각 선택 합니다. 실내 온도 (약 24 ° C)에서 테스트를 수행 합니다.
   참고: 두 가지 주요 절차: biotinylated 채널 단백질 센서를 로드 하 고 작은 분자 화합물과 상호 작용 시 금. 그들은 지속적으로 진행 될 수 있다 (초기 계획, 로드, 기준선, 협회 및 분리). 또는, 그들은 첫 번째 로드 부품 실패 때 시험 화합물을 낭비 하지 않도록 별도로 진행 될 수 있습니다.
5. 열 센서를 포함 하 고 센서 트레이에 센서의 위치를 나타내기 위해 "채우기"를 클릭 하십시오를 클릭 합니다.
6. 실수에 대 한 확인 하 고 해결 하기 위해 다시가 서 모든 계획된 단계를 검토 합니다.
7. 데이터 파일의 위치를 설정 하 고 "이동" 분석 결과 시작을 클릭 합니다.
   참고: 센서 필요 prewetted SD 버퍼에서 10 분 이상 경우이 단계는, 다음 "실험 시작 지연" 설정을 생략 해야 합니다. 그렇지 않은 경우에 센서를 prewetting 전에 600 s 지연 설정.
8. 용지함의 하단에 검은 96 잘 접시를 넣고 좌석 접시를 쟁반에에 접시의 A1 코너를 삽입. 센서를 로드 웰 스에 대 한 분석 결과 버퍼 잘 당 200 μ 행 A 2 우물과 2 행 B 96 잘 접시의 우물에 추가 합니다.
9. 샘플 접시로 또 다른 검은 96 잘 접시를 준비 하 고 제어 또는 biotinylated hEAG1 단백질 해결책 (10 μ g) A 단계 5.3에서에서 프로그래밍 하는 동안 지정 된 행에서으로 행 B 200 μ SD 버퍼에 채울 우물.
   참고: 거품을 소개 하지 마십시오.
10. 악기의 문을 열고 센서 트레이 삽입 하 고 왼쪽 및 오른쪽 접시 홀더에 접시를 각각 샘플. 센서 트레이 및 샘플 플레이트 위치는 왼쪽된 접시 홀더 및 홀더 오른쪽 접시의 오른쪽 상단 모서리에 "A1" 마커의 모양에 따라 올바르게 확인 합니다. 문을 닫고 분석 결과 시작 합니다.

6. 데이터 분석

1. 데이터 분석 소프트웨어를 열고 분석 결과 데이터를 포함 하는 폴더를 로드 합니다. 처리 메뉴 인터페이스에 "처리"를 클릭 하 고 우리는 화려한 원시 운동 곡선을 볼 수 있습니다.
2. 1 단계에서: "데이터 선택", "센서 선택"을 클릭 합니다. 에 "센서 트레이 #1", SD 버퍼와 접촉만 센서 우물을 클릭 하 고 오른쪽 "참조 센서" "센서 유형 변경"을 클릭. 에 ' 샘플 접시 지도 ", 지정 하는 모든 일반적인 바인딩 우물 마우스 오른쪽을 클릭 하 여" 잘 유형 변경 "" 잘 참조 "를.
3. "빼기" 단계 2의 전에 상자에서 똑 딱 거리 십시오 하 고 "이중 참조"를 가리킵니다.
4. 3 단계에서에서: "Y 축 정렬", 정렬 단계 "기준"을 선택 합니다. "시간 범위"에 대 한 마지막 10 입력 기준선의 s (즉, 에서: 0.1: 59.8).
5. 4 단계에서에서: "간 단계 보정", 선택 "정렬 기준" 연결 및 분리 단계 사이 신호 변화를 최소화 하기 위해.
6. 5 단계에서에서: "프로세스", 대부분의 경우에서 Savitzky Golay 필터링 함수를 선택 하 고 "프로세스 데이터"를 진행.
7. 7 단계에서에서 다른 소프트웨어를 사용 하 여 추가 데이터 분석에 대 한 원시 데이터를 저장: "결과 저장".
8. 클릭 "분석 | 커브 피팅 "입니다.
   1. "단계 분석", 선택 "협회 | 분리 "입니다. "모델"에 대 한 1: 1을 선택 합니다.
      참고: 우리 때문에 우리의 원래 데이터에 잘 장착 하 고 피팅 아래에 가능성을 피할 수 1:1 모델 선택 1:2 또는 2:1 모델 그들의 높은 자유 때문. 하지만 다른 옵션 사용할 수 있습니다 여기 하 고 적당 한 다른 바인딩 모델 분석의 다른 피팅 분석을 위해 선택 될 수 있다.
   2. "맞춤"에 대 한 글로벌 (전체)을 선택 합니다. "Group By"에 "색상"을 선택 합니다. "Rmax 않은 여 센서" 최대한 신호 응답 (Rmax)의 독립적인 피팅 수 있도록 선택 합니다.
   3. "맞춤된 곡선!"를 클릭 하 여 비선형 회귀 분석을 시작 하. 힐 방정식 그리고 단일 지 수 함수는 우리의 연구에 사용 되었다.
   4. 클릭 "데이터 내보내기 | 보고서를 저장"결과 피팅 하기. 클릭 또는 "데이터 내보내기 | 피팅 결과 내보내기"다른 소프트웨어와 함께 더 그래프 및 데이터 분석에 대 한 원시 데이터를 저장 하려면.

결과

우리는 HEK 293T 세포 안정적 overexpressed hEAG1에서 플래그 퓨전 hEAG1 채널 단백질 정화. 이 융해 단백질의 기능 패치 클램프 메서드를 사용 하 여 입증 되었습니다 하 고 품질 및 순화 된 단백질의 특이성 서쪽 오 점 (그림 1)에 의해 확인 된다. 순화 채널 단백질 실시간 씨 분석 결과 사용 하 여 지질 (핍₂)와 함께 상호 작용 분석을 수행 하는 biotinylated입니다. BLI 바인딩 분석 결과 구성은 그림 2에 표시 됩니다. HEAG1와 핍₂ 사이 일반적인 바인딩 곡선 그림 3에 표시 됩니다. 이 경우에, 3 μ M 핍₂ PBS 버퍼 (핍₂ 의 구성 부가 그림 1에 표...

토론

막 이온 채널의 다양 한 심장 혈관 및 신경 질환¹⁸를 포함 하 여 인간의 질병 치료에 대 한 현재 알려진된 약물의 13%의 주 치료 대상으로 확인 되었습니다. 패치 클램프 기록, 작은 분자와 이온 채널의 기능을 측정 하기 위한 황금 표준 널리 사용 되었습니다 이온 채널 ligands 심사에 대 한. 그러나, 이러한 electrophysiological 접근 수 없습니다 입증 여부 작은 분자 바인딩합니다 직접 채널 또는 하지¹⁹작은 분자는 다른 단백질 또는 채널 상호 작용 하는 세포 경로에 행동할 수 있기 때문에. 널리 이용 되는 방사성 ligand 바인딩 분석 결과 및 기타 일반적으로 사용 되 레이블 없는 바이오 센서 방법에 비해, 라스는 상대 간단한 배열, 무제한 협회 위상, 가까이에 분석 결과 디자인을 통해 높은 중요 한 이점이 있다 vivo에서 시스템 및 고정된 단백질 (몇 μ g), 그리고 그것의 작은 금액의 필요 운동 데이터

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/High Glucose Medium	HyClone	SH30243.01
Buffered Saline (1x)	HyClone	SH30256.01
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270
Penicillin/Streptomycin	Gibco	1697550
Cell Culture Dish	Corning	430599	150 mm x 25 mm
Nonidet P-40 대체품	Amresco	E109
염화나트륨	BBI 생명 과학	A610476
염화칼	BBI 생명 과학	A610440
소 혈청 알부민	BBI 생명 과학	A600332
폴리옥시에틸렌-20-소르비탄 모노라우레이트	BBI 생명 과학	A600560
ANTI-FLAG M2 친화력 젤	시그마	A2220
3x FLAG 펩타이드	시그마	F4799
옥텟-RED96	Pall/Forté Bio	30-5048
데이터 수집 소프트웨어	Pall/Forté Bio	버전 7.1
데이터 분석 소프트웨어	Pall/Forté 바이오	버전 7.1
바이오센서/스트렙타비딘	폴/포트&에아큐트; Bio	18-5019
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209
Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin	ThermoFisher	21338
원심 분리기	ThermoFisher	75004250
PageRuler Prestained Protein Ladder	ThermoScientific	318120
한외여과 장치	MILLIPORE	UFC503008	30 kDa
포스파티딜이노시톨 4, 5-비스포스페이트(PIP2)	Sigma	P9763
Monoclonal ANTI-FLAG M2 항체	Sigma	F1804	1:2000 희석
염소 안티 마우스 HRP 접합 2차 항체	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	1:5000 희석
Enhanced BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0010
프로테아제 억제제 칵테일 정제	Roche	04693159001
Amersham Imager 600 이미징 시스템	GE Healthcare Bio-Sciences
웨스턴 블롯 시스템	BIO-RAD