Cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화

요약

이 보고서 또는 사전 증폭 없이 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 이해를 제공 하 고 다른 연구 나 실험실에서 해당 데이터의 질적 평가 허용 한다.

초록

실시간 정량 Pcr 개별 대상 miRNAs 평가 하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. MiRNAs 수준 일반적으로 참조 샘플을 기준으로 측정 됩니다. 이 방법은 조사 대상 유전자 식 수준에 생리 적 변화에 대 한 적절 한입니다. 그러나, 더 나은 통계 분석을 사용 하 여 절대 정량화 유전자 식 레벨의 포괄적인 평가 위해 바람직합니다. 절대 부 량은 여전히 공통 사용 하지. 이 보고서 또는 사전 증폭 없이 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

EDTA 플라스마의 고정된 볼륨 (200 µ L) 의식 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 수집 된 혈액에서 준비 되었다 (n = 50). 총 RNA는 상업적으로 사용 가능한 시스템을 사용 하 여 추출 되었다. 플라즈마 miRNAs는 프로브 기반 실시간 정량 Pcr 분석 실험 미르 관련 앞으로 또는 반전 PCR 뇌관 및 프로브를 포함 하 여 정량 했다. 절대 정량화에 대 한 표준 곡선 상용 합성 RNA oligonucleotides를 사용 하 여 생성 되었다. 합성 cel-미르-238 표준화 및 품질 평가 대 한 외부 제어로 사용 되었다. MiRNAs는 정량화 35 위 주기 (Cq) 값 정량 단계 전에 미리 증폭 했다.

가운데 8 miRNAs 검사, 미르-122, 미르-133a, 및 미르-192 했다 사전 증폭 없이 감지 미르-1, 미르-206, 그리고 미르-499a 그들의 낮은 식 수준 때문에 사전 확대를 요구 하는 반면. 미르-208a와 미르 208b 했다 감지 전 확대 후에. 샘플 처리 효율 아군된 cel-미르-238의 Cq 값에 의해 평가 되었다. 이 분석 방법에서 기술 변화 3 미만 이기 위하여 견적 되었다 하 고 정량화 (LLOQ)의 하한값은 10² 복사 / µ L, 시험된 miRNAs의 대부분을 위해.

이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 견적을 제공 하 고 다른 연구에서 해당 하는 데이터의 품질 평가 허용 한다. 체액, 사전 증폭 miRNAs의 낮은 수는 저조한의 탐지를 향상 시키기 위해 유용 고려 miRNAs 표현.

서론

연구의 증가 진단 및 암의 예 후에 대 한 생체로 microRNAs (miRNAs)를 탐험 또는 모니터링 및 nonclinical 및 임상 연구^{1,2,3에에서 다른 질병을 감지} . 양이 많은 실시간 반전 녹음 방송 PCR (RT-정량)이이 기술은 microarray⁴ 와 RNA 시퀀싱 플랫폼⁵기반 보다 더 중요 한 있기 때문에 개별 대상 miRNAs, 평가 하는 데 사용 하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 일반적으로, 미르 식⁶의 ΔCq 메서드 사용 하 여 참조 샘플을 기준으로 측정 됩니다. 이 방법은 조사 대상 유전자 식 수준에 생리 적 변화에 대 한 적절 한입니다. 그러나, 순환 miRNAs의 상대 부 량 그들의 소량 때문에 유틸리티를 제한 했다. 또한, 기술 변형 하기가 다른 실험실 사용자 정의 실시간 정량 Pcr 실험 프로토콜 다르게, 일관성에 이르게 하거나 심지어 모순에서 결과 때문에 다른 연구에서 결과 비교 하기 어려운 다른 연구⁷.

....

프로토콜

모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 다이 이치 산 쿄 주식회사에 의해 승인 되었다

1. 샘플 준비

1. EDTA 2 K 포함 된 튜브에 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 혈액 (적어도 0.5 mL)를 수집 합니다.
   참고: 시트르산과 헤 파 린 허용 되지 않습니다 때문에 이러한 응고 억제 이후 PCR^14,15.
2. 즉시 얼음과 컬렉션의 2 시간 이내 플라즈마 격리 프로세스에 수집 된 샘플을 놓습니다.
3. 5 분 동안 4 ° C에서 10000 x g에서 샘플 원심
4. 2 mL microtube, 세포 파편 및 잔여 혈소판을 제거 하 5 분 동안 4 ° C에서 16000 x g에서 원심 분리 뒤에 상쾌한을 전송 합니다.
   참고: 정량화 miRNAs의 혈소판 오염¹⁶에 의해 크게 달라질 수 있습니다.
5. 신선한 2 mL-microtubes에 상쾌한의 200 µ L aliquots를 놓고 사용까지-80 ° C에 저장 합니다.
   참고: 각 샘플의 고정된 볼륨은 사용할 RNA 추출; 따라서,는 약 수의 볼륨....

결과

실시간 정량 Pcr에 의해 분석 결과 miRNA의 워크플로 및 품질 assessment
그림 1 에서 정량¹⁰를 사용 하 여 혈액 샘플 분석 결과 miRNA의 워크플로 보여 줍니다. Cel-미르-238는 외부 컨트롤을 포함 하 여 실험의 품질을 확인할 수 있습니다. 이 RNA 추출 기술 변화를 보여줄 것입니다 및 후속 실시간 정량 Pcr 처리 합니다. 이 연구에서는 50 샘플에서 계산 하는 Cq 값의 평균 ± SD 21.0 ± 0.4 (표 1) 이었다. Cel-미르-238 사전 증폭 단계 때문에 희석 했다, Cq 값 24.2 ± 0.4 (표 1)을 했다. 여기 설명 하는 시험 방법을에서 기술 변화의 정도 Cq 값에 차이에 따라 미만 3 것으로 추정 했다. 변화의 정.......

토론

우리의 포괄적인 평가 개별 샘플 사이 변이의 크기는 매우 다른 miRNAs 테스트 중 명확 하 게 표시 동적 범위의 넓이의 더 엄격한 통계 분석을 제공 합니다. 비록 이러한 유사 체액에 그들의 작은 수량에 기인 수 있습니다, 생물학 변화 뿐만 아니라 기술 변화 반영 하는 이러한 데이터 주목 해야한다. 기술 변화의 대부분은 다른 분석 결과 플랫폼¹⁸에서 사용 되는 외부 제어 (cel-미르-238)의 Cq 값에 의하여 평가 수 있습니다. 이후 미르 분석에 아무 표준된 내부 통제 되었습니다, 기술 변화에 대 한 정보 분석 결과¹⁹의 품질을 결정 하기 위한 분석에 포함 되어야 합니다. 기술 변화 3 미만 이기 위하여 견적 되었다이 보고서에 설명 된 방법에. 다른 연구에 비해 기술 정보 부족으로 인해이 절차에 대 한 품질 수준을 확인할 수는 없습니다, 비록 같은 정보를 포함 하 여 신뢰성 향상에 기여 하 고 간의 호환성 보장 다른 연구입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BD Microtainer tube (K2EDTA)	Becton, Dickinson and Company	365974	채혈용
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL	Eppendorf	0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mL	Eppendorf	0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mL	Eppendorf	0030120094
합성 올리고뉴클레오티드	홋카이도 시스템 과학	-	개별 miRNA (0.2 μ mol, HPLC 등급)
Tris-EDTA 버퍼  (산도 8.0)	Nippon Gene	314-90021	TE 버퍼
버퍼 RPE	QIAGEN-miRNeasy		미니 키트에 포함된 내용
버퍼 RWT	QIAGEN-miRNeasy		미니 키트의 내용물
miRNeasy 미니 키트	QIAGEN	217004
뉴클레아제 프리 워터	QIAGEN	129114
QIAzol 용해 시약	QIAGEN-Contents		in miRNeasy 미니 키트
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA 모방	QIAGEN	219600	ID:MSY0000293, 5 nmol
SC 어댑터	TAIGEN Bioscience Corporation	S0120	RNA 추출용
VacEZor 36 Complete System	TAIGEN Bioscience Corporation	M3610	RNA 추출용
7900HT 고속 실시간 PCR 시스템	Thermo Fisher Scientific Inc.	4351405	Fast 96-Well
Block GeneAmp PCR 시스템 9700	Thermo Fisher Scientific Inc.	9700
마이크로앰프 고속 광학 96웰 반응 플레이트	Thermo Fisher Scientific Inc.
MicroAmp 광학 접착 필름	Thermo Fisher Scientific Inc.
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific Inc.
4444557 TaqMan MicroRNA 어세이(cel-miR-238-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.		4427975 어세이 ID: 000248
TaqMan MicroRNA 어세이(has-miR-122-5p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	분석 ID: 002245
TaqMan MicroRNA 어세이(has-miR-133a-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	어세이 ID: 002246
TaqMan MicroRNA 어세이(has-miR-1-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	어세이 ID: 002222
TaqMan MicroRNA 어세이(has-miR-192-5p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	어세이 ID: 000491
TaqMan MicroRNA 어세이(has-miR-206)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	어세이 ID: 000510
TaqMan MicroRNA 어세이(has-miR-208a-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	분석 ID:
000511 TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-208b-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	분석 ID: 002290
TaqMan MicroRNA 분석(has-miR-499a-5p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	어세이 ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.
TaqMan PreAmp 마스터 믹스 (2×)	써모 피셔 사이언티픽 Inc.
클로로포름	와코 퓨어 케미컬	035-02616
에탄올(99.5)	와코 퓨어 케미컬	057-00456