조 혈 줄기 세포의 작은 숫자에 대 한 프로토콜을 더럽혀 서 부

요약

프로토콜 blotting 표준 서 500 조 혈 줄기 또는 조상 세포로 몇 가지 분석을 위해 최적화 되었다. 최적화 포함 셀 샘플의 처리, 튜브, 사이 전송 제한 및 직접 Laemmli 샘플 버퍼에 세포를 lysing 주의 한다.

초록

조 혈 줄기 세포 (HSCs)는 드문 셀, 오래만 25000 ~ phenotypic 포함 된 마우스 골 수와 함께 다시 채우기 HSCs 용어. 서쪽 더 럽 히 프로토콜 최적화 되었고 HSCs (500-15000 셀)의 작은 숫자의 분석에 적합 합니다. Phenotypic HSCs 정화, 정확 하 게 계산, 고 직접 Laemmli 샘플 버퍼에서 lysed. Lysates 셀의 동등한 숫자를 포함 하는 나트륨 라우릴 황산 염의 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분석 되었다 오 점 준비 하 고 더럽혀 프로토콜 표준 서에 따라 처리. 이 프로토콜, 2000-5000를 사용 하 여 HSCs는 정기적으로 분석 될 수 있다, 그리고 어떤 경우에 데이터는 몇 가지 대부분의 출판물에 20000 ~ 40, 000 셀에 비해 500 셀으로에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜 다른 조 혈 모 세포에 일반적으로 적용 되 고 표준 실험실 절차를 사용 하 여 셀의 작은 숫자의 일상적인 분석을 수 있습니다.

서론

조 혈 줄기 세포 (HSCs)는 모든 혈액 계보를 야기할 수 있는 각자 경신 세포 이다. 그들은 생 화 확 적인 분석을 어려운 렌더링 골 수에서 비교적 드문 셀입니다. 접근 cytometry, 같은 희귀 세포 분석을 위한 적합 한 세포 표면 마커 및 세포내 단백질의 상대적인 양을 측정 하는 데 매우 유용 했습니다. 그러나, 항 체 접근을 사용 하 셀 permeabilization 절차의 사용을 필요로 하는 세포내 단백질의 분석 하 고 모든 세포 표면 epitopes 살아이 절차^1,2. 또한, 다른 단백질 isoforms 또는 분열 제품을 구분 하는 항 체는 종종 cytometry, 사용할 수 없습니다 그리고 그러므로 조사 여전히 의존 서쪽 오 점 특정 유형의 분석.

세포 lysates의 서쪽 오 점 분석은 대부분 실험실에서 일상적인 절차입니다. 세포 세포 표면 분자의 epitopes를 유지 하는 기본 조건에서 순화 될 수 있다 그리고 세포 lysates 수 이후에 준비 하 고 분석 했다. 그러나, 서쪽에 의해 인구 오 점 드문 기본 셀에 단백질의 분석 euthanizing 충분 한 세포를 얻기 위해 동물의 많은 수를 요구할 수 있습니다. 여러 단계로 작은 조정 함으로써, 기존의 서쪽 더 럽 히 프로토콜 HSCs (관심사의 단백질에 따라 500-15000)의 상대적으로 작은 숫자에 단백질을 감지할 수 있었습니다. 조정 포함 셀, 셀 손실 최소화 하기 위해 튜브 사이 세포의 전송을 감소 셀 펠 릿을 신중 하 게 처리를 정확 하 게 계산 하 고 포함 프로테아좀 버퍼 lysing 집중 로드 셀의 정의 수 고 인산 가수분해 효소 억제제입니다. 많은 게시 된 보고서 포함 20000 이상의 HSCs^3,,45,6,7; 얻은 서쪽 오 점 이 간단한 절차는 세포와 실험 동물 4와 40 배 사이 해당 데이터를 생성 하는 데 필요한 수를 줄일 것입니다. 프로토콜은 결과 셀 당 기준 보다는 내부 통제를 정상화 하도록 설계 되었습니다. 내부 컨트롤에 데이터 정규화는 간과 될 수 있는 단백질 수준에서 전반적인 감소의 검색 수 있습니다. 셀 당 기준 표준화의 중요성 유전자 표현 데이터⁸의 분석에 대 한 설명 했다 그리고 동일한 원리 서쪽 오 점 하 여 단백질을 측정에 적용 됩니다. 이 최적화 된 프로토콜은 세포의 작은 숫자를 분석할 필요가 누군가 위해 유용 해야 한다.

프로토콜

모든 절차는 기관 동물 사용 및 관리 지침에 따라 수행 되어야 합니다. 절차 murine 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSCs, HPs)의 분석을 위해 개발 되었다 그러나 다른 세포 인구의 분석을 위해 적응 시킬 수 있다.

1. 교류 Cytometry 절연 Murine HSCs 및 HPs의

1. 문학⁶에 설명 된 대로 murine 골 수 세포를 수확.
   참고: 그림 1 과 그림 2에 표시 하는 데이터에 골 C57BL/6J 쥐에서 수확 했다.
2. 제조업체의 지침에 따라 마우스 리니지 고갈 키트를 사용 하 여 골 수 세포의 계보 소모를 수행 합니다.
3. 설명⁷에 대 한 관심의 세포 표면 마커 항 체와 세포를 품 어. 그림 1 과 그림 2에 나와 실험에서 Sca 1, 키트, Flt3, 및 계보 (Lin) 마커 Mac1, Gr1, CD3e, B220, 그리고 Ter119 항 체 사용 됩니다.
4. 정렬 2000-20000 린^- Sca1⁺⁺ Flt3 키트^- 세포 (HSCs) 또는 Lin^-Sca1^-키트⁺ 셀 (HPs) 0.1 mL의 인산 염을 포함 하는 1.5 mL Eppendorf 관에 버퍼링 2% 태아 소와 염 분 (PBS) 혈 청 (FBS)입니다.
   참고: 그림 1 과 그림 2에 표시 된 데이터에 대 한 셀은 정렬 Flow Cytometer 70 µ M 노즐을 사용 하 여. 최대 컬렉션 볼륨 1.4 mL 이다입니다.

2. 샘플 준비

참고:이 단계는 중요 한. 샘플을 매우 신중 하 게 처리 합니다. 제거는 상쾌한, 될 매우 셀 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 하십시오.

1. 원심 분리기는 1.5 mL 튜브 4 ° C에서 진동 물통 회전자에서 정렬된 셀을 포함, 500 x g 5 셀에서 상쾌한의 약 100 µ L 제외한 모든 분 제거에 대 한 매우 부드럽게 사용 하는 피 펫 20 µ L 피펫으로 팁 작은. 펠 릿을 방해 하지 마십시오.
   1. 샘플 미만 5, 000 셀이 포함 하는 경우 정렬 된 샘플의 총 볼륨은 0.2 mL 미만 전송 셀 먼저 낮은 바인딩 0.2 mL PCR 튜브 원심 분리 하기 전에.
   2. 샘플 포함 된 경우 5, 000 개 미만의 세포 볼륨은 0.2 mL 이상, 5 분, 4 ° C, 500 x g에서 원심 분리기와 셀 아래로 회전 하 고는 상쾌한의 200 µ L를 제외한 모든 제거. 수송과 셀 상쾌한, 나머지 200 µ L에 다시 중단 다음 0.2 mL PCR 튜브에 세포를 전송 하 고 다시 아래로 회전. 두 번째 스핀 후 펠 릿에서 모든 하지만 20-30 µ L을 제거 하 고 다시 셀을 일시 중단.
2. 튜브에서 표면에 뜨는 왼쪽에 셀 resuspend 필요한 경우, 추가 추가 PBS 2 %FBS에서 / PBS (또한 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 사용 하 여 / PBS, 또는 혼자 PBS) 농도 5를 x10⁴ 5 x 10⁵ 셀/mL.
   참고: 셀 계산 사용 cytometry 셀을 일시 중단 하는 데 사용 하는 볼륨을 추정 하 여 수집.
3. 다시 일시 중단 된 셀의 2-5 µ L를 사용 하 여 (제조업체의 지침에 따라) 자동된 셀 카운터 또는 hemocytometer⁹를 사용 하 여 정확한 셀 농도 결정.
4. 다시 일시 중단 된 셀 원하는 새로운 1.5 mL 튜브에 세포 수를 포함 하는 볼륨을 전송. 그림1에서 실험, 2000, 1000, 500 HSCs 또는 HPs 전송 했다. 원하는 셀 수는 서쪽 오 점 하 여 얻은 신호 강도 의존 하 고 경험적으로 결정 됩니다. 20 µ L 또는 100 µ L Eppendorf 피 펫 팁을 사용 하 여 전송을 수행 합니다.
5. 5 분 500 x g, 4 ° C에서 진동 물통 회전자에 셀 원심
6. 재고 솔루션 x 100을 생성 하려면 제조업체의 지침에 따라 DMSO에 프로테아좀과 인산 가수분해 효소 억제제를 분해.
7. 증류수의 상응 하는 금액으로는 제조업체에서 제공 하는 4 x Laemmli 샘플 버퍼를 diluting 하 여 2 x Laemmli 샘플 버퍼를 준비 합니다. 프로테아좀과 인산 가수분해 효소 억제제 2 x Laemmli 샘플 버퍼에 2 x 억제제의 최종 농도를 100 배 재고의 적절 한 금액을 추가 합니다.
   참고: 2 x Laemmli 샘플 버퍼는 사전에 만들 수 있습니다 하지만 프로테아좀 및 인산 가수분해 효소 억제제 다음 단계에 설명 된 대로 2 x Laemmli 샘플 버퍼 (더하기 억제제) 셀 펠 릿에는 세포를 lyse 추가 직전 추가 되어야 합니다.
8. 조심 스럽게 셀 펠 릿에서 그리고 셀 펠 릿으로 튜브에 남아 상쾌한은 상쾌한의 일부를 제거, 2 x Laemmli 샘플 버퍼 플러스 500의 최종 농도 달성 하기 위해 프로테아좀과 인산 가수분해 효소 억제제의 동일한 볼륨 추가 셀/1 x Laemmli 샘플 버퍼에 µ l
   참고: 예를 들어 셀 (단계 2.6) 펠 릿에서 상쾌한의 18 µ L를 제거 해야 centrifuging 후 단계 2.5에서 튜브와 남아 상쾌한의 2 µ L 2000 셀 20 µ L의 전체 볼륨에 전송 하는 경우 추가의 동일한 볼륨 (2 µ L) 1 x Laemmli 샘플 버퍼에 500 세포 / µ L의 최종 농도 달성 하기 위해 Laemmli 샘플 버퍼 x 2.
9. 최대한 빨리 lysate를 생성 하는 펠 릿 resuspend 이 시점에서, 샘플을 즉시 SDS 페이지 젤를 통해 electrophoresed 수 또는 스냅 액체 N₂ 에서 냉동 고 수 미래 사용을 위한-80 ° C에 저장.

3입니다. 전기 이동 법

1. 95 ° C에서 열 블록 또는 끓는 물에 5 분 동안 lysates 열.
2. SDS 페이지 젤 100V에서 표준 프로토콜¹⁰를 사용 하 여 통해 (20000 셀 해당 최대 500에서 포함) lysates의 1-40 µ L를 electrophorese.
   참고: 젤으로 로드 lysate의 볼륨 바람직한 신호를 생성 하는 데 필요한 셀의 수에 의해 결정 되 고 관심, 그리고 항 체의 품질의 단백질의 풍부에 따라 달라 집니다. 그림 1에서 데이터 2000, 1000, 500 셀 등가물 lysate의 획득 했다. 우물의 폭 3 m m에 1.5 m m. 치아 수는 1.5 m m의 범위에 잘려야 한다 상용 빗에서가 위를 사용 하 여 넓은 이빨을 가진.

4. 전송 및 차단

참고: 서쪽 오 점 표준 프로토콜¹¹다음을 수행 합니다. 단계는 간단히 여기에 설명 된:

1. 10 s, 다음 씻어 짧게 막으로 증류수에 대 한 메탄올을 가진 polyvinylidene difluoride (PVDF) 멤브레인을 pretreat.
2. SDS 페이지 젤에서 전송 장치 제조업체에서 제공 하는 설명서의 지침에 따라 막 단백질을 전송.
3. 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)에 PBST의 2 개 mL를 막 차단 전송, 다음 (0.1 %PBS 트윈) 표준 프로토콜¹¹다음 4 ° C에서 하룻밤.

5. 항 체 라벨

1. 공급 업체에서 권장 하는 항 체 희석을 사용 하 여 4 ° C에서 하룻밤 통에 항 체를 막 품 어.
   참고: 재료의 테이블에서 항 체, 우리 HSCs HPs와 해당 항 체 희석에 대 한 확인 한, 표시 됩니다. 항 체 라벨 표준 절차⁸를 사용 하 여 수행 합니다.

6입니다. 감지

1. 씻고 막 3 시간, 실 온에서 PBST에 각 세척에 대 일 분.
2. 실 온에서 1 분에 대 한 향상 된 화학 버퍼의 2 개 mL를 막 품 어. 다음 제조업체의 지침, 또는 autoradiography 필름과 필름 프로세서 이미징 시스템을 사용 하 여 신호를 감지 합니다.

결과

500-2000 순화 HSCs와 HPs에서 대표적인 결과 그림 1 과 그림 2에 표시 됩니다. 그림 1 에서 β-말라 신호에서 몇 가지 500 HSCs로 검출 될 수 있다 고 HPs 한 마우스의 골 수에서 정화. Note는 3.0 m m 우물에 로드 보다 500 HPs에서 훨씬 더 강력한 신호 생산 로드는 lysates 1.5 m m 우물. 그림 2 은 EIF4G의 서쪽 오 점 및 Rps6의 인 산화 (p-Rps6), 둘 다 단백질 번역¹², HSCs의 규칙에 관련 되 고 HPs와 줄기 세포에 의해 자극 없이 (SCF) 생체 외에서요인.

토론

서 부 럽 조직 또는 세포에 특정 단백질 및 신호 통로의 활성화를 탐지 하기 위한 일반적인 기술입니다. 작은 조정에 일반적으로 사용 되는 절차를 도입 하 여 정기적으로 15000 HSCs, 그리고 경우에 따라 몇 가지로 500 HSCs 15 다른 단백질 (자료 테이블)을 감지할 수 있었습니다. The most이 프로토콜의 중요 한 단계는: 1) 정확 하 게 계산 셀, 2) 튜브, 사이 전송의 수를 최소화 및 3) lysing Laemmli 샘플 버퍼와 직접 셀. Lysing Laemmli 샘플 버퍼 셀 펠 릿, 우리는 보다는 제거는 상쾌한의 모든 셀 펠 릿에서 하 고 다시 만약 우리가 대신 튜브에 남아 있는 작은 양의 상쾌한 동등한 추가 Laemmli 샘플 버퍼에서 중단 발견 Laemmli 샘플 버퍼 x 2의 볼륨, 우리 셀 손실을 피할 수 있습니다. 셀 손실의 위험을 감소 또한 centrifuging 진동 물통 회전자에 셀. 트리밍 빗 이빨 잘의 폭을 줄이는 탐지의 감도 향상.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)	피셔 사이언티픽	BP166-500	SDS-PAGE
템 드	피셔 사이언티픽	BP150-20	SDS-PAGE
30 % 아크릴 아미델 비스 솔루션	바이오 라드	1610158	SDS-PAGE
1.5M 트리스 HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS 페이지
1.0M 트리스 HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS 페이지
과황산 암모늄	피셔 사이언티픽	BP179-25	SDS-PAGE
미니 프로티안 3 빗	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
미니 프로티안 테트라 셀	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
전송 시스템	Bio-Rad	1704155EDU	전송
PowerPac HC 전원 공급 장치	Bio-Rad	1645052EDU	전기 영동
이미징 시스템	Bio-Rad	1708195	신호 감지
4x Laemmli 샘플 버퍼	Bio-Rad	1610747EDU	샘플 준비
10x Tris/Glycine/SDS 전기영동 버퍼	Bio-Rad	1610732EDU	전기영동
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	샘플 준비
RTA Mini PVDF 전송 키트, 40인용 블롯	Bio-Rad	1704272	전달
프로테아제 억제제 칵테일 시	그마	11697498001	시료 준비
인산가수분해효소 억제제 칵테일	골드 생명공학	GB-450-1	시료 준비
EIF4G	세포 신호 전달	2469	WB 항체, 1000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): 그림2
p-Rps6	세포 신호	4858	WB 항체, 1000 세포에서 검증 항체 농도: 1:1000 참조(그림): Fig2
actin(HRP conjugated)	abcam	ab49900	WB 항체, 500개 세포에서 검증 항체 농도: 1:5000 참조(그림): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (그림 5)
S6	세포 신호 전달	2317	WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (그림 4)
4EBP1	세포 신호	9644	WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (Fig4)
HSP90	세포 신호	4877	WB 항체, 15000 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB 항체, 15000 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:1000 참조(그림): ref5 (FigS1)
actin	Santa Cruz	sc-47778	WB 항체, 15000개 세포에서 검증됨 항체 농도: 1:3000 참조(그림): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (마우스)	Miltenyi Biotec	130-090-858	조혈 줄기 및 전구 세포 정제
LS 컬럼	Miltenyi Biotec	130-041-305	조혈 줄기 및 전구 세포 정제
SCF	PeproTech	250-03	인산화 자극
APC-Cy7 c-kit 항체	ThermoFisher	A15423	세포 분류
항 B220	ThermoFisher	48-0452-82	세포 분류
안티-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	세포 분류
안티-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	셀 분류
안티-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	셀 분류
안티-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	셀 분류
스페이서 플레이트, 1.0 mm 통합 스페이서	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	막 차단
세럼	Atlanta Biologicals	A12450	중간 보충제
세포 계수기	Invitrogen	AMQAF1000	세포 계수
	ThermoFisher	S17040	세포 계수
플림	Denville Scientific	E3012	신호 감지
의료용 필름 프로세서	Konica	SRC-101A	신호
감지 Supersignal West Femto 최대 감도 기판	Therom Scientific	34096	신호 감지
Allegra X-15R 원심분리기(로터 SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	샘플 준비
BLUEstain protein ladder	Gold Biotechnology	P007-500	전기영동
세포 분류기	BD	FACSAria II	시료 준비
Incublock	Denville Scientific	I0510	전기영동