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방법 논문

대 식 세포 융합 연구 품질 광학 유리 표면 조작

6.8K 조회수

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DOI:

10.3791/56866

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2018년 3월 14일

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1Center for Metabolic and Vascular Biology, Mayo Clinic, 2Molecular and Cellular Biosciences, School of Life Sciences, Arizona State University, 3Department of Physics, Arizona State University, 4Center for Biological Physics, Arizona State University, 5Biodesign Institute, Arizona State University, 6Department of Civil and Environmental Engineering and Earth Sciences, University of Notre Dame, 7Advanced Imaging Center, HHMI Janelia Research Campus, 8Advanced Light Microscopy Facility, European Molecular Biology Laboratory

이 논문에서

요약

이 프로토콜에 설명 합니다 품질 광학 유리 표면 흡착 고정 표본 슈퍼 해상도 현미경을 가능 하 게 살아있는 표본의 대 식 세포 융합을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물으로 제조를 .

초록

Multinucleated 거 대 한 세포 (MGCs)의 형성을 시각화 하는 살아있는 표본에서 가장 라이브 이미징 기술이 필요로 유리를 통해, 빛의 전파 이지만 유리에 대 식 세포 융합 드문 이벤트는 사실 때문 도전 하고있다. 이 프로토콜 제공 여러 품질 광학 유리 표면의 제조 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물의 흡착 fusogenic 표면으로 유리를 변환 합니다. 첫째, 표면 개 질에 대 한 자료를 시작으로 깨끗 한 유리 표면 준비 설명 되어 있습니다. 둘째, fusogenic 기판에 변환 비 fusogenic 유리 하 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물의 흡착에 대 한 메서드가 제공 됩니다. 셋째,이 프로토콜 spatiotemporal 제어할 MGC 형성의 높은 학위를 홍보 하는 표면 micropatterns의 제작을 설명 합니다. 마지막으로, 유리 하단 요리 조작 설명 되어 있습니다. 시스템의 사용이 체 외에서 세포 대 식 세포 융합, MGC 형성 연구 모델의 예로 표시 됩니다.

서론

MGCs의 대형 다양을 한 만성 염증1고유 인체에 병 적인 상태를 동반 한다. 계약 형태 MGCs2mononucleated 세포 융합에 불구 하 고 의외로 몇 연구 퓨전 생활 맥락에서 표본3,4. 이 때문에 대부분의 이미징 기법에 필요한 깨끗 한 유리 표면 염증 성 cytokines5에 의해 유도 된 때 대 식 세포 융합을 촉진 하지 않습니다. 실제로, 깨끗 한 유리 사용 하는 경우는 기질으로 대 식 세포 융합, 다음에 대 한 중간 확대 목표 (즉, 10-20 X) 하의 연속 이상 15 h 낮은 이미징 종종 필요 단일 퓨전 이벤트를 관찰 합니다.

다른 손, fusogenic 플라스틱 표면 (예를 들어, permanox) 또는 세균 학년 플라스틱에 퓨전2홍보. 그러나, 플라스틱을 통해 영상 이므로 문제가 기판 두께 이며 빛을 없앤다. 이 긴 작업 거리 (LWD) 목표는 필요한 이후 이미징 복잡. 그러나, LWD 목표는 일반적으로 낮은 조명 coverslip 수정 그들의 대응에 비해 용량 수집 있다. 또한, 미분 간섭 명암 등 견본을 통과 하는 빛의 극성에 변화를 악용 하는 기법 없습니다 가능한 플라스틱 birefringent 이므로. 플라스틱의 사용과 관련 된 장벽은 대 식 세포 융합/MGC 형성 표면에 발생 합니다 예측할 수는 없습니다는 사실에 의해 더 강조 된다. 함께, 이러한 제한 제한 단계 대조 광학, 총 이미징 기간 연장에 대 식 세포 융합의 시각화 (> 15 연속 시간), 그리고 낮은 해상도.

우리는 최근 고정 세포/MGCs4단일 분자 슈퍼 해상도 현미경을 수행 하는 동안 매우 fusogenic 유리 표면을 식별. 이 관찰 했다 유리 청소 때문에 외 표면 촉진의 매우 낮은 속도로 퓨전 ~ 5% 후 인터 루 킨-4 (IL-4) 융해에 의해 결정 된 대로 존재 24 h 색인4. 우리는 발견 퓨전 홍보 용량 oleamide 오염 때문. Oleamide 또는 유사 하 게 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 다른 화합물의 흡착 유리 fusogenic를 했다. 대부분 fusogenic 화합물 (파라핀 왁 스) micropatterned, 고 대 식 세포 융합 및 융합 이벤트는 같은 시간 내에 permanox에 비해 관찰 수에 2-fold 증가 spatiotemporal 제어의 높은 학위를이 수 있습니다. 이러한 광학 품질 서피스 형태 기능 및 생활 표본에서 MGCs의 형성을 제어 하는 활동으로 첫 번째 엿볼 제공.

이 프로토콜에 우리 살아있는 표본에서 MGCs의 형성을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 유리 표면의 다양 한의 제작을 설명 합니다. 또한, 우리는 이러한 서피스는 의무가 멀리 필드 슈퍼 해상도 기법을 보여줍니다. 표면 제작, 실험의 목표에 따라 달라 집니다 그리고 각 표면 진행 텍스트에 관련 된 예제와 함께 설명.

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프로토콜

동물을 사용 하는 절차는 동물 관리 및 사용 위원회 메이 요 클리닉, Janelia 연구 캠퍼스와 애리조나 주립 대학에 의해 승인 되었다.

1. 준비 산 청소 커버 유리

참고: 많은 제조 업체에서 구입 하는 커버 유리 예상 대로 깨끗 한 않을 수 있습니다. 현미경은 관여 하는 모든 프로시저 앞 커버 유리의 일괄 처리를 정기적으로 청소 하십시오.

  1. 높은 엄중 커버 유리를 구입. 정확한 두께 (0.15 또는 0.17 m m)을 선택 하려면 특별 한 주의 분리 했습니다.
    참고: 커버 유리 두께의 선택은 현미경 목표에 따라 달라 집니다 그리고 객관적인 배럴에 나열 됩니다.
  2. 커버 유리 쥡니다 (42 kHz, 70 W)와 1 시간에 대 한 환기가 화학 증기 두건에서 12 M 염 산에서 품 어. 신선한 12 M HCl와 함께 두 개의 추가 시간에 대 한이 단계를 반복 합니다.
  3. 초순 수로 별도 비 커를 커버 유리를 추가. 환기가 화학 후드 5-10 분에 대 한 커버 유리 sonicate 10 번이이 단계를 반복 합니다.
  4. 순수한 아세톤 쥡니다와 30 분에 대 한 환기가 화학 후드에 덮개 유리를 품 어. 두 개의 추가적인 시간 동안이 단계를 반복 합니다.
  5. 불 임 초순 물으로 별도 비 커를 커버 유리를 추가. 환기가 화학 후드 5-10 분에 대 한 커버 유리 sonicate 10 번이이 단계를 반복 합니다.
  6. 100% 에틸 알코올 쥡니다와 30 분 동안 화학 후드에서에 덮개 유리를 품 어. 두번 추가이 단계를 반복 합니다.
    참고: 에틸 알콜의 순수성이 중요 합니다. 녹은 고체의 형태로 오염 물질 유리에 건조 것입니다 고 대 식 세포 융합을 승진 시킬 수 있다.
  7. 장기 저장에 대 한 순수한 에틸 알코올로 가득 컨테이너에 산 성 청소 커버 유리를 놓습니다. 또는 커버 유리 질소 가스와 진공 desiccator에서 건조.

2. 품질-Fusogenic 광학 표면 준비

  1. DMSO 무료 분해 초순 톨루엔에 포인트 파라핀 왁 스 높은 녹는.
    참고: 주식 농도가 10 mg/mL에서 있으며 희석된 1:9 1 mg/mL 작업 솔루션으로 만들기 위해 초순 톨루엔에.
    주의: 톨루엔 처리 되어야 합니다 주의 기형 발생 물질으로. 기관 화학 위생 계획에 따라 톨루엔의 처분.
  2. 파라핀 솔루션 건조 산 청소 커버 유리를 균일 하 게 유리 표면을 커버 하는 볼륨에 작업을 적용 합니다. 초과 솔루션을 가만히 따르다 하 고 건조 한 질소 가스 또는 공기 커버 유리. 대량 준비, Coplin jar 커버 유리를 수용 하도록 설계 된 사용 합니다.
  3. 커버 유리 폴란드어 x 축에 3 타 차로 및 다음 보풀 지우기 y 축에 3 타 차로 ( 재료의 표참조).
  4. 실험을 실시 하기 전에 즉시 살 균 초순, 커버 유리를 세척 하 고 생물 안전 후드에 자외선 빛으로 15-30 분 후 소독. 또는, 에틸렌 산화물 또는 감마 방사선 조사에 의해 커버 유리를 소독.

3. Micropatterning 탄화수소 포함 된 화합물 융합 제한 미리 지역

  1. 건조 한 산 청소 덮개 유리 및 유리는 평평한 표면에 고정.
  2. 집게를 사용 하 여 신중 하 게 골드 전송 전자 현미경 검사 법 파인더 그리드 탄화수소 compound(s)의 작업 솔루션에 젖어. 실험의 최종 목표를 충족 하는 탄화수소 화합물을 선택 하십시오 ( 표 1참조). 부드럽게 필터 종이에 그리드를 활용 하 여 멀리 초과 솔루션을 심지 하 고 즉시 덮개 유리의 센터에 눈금을 배치. 다음 단계로 진행 하기 전에 2 분 동안 건조 톨루엔을 허용 합니다.
  3. 그리드는 조심 스럽게 거꾸로 유리 유리에 보 세 다는 것을 확인 하십시오. 경우에 그리드 분리 3.2 새로운 커버 유리를 사용 하 여 단계를 반복 합니다.
    참고: 플라즈마 클리너를 사용할 수 없는 경우 3.4 단계를 생략 합니다.
  4. 플라즈마는 진공 가스 플라즈마 처리에 의해 커버 유리를 청소.
    참고: finder 그리드는 플라즈마에서 긴 사슬 탄화수소 흡착 내부 표면을 보호 하는 마스크 역할을 합니다. 그리드에 의해 보호 지역 플라즈마에 노출에 의해 비 fusogenic 렌더링 됩니다. 커버 유리는 플라즈마에 노출 시간 실험적으로 결정 되어야 합니다.
  5. 조심 스럽게 파인 팁 집게를 사용 하는 micropattern를 노출 유리 표면에서 그리드를 제거.

4. 조작 유리 하단 요리

  1. 35 m m 플라스틱 단계 드릴 비트를 사용 하 여 배양 접시의 바닥에 6 ~ 10 mm 원형 구멍을 드릴 합니다.
    참고: 단계 드릴 비트를 사용 하 여 부드러운 가장자리를 만들려고 하는. 가장자리 너무 거친 경우에, 커버 유리 접시의 바닥에 평평 본드 하지 것입니다. 불완전 하 게 평면 어려워질 현미경 검사 법.
  2. 신중 하 게 혼합 하 고 (즉,입니다; 제조업체의 지침에 따라 실리콘 엘라 스토 머를 드 PDMS)입니다.
  3. 탄성 중합체의 가장자리에 그냥 proximate의 얇은 코팅을 적용 (즉, 세포핵) 구멍.
    참고:는 탄성 연속 이라도 얇은 밴드 구멍 주변으로 나타납니다.
  4. 부드럽게 적용 fusogenic 커버 유리 (섹션 2 참조), 또는 (섹션 1에서에서 설명한) 건조 산 청소 커버 유리 접시에 탄성에 의해 포위 하는 구멍을 커버 하기 위해. 커버 유리 접시의 바닥에 플러시 나타납니다 확인 하는 유리의 상당한 부분 플라스틱 접촉 구멍의 지름을 확장. 2-3 h 50 ° C에서 굽기 여는 탄성 중합체를 치료.
  5. Fusogenic 유리 선호 하는 경우, UV 소독 표준 프로토콜에 따라 요리와 문화 셀. 그러나, 선호는 micropattern 이면 micropattern 준비에 대 한 3.2 단계로 진행 (micropatterning 사용 가스 플라즈마 접시 sterilizes을 강하게 PDMS 유리).

5. Thioglycollate elicited 세포 수집

  1. 앞에서 설명한3,,468 주 오래 된 C57BL/6 쥐 4% 맥주의 thioglycollate의 살 균 솔루션의 0.5 mL를 주사.
  2. 72 시간 후, 승인 된 동물 보호에 따라 동물을 안락사 지침, 고 차가운 인산 염 버퍼 염 분 보충 5 m m ethylenediaminetetraacetate와 복 막 게 하 여 세포를 수집 합니다.
  3. 3 분 x 300g에 대 식 세포를 원심 및 resuspend DMEM:F12 15 mM HEPES, 보충의 1 mL에 10 %FBS, 및 1% 항생제 (배양).
    참고: 셀 이후에 Neubauer hemocytometer 함께 계산 됩니다. 대 식 세포는 적절 한 농도를 희석 하 고 표면에 적용. 실험적인 질문을 위해 수 사관에 의해 주어진된 표면에 적용 하는 셀의 수를 신중 하 게 고려 되어야 한다. 기본 문학에서 알려진된 표준을 참조 하십시오.
  4. 30 분 후 HBSS 보충 비 부착 한 세포를 제거 하 고 신선한 문화 매체와 대체 0.1 %BSA 표면 세척. 문화 인큐베이터 (5% CO2 공기 37 ° C에서)를 반환 합니다.
  5. 2 시간 후, 매체를 발음 하 고 배양 10 ng/mL IL-4의 보충으로 바꿉니다. 4설명 되어 있는 대로 셀을 이미지.

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결과

재료의 물리 화학 매개 변수 macrophage 퓨전7,8,,910의 범위에 극적인 영향을 미칠. 또한, 표면 오염 물질 macrophage 퓨전11홍보 알려져 있습니다. 그러므로, 대 식 세포 융합에 대 한 부정적인 제어로 중요 한 시작으로 깨끗 한 커버 유리 하다. 청소 프로토콜 1에에서 설명 된 대로 때는 커버 유리는 매우 명백한 표면 기능, 평면으로 반면 표면 연마 뒤 긴 사슬 탄화수소의 흡착 nanotopography (그림 1)의 정도 만듭니다.

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토론

확인 하 고 이후에 대 식 세포 융합을 촉진 하는 품질 광학 유리 표면 개발 필요 사실 더 최근에 출판 된 연구 직접까지 생활의 맥락에서 대 식 세포 융합을 시각에서 비롯 된 표본3, 4. 일반적으로 사용 되는 fusogenic 플라스틱 표면 LWD 목표 요구 되며 단계 대조 광학으로 제한는 사실 때문입니다. 이 방 벽 뿐만 아니라 대 식 세포 융합의 특별 한 요금을 추진 하지만 MGCs의 형성 공간 제어의 놀라운 학위를이 수 한 품질 광학 유리 표면 공학에 의해 극복 되었다.

이 기술은 대 식 세포 융합을 모니터링 고급 이미징 기술 사용할 수 있습니다, 있지만 제한 없이 오지 않는다. 긴 사슬 탄화수소 (예를들면, oleamide, 파라핀 왁 스, 등)와 흡착 광택된 표면 fusogenic 플라스틱 표면에 비해 대 식 세포 융합의 특별 한 ...

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공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

우리가 감사 멤버 Ugarova 실험실 및 센터에 수 사관의 대사와 혈관 생물학에 대 한이 작품의 유용한 토론 하고자 합니다. 제임스 파우스트 2015 년에서 유럽 분자 생물학 실험실 슈퍼 해상도 현미경 코스에서 강사에 게 그의 감사를 표현 하고자 합니다. LLSM에 대 한 샘플 준비에 대 한 Janelia에서 Satya 쿠 온 감사 하 길. 검토 하 고이 작품의 촬영 부분 동안 제임스 파우스트 T32 화목 (5T32DK007569-28)에 의해 지원 되었다. 이 작품의 격자 빛 시트 구성 요소는 HHMI 및 베티와 고 든 무어 재단에 의해 지원 되었다. T.U.는 NIH에 의해 투자 된 HL63199를 부여.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
플라즈마 클리너Harrick PlasmaPCD-32G
파인더 그리드전자 현미경 과학G400F1-Au모든 금 TEM 그리드가 작동합니다
커버 유리(22x22mm)Thor LabsCG15CH고강도 커버 유리만 사용
파라핀 왁스Sigma Aldrich17310
PetrolatumSigma Aldrich16415&알파;-토코페롤이 없어야 합니다
레아미드시그마 알드리치O2136
이소프로판올시그마 알드리치278475
톨루엔시그마 알드리치244511
아세톤VWR 국제BDH1101
에탄올전자 현미경 과학15050사용 저용존 고형물 에탄올
염산Fischer ScientificA144C-212사용 산 세척 커버 유리
Slyguard 184VWR International102092-3121:10 비율로 혼합하고 50 °C에서 경화; C for 4 h
35 mm 페트리 접시Santa Cruz Biotechsc-351864
Dumont no. 5 forceps전자 현미경 과학72705섹션 3.5
FBSAtlanta BiologicalS11550
DMEM:F12Corning10-092에는 15mM HEPES
펜/스트렙코닝30-002-Cl
HBSSCorning21-023
BSA 솔루션Sigma AldrichA9576HBSS에서 0.1%로 사용하여 비접착성 대식세포
IL-4GenscriptZ02996분취를 10μ에서 세척합니다. g/mL 및 -20°C에 보관하십시오. C
C57BL/6JJackson Laboratory000664조영제가 필요하지 않은 고정 샘플이나 기법에 사용
eGFP-LifeAct 마우스해당 없음실시간 형광 이미징에 사용
KimwipeKimberly Clark 34155탄화수소 흡착 표면 연마에 사용
. 올로 대체하는 경우 은 신선한 을 준비합니다. 트 이 포함되어 있습니다.은

참고문헌

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  18. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
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  20. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).
  21. Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).

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