CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

Sriram Vijayraghavan; Boris Kantor

doi:10.3791/56915

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방법 논문

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

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DOI:

10.3791/56915

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2017년 12월 12일

Sriram Vijayraghavan¹ , Boris Kantor¹

¹Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine

이 논문에서

요약

우리는 셀에 CRISPR/Cas9를 제공 하기 위한 차량으로 integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 생산 전략을 설명 합니다. 셀에서 편집 하는 신속 하 고 강력한 유전자를 중재 하는 능력, IDLVs 안전 제시와 유전자 배달에 대 한 동등 하 게 효과적인 벡터 플랫폼 integrase 유능한 벡터에 비해.

초록

Lentiviral 벡터 셀 안정적으로 세포의 광범위 한 범위를 시험 하 고 높은 수준의 유전자 발현의 중재에 대 한 자신의 능력 때문에 유전자 편집 구성 요소를 제공 하기 위한 이상적인 선택입니다. 그러나, 호스트 세포 게놈으로 통합 하는 능력 강화 insertional 변이의 위험 하 고 따라서 안전 우려를 제기 하 고 임상 조정에 있는 그들의 사용을 제한. 또한, 유전자 편집 구성의 영구 식 무차별 유전자 타겟팅의 확률이 통합 관할 lentiviral 벡터 (ICLVs) 증가 의해 전달. 대신, integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 새로운 세대 개발 되었습니다 많은 이러한 문제를 해결 하는. 여기 CRISPR 중재 유전자 편집 및 목록에 대 한 새로운 기능 및 향상 된 IDLV 플랫폼의 생산 프로토콜 단계 정화에 관여 하 고 설명 하는 같은 벡터의 농도 변환 및 HEK 293T를 사용 하 여 유전자 편집 효율성 셀 시연 했다. 이 프로토콜은 쉽게 확장 가능한 고 시험 세포 생체 외 고 에 비보수 있는 높은 titer IDLVs를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 ICLVs의 생산을 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

서론

정확한 유전자 편집 유전 질병을 해결 하기 위해 새로운 전략의 개발을 포함 하는 주요 생물 의학 발전의 초석을 형성 한다. 유전자 편집 기술의 최전선 이다는 c광택 regularly-난nterspaced s읽힌 palindromic repeats (CRISPR)의 사용에 의존 하는 방법 / 처음 확인 된 Cas9 시스템 으로 바이러스 유전 물질 (참조¹^,²검토)의 침공에 대 한 세균의 구성 요소입니다. 아연 손가락 nucleases (ZFNs) 등 전사 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs) (참조³에서 검토 한 결과), 다른 유전자 편집 도구 CRISPR/Cas9 시스템의 주요 이점은 이다 플라스 미드 디자인의 상대적 단순 하 고 CRISPR 구성 요소 건설-기능 유전자 편집, 몇 가지 전문된 실험실에서 훨씬 더 광범위 한 연구 공동체의 확장을 강화 했다. 또한, CRISPR/Cas9 프로그래밍의 단순 하 고 다중화 대상 인식에 대 한 용량 추가 비용 효율적이 고 사용 하기 쉬운 기술로 인기를 연료 있습니다. 셀에 같은 유전자 편집 ....