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방법 논문

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

16K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56915

⸱

2017년 12월 12일

 , 
1Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine

이 논문에서

요약

우리는 셀에 CRISPR/Cas9를 제공 하기 위한 차량으로 integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 생산 전략을 설명 합니다. 셀에서 편집 하는 신속 하 고 강력한 유전자를 중재 하는 능력, IDLVs 안전 제시와 유전자 배달에 대 한 동등 하 게 효과적인 벡터 플랫폼 integrase 유능한 벡터에 비해.

초록

Lentiviral 벡터 셀 안정적으로 세포의 광범위 한 범위를 시험 하 고 높은 수준의 유전자 발현의 중재에 대 한 자신의 능력 때문에 유전자 편집 구성 요소를 제공 하기 위한 이상적인 선택입니다. 그러나, 호스트 세포 게놈으로 통합 하는 능력 강화 insertional 변이의 위험 하 고 따라서 안전 우려를 제기 하 고 임상 조정에 있는 그들의 사용을 제한. 또한, 유전자 편집 구성의 영구 식 무차별 유전자 타겟팅의 확률이 통합 관할 lentiviral 벡터 (ICLVs) 증가 의해 전달. 대신, integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 새로운 세대 개발 되었습니다 많은 이러한 문제를 해결 하는. 여기 CRISPR 중재 유전자 편집 및 목록에 대 한 새로운 기능 및 향상 된 IDLV 플랫폼의 생산 프로토콜 단계 정화에 관여 하 고 설명 하는 같은 벡터의 농도 변환 및 HEK 293T를 사용 하 여 유전자 편집 효율성 셀 시연 했다. 이 프로토콜은 쉽게 확장 가능한 고 시험 세포 생체 외 고 에 비보수 있는 높은 titer IDLVs를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 ICLVs의 생산을 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

서론

정확한 유전자 편집 유전 질병을 해결 하기 위해 새로운 전략의 개발을 포함 하는 주요 생물 의학 발전의 초석을 형성 한다. 유전자 편집 기술의 최전선 이다는 c광택 regularly-난nterspaced s읽힌 palindromic repeats (CRISPR)의 사용에 의존 하는 방법 / 처음 확인 된 Cas9 시스템 으로 바이러스 유전 물질 (참조1,2검토)의 침공에 대 한 세균의 구성 요소입니다. 아연 손가락 nucleases (ZFNs) 등 전사 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs) (참조3에서 검토 한 결과), 다른 유전자 편집 도구 CRISPR/Cas9 시스템의 주요 이점은 이다 플라스 미드 디자인의 상대적 단순 하 고 CRISPR 구성 요소 건설-기능 유전자 편집, 몇 가지 전문된 실험실에서 훨씬 더 광범위 한 연구 공동체의 확장을 강화 했다. 또한, CRISPR/Cas9 프로그래밍의 단순 하 고 다중화 대상 인식에 대 한 용량 추가 비용 효율적이 고 사용 하기 쉬운 기술로 인기를 연료 있습니다. 셀에 같은 유전자 편집 구성 요소를 제공 하는 연구자를 사용할 수 있는 다양 한 방법 중에서 바이러스 성 벡터 남아 지금까지 가장 인기 있는 하 고 효율적인 시스템.

Lentiviral 벡터 (LVs) CRISPR/Cas9 시스템에 비보에 대 한 다양 한 응용 프로그램4,5,,67의 구성 요소를 제공 하는 선택의 수단으로 떠오르고 있다. 몇 가지 주요 기능 LVs 셀 분할 및 분할 비, 낮은 immunogenicity 및 최소한의 세포 독성 (참조8에서 검토) 감염을 그들의 능력을 포함 하 여이 프로세스에 대 한 인기 있는 선택을 하십시오. 결과적으로, LV-중재 유전자 치료는 고용, HBV, 및 HSV-1, 등 전염 성 질병의 치료 뿐만 아니라 인간의 유전 질병, 낭 성 섬유 증, 신 혈관 황 반 변성 등을 기본 결함의 수정에 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. 게다가, LVs 효과적으로 수정 된 다중 유전자 단일 벡터 시스템12을 사용 하 여 고유한 게놈 loci에서 편집을 수행 하.

그러나, 호스트 게놈으로 통합 하는 LVs의 고유의 속성 기지가 될 수 있으며 종종 오답 임상 설정에서 특히 transgene 배달 차량으로 그들의 유틸리티. 또한, 안정적 통합 LVs 지속적으로 높은 수준에서 그들의 transgenes 표현, 이후이 시스템은 적합 CRISPR/Cas9; 같은 구성 요소를 편집 하는 유전자의 전달 Cas9 가이드 RNA (gRNA), 그리고 ZFNs, 같은 유사한 단백질의 overexpression 오프 대상 효과, 바람직하지 않은 돌연변이13,14,,1516 를 포함 하는 높은 수준의와 관련 된 , 17 그리고 잠재적으로 세포 독성18을 향상 시킬 수 있습니다. 따라서, 정확 하 게 달성 하기 위해 최소한의 대상에서 효과, 유전자 편집 그것은 구성 요소를 편집 하는 유전자의 변이 표현에 대 한 수 있도록 시스템을 설계 하는 것이 필수적.

최근 몇 년 동안, 전송 플랫폼의 다양 한 정도 셀16,19,,2021 (참조22검토) CRISPR/Cas9을 표현 하기 위해 개발 되었습니다. 직접 소개 적절 한 가이드 RNAs 함께 순화 Cas9 셀으로 타겟 유전자를 플라스 미드 중재 transfection16에 비해 편집에 더 효과적일 표시 했다에 의존 하는 방법이 포함 됩니다. 그 ribonucleoprotein (RNP)을 증명 하는 연구 단지의 구성 된 가이드 RNA/Cas9 입자는 이러한 부품의 단기 식 달성 하기에 충분을 제안 하는 그들의 목표에서 DNA 분열 중재 후 급속 하 게 인계 16편집 하는 강력한 유전자. 비 통합 adeno 관련 바이러스 성 벡터 (AAVs) 같은 바이러스 성 벡터 플랫폼 세포에 유전자 편집 기계를 제공 하는 대안을 제공할 수 있습니다. 불행히도, AAV capsids LVs 보다 크게 낮은 포장 기능 보유 (< 5 kb)는 심각 하 게 단일 벡터 (검토 참조8) 내에서 다중 구성 요소 CRISPR 툴킷을 포장 하는 그들의 능력을 방해 한다. 히스톤 deacetylases (예를 들면, 나트륨 낙 산 염23)을 억제 하거나 (예를 들어, 카페인24) 세포 주기를 방해 하는 화합물의 추가 lentiviral titers을 증가 표시 되었습니다 지적 가치가 있다. 몇 가지 단점, 낮은 생산 효율성 등 감소 바이러스 titers을 통해 생성 하는 바이러스의 낮은 변환 효율성 있는 최근 진도도 불구 하 고 지금까지 개발 된 과도 식 시스템 장애가 여전히는 같은25를접근 한다.

LVs의 포장 능력을 결합 하 여 셀에서 AAV 같은 episomal 유지 보수의 추가 혜택으로 Integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs) 유전자 배달 차량 개발에서 큰 발전을 나타냅니다. 이러한 기능을 통합 벡터, 마주-à-마주 연속 overexpression 잠재적으로 차적인 요소 및 통합 중재 변이와 관련 된 주요 문제를 크게 우회 하는 IDLVs 있습니다. 그것은 이전 IDLVs 성공적으로 episomal 유전자 식26,27향상을 수정할 수 있습니다 시연 했다. CRISPR/Cas9 IDLV 중재 배달에 관하여 낮은 생산 titers 및 낮은 표현의 integrase 능숙 lentiviral 시스템 상대적인 episome 부담 게놈 게놈 편집 제공 하기 위한 진실 fide 도구로 그들의 유틸리티 제한 유전자 변형 구문입니다. 우리는 최근 transgene 표현과 IDLV 생산과 관련 된 바이러스 titers 크게 바이러스 성 식 카세트28내 녹음 방송 요인 s p 1에 대 한 사이트 바인딩을 포함 하 여 향상 된 시연. 수정 된 IDLVs 튼튼하게 CRISPR 중재 하는 유전자는 해당 ICLV 중재에 비해 최소한의 대상에서 돌연변이 유도 하는 동안 생체 외에서 (HEK 293T 세포)에서 그리고 vivo에서 (포스트 mitotic 뇌 신경)에 편집 지원 시스템28. 전반적으로, 우리는 소설을 개발, 소형, 모든-에-하나의 CRISPR 툴킷 IDLV 플랫폼에서 실시 하 고 향상 된 유전자 편집에 대 한 배달 차량을 사용 하 여 다양 한 이점을 설명.

여기, IDLV-CRISPR/Cas9 시스템의 생산 프로토콜은 설명, 어셈블리, 정화, 농도, 그리고이 벡터의 유전자 편집 효능을 확인 하기 위해 전략 뿐만 아니라 IDLVs, 적정에 관련 된 다양 한 단계를 포함 하 여. 이 프로토콜은 다른 수 사관 들의 요구를 충족 하도록 쉽게 확장 가능한 고 성공적으로 1 x 1010 단위 (TU) 시험의 범위에서 titers와 LV 벡터를 생성 하도록 설계 되었습니다 / mL. 이 프로토콜을 통해 생성 된 벡터 효율적으로 여러 다른 세포 유형, 어려운 transduce 배아 줄기 세포, 조 혈 모 세포 (T 세포와 대 식 세포)를 포함 하 여 그리고 교양 및 시내 vivo-감염에 이용 될 수 있다 주입된 하는 신경. 또한, 프로토콜은 동등 하 게 잘 비슷한 수량 integrase 유능한 lentiviral 벡터의 생산에 적합 합니다.

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그림 1: IDLV 포장. 수정 된 플라스 미드는 psPAX2에서 파생 된 야생 타입 integrase 단백질 (b) 의 (a) 회로도 (방법, 플라스 미드 건설에 대 한 자세한 내용은 참조). 클론 돌연변이 integrase 클론에 대 한 검사의 대표 agarose 젤 이미지. DNA 샘플 표준 플라스 미드 DNA 분리 미니 키트를 사용 하 여 준비 EcoRV와 SphI 소화에 의해 분석 되었다. 제대로 소화 클론 (5 번, 파선된 빨간색 상자) 직접 (생어) 연속 D64E 대체 INT에 대 한 추가 확인 했습니다. Integrase 불충분 한 포장 카세트 pBK43 선정 됐다. (c) 과도 transfection 프로토콜의 회로도 고용 IDLV-CRISPR/Cas9 벡터 생성 하 293T 세포 VSV G, 포장, 및 transgene 카세트 (s p 1-CRISPR/Cas9-에-하나의 플라스 미드)와 페 보여주는. 바이러스 성 입자를 세포 막에서 밖으로 새싹 (transgene 카세트에서 표현) 벡터의 길이 RNA 포함. 그리고 IDLV-포장 시스템의 두 번째 세대 사용, 규제 단백질 문신 포함 목사 계 식 추가 별도 카세트 (RSV-레 브-플라스 미드)에서 보완. Abbrev: LTR 긴 터미널 반복, VSV G vesicular 구내 염 바이러스 G-단백질, pCMV 세포 발기인; 라우 스 육 종 바이러스 (RSV) 발기인; RRE-(계 응답 요소)입니다. 다른 규제 요소 식 카세트에 포함 Sp1 바인딩 사이트, 레 브 응답 요소 (RRE), 마 형 간염 바이러스 Posttranscriptional 규제 요소 (WPRE), 코어-신장 요인 1α 발기인 (EFS-NC), 벡터 포장 요소 ψ (psi), 인간의 세포 (hCMV) 발기인, 그리고 인간의 U6 발기인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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프로토콜

1. HEK 293T 세포 배양과 Transfection에 대 한 셀을 시드

참고: 인간 미 발달 신장 293T DMEM, 10% 소 송아지 혈 청 철 및 성장 발기인 및 항생제 antimycotic 솔루션 x 1 보충으로 보충 하는 높은 포도 당 미디어에서에서 재배 되 고 (HEK 293T) 세포 (100 x 솔루션 포함 10000 단위 페니실린 10 mg 스와 25 µ g 암포 B mL 당). 미디어는 또한 1 x 나트륨 pyruvate, 1 x 비 필수 아미노산 믹스, 그리고 2 mM L-글루타민 보충 (재고 200 mM L-alanyl-L-글루타민 dipeptide 0.85 %NaCl에서). 셀 (대략 성장 표면적은 55 c m ²) 100 m m 조직 문화 접시에 교양. 1시 10분의 하위 재배 비율 하위 모든 2-3 일 배양 사용 됩니다. 트립 신-EDTA 0.05% 통행 사이 세포의 분리에 사용 됩니다. 실험 간에 일관성을 유지, 세포 성장, transfection 효율에에서 어떤 변화를 모니터링 하 고 생산 벡터 다른 많은/일괄 전환 시 테스트 종 아리 세라 추천 우리.

  1. 10cm 조직 문화 접시에 뿌리기에 의해 낮은 통로 셀 (그것 후에 통로 15 또는 성장 감속 경우 셀을 사용 하지 않도록 권장)를 사용 하 여 새로운 문화를 시작 합니다. DMEM 세포 성장에 대 한 10% 혈 청으로 보충을 사용 합니다. 5% CO2 표준 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 성장. 표준 hemocytometer를 사용 하 여 셀에 대 한 모든 후속 단계.
  2. 일단 셀 도달 90-95 %confluent 성장, 15 cm로 다시 조직 문화 접시 (아래 단계 1.3-1.5).
  3. 다시 시드하, aspirate 미디어는 합칠에서 접시와 부드럽게 살 균 1 x PBS와 린스. 3-5 분 추가 8 mL 혈 청 분리 시 비활성화 하 여 단일 셀을 만드는 데 10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 10-15 회를 triturate 포함 된 미디어에 대 한 37 ° C에서 셀 분리 시 약 (예를 들어, 트립 신-EDTA)의 2 개 mL를 품 어 현 탁 액입니다. 약 4 x 106 셀/mL의 셀 밀도를 문화 미디어에 셀 resuspend
  4. 기판에 부착을 강화 하려면 사전에 0.2% 젤라틴, 젤라틴 접시 당 8 mL을 추가와 15 cm 판 코트. 접시의 표면에 걸쳐 균일 하 게 확산, 10 분 동안 실내 온도에 품 어 그리고 액체에서 사이 펀.
  5. 따뜻한 (37 ° C) HEK 293 T 미디어 (1 단계 아래 참고 참조) 25 mL에 각 격판덮개의 전체 볼륨을 가져오고 셀 (총 ~ 1 x 107 셀/플레이트)의 2.5 mL을 추가 하 여 판 씨. 하룻밤 또는 70-80 %confluency이 때까지 접시 5% CO2 와 37 ° c를 품 어.
    참고: 6 15 cm 접시 최대 생산을 위해 사용할 수 있습니다. 4 개 이상 접시 (근거에 대 한 프로토콜의 5 단계를 참조)를 사용 하는 경우 20 ~ 22 ml 접시 당 미디어의 볼륨을 조정 합니다.

2. transfecting HEK 293T 세포 칼슘 인산 염 기반 프로토콜을 사용 하 여

  1. Transfection 시 약
    1. BES 버퍼 솔루션 게시판 (50mm BES, 280 m m NaCl, 1.5 m m 나2HPO4) x 2를 준비 하려면 16.36 g의 NaCl, 10.65 BES의 결합 (N, N-비스 (2-hydroxyethyl)-2-아미노-ethanesulfonic 산), 나2HPO40.21 g. 추가 이중 증 류 H2O (dd-H2O) 최대 900 mL. 해산, 6.95 1 M NaOH로 pH를 적정와 볼륨 0.22 μ M 필터 장치 통해 1 L. 필터. -20 ° c.에 게
    2. 1 M CaCl2를 준비 합니다. 솔루션 0.22 μ M 필터를 통해 필터링. 4 ° c.에 게
  2. 하루 전에 시드 했다 번호판을 관찰 합니다. 그들은 70-80 %confluency 도달 세포 transfection 준비 되어 있다.
  3. 판에서 오래 된 미디어를 발음 하 고 부드럽게 혈 청 하지 않고 갓 미디어를 추가 합니다.
    참고: 선택한 플라스 미드 및 그들의 준비에 대 한 자세한 보충 파일 1-플라스 미드 를 참조.
  4. 15 mL 원뿔 튜브에 aliquoting 4 플라스 미드에 의해 플라스 미드 믹스를 준비 합니다. 한 15 cm 접시 준비에 대 한 사용은 CRISPR/Cas9-전송 벡터 (pBK198 또는 pBK189), 25 µ g의 pBK43의 37.5 µ g (psPAX2-D64E), 12.5 µ g pMD2.G, 및 이전 (그림 1c)의 6.25 µ g.
  5. 플라스 미드에 312.5 µ L 1 M CaCl2 를 추가 합니다. 이 살 균 dd-H20의 최대 1.25 mL를 추가 합니다.
  6. 천천히 (drop-wise) vortexing 믹스 2 x BBS 솔루션의 1.25 mL을 추가. 실 온에서 30 분 동안 품 어.
  7. 각 15 cm 플레이트 (접시 당 2.5 mL)에 dropwise transfection 혼합물을 추가 합니다. 플레이트를 부드럽게 소용돌이 5% CO2 2-3 h 37 ° C에서 품 어. 그 후, 접시 당 혈 청 2.5 mL (10%)를 추가 하 고 잠복기 계속 하룻밤 (12 월 18 일 h).
    참고: 일부 연구소 미디어 pH를 안정 시키기 위해 3% CO2 인큐베이터를 사용 합니다. 그러나, 우리 3%와 5% CO2사이 transfection 효율에 어떤 차이 관찰 하지 않습니다. 또한, 카 포4 침전의 크기가 transfection 효율;에 대 한 중요 한 transfection 혼합 셀에 그것의 추가 하기 전에 명확 하 게 있다. 혼합 되 면 흐린 인큐베이션 기간 동안, 준비 신선한 2 x BBS (pH = 6.95).

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그림 2: 더블-자당 그라데이션 프로토콜을 사용 하 여 바이러스 성 입자의 농도. 상쾌한 (SN)에서 수집 된 바이러스 성 입자는 그라데이션 자당 기온 변화도에 로드 됩니다. 70%, 60%, 30%, 및 20% 자당 솔루션은 그라디언트를 만드는 데 사용 됩니다. 원심 분리, 다음 30-60% 자당 분수에서 수집 하는 입자는 추가 20% 자당 쿠션에 로드 하 고 시 켰 던. 순화 된 바이러스 입자를 포함 하는 마지막 펠 릿 추가 사용에 대 한 1 x PBS에 resuspended (대 한 자세한 내용은 텍스트 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3입니다. 다음날 Transfection

  1. 그들은 100 %confluency 시점에서 아무 세포 죽음에 거의 근접 하는 보장 하기 위해 세포를 관찰 합니다. 각 접시에 신선한 DMEM + 10% 혈 청 25 mL를 추가 하 여 미디어를 교체 합니다. 5% CO2 는 추가 48 h에 대 한 37 ° C에서 배양을 계속 한다.
    참고: 이상의 6 15 cm 번호판 (주의 단계 5.2 참조)를 사용 하는 경우 단계 3.1에서에서 미디어의 볼륨을 조정 합니다.

4. 바이러스를 수확

  1. 조심 스럽게 transfected 세포 조직 문화 피펫은 멸 균 10 mL 및 50 mL 원심 분리기 튜브에서 수영장을 사용 하 여 포함 된 모든 조직 배양 접시에서는 상쾌한을 수집 합니다.
  2. 탁상 원심 분리기를 사용 하 여 10 분 동안 400-450 x g에서 원심 분리에 의해 중단을 취소 합니다. 0.45 μ m 진공 필터 장치 통해 상쾌한 필터링.
    참고: 필터링 된 상쾌한 수 농도, 계속 하기 전에 최대 4 일 동안 4 ° C에서 저장 또는 aliquoted-80 ° c.에 저장 IDLV-s p 1-CRISPR/Cas9 (비-농축) 바이러스 준비의 예상된 titers 2 ~ 10 배 해야7 화/mL (titer 결정을 위한 6 단계 참조). 그러나, 쓰는 중지 및 재개 기능 titers에 10-20% 손실에 결과의 각 라운드로 여러 freeze-thaw 주기를 바이러스 준비 하지 마십시오.

5입니다. Ultracentrifugation에 의해 바이러스 성 입자의 농도

참고: 두 단계를 포함 하는 정화의 더블 자당 방법 활용: 자당 그라데이션 단계와 자당 쿠션 단계 (그림 2).

  1. 자당 기온 변화도 만들려면 다음 순서로 원뿔 ultracentrifugation 튜브 로드: 0.5 mL 70% 자당 (1 x PBS 해산) 0.5 mL 60% 자당 (DMEM에 녹아 있는), 1 mL 30% 자당 (DMEM에 녹아 있는), 그리고 2 mL 20% 자당 (1 x PBS에 용 해).
  2. 그라디언트를 신중 하 게 바이러스를 포함 하는 상쾌한을 추가 합니다. 4 15 cm 접시에서 상쾌한의 총 볼륨은 100 mL, 스핀 당 6 ultracentrifugation 튜브 표면에 뜨는 바이러스의 전체 볼륨을 처리 하는 데 사용.
    1. 이 단계에 사용 하는 각 ultracentrifugation 튜브는 최대 30 mL (를 포함 하 여 자당의 볼륨)의 볼륨의 용량, 튜브, 적어도 10%를 떠나 중 동등 하 게 바이러스 상쾌한 배포 headspace 흘림을 방지 하기 위해.
    2. 풀링된 바이러스 상쾌한의 마지막 볼륨 쉽게 6 ultracentrifugation 튜브 내에서 수용 될 수 있도록 각 실험에 대 한 더 이상의 15 cm 번호판을 사용 하는 경우 문화 볼륨 접시 당 20 ~ 22 mL을 조정 합니다.
    3. 채우기 ultracentrifugation 적어도 3-4에 그들의 총 볼륨 용량 튜브, 튜브의 파손 원심 분리, 샘플 및/또는 장비 손상의 가능한 손실을 하는 동안 발생할 수 있습니다.
  3. 70000 x g 17 ° C에서 2 h에서 PBS 및 원심 분리기 샘플 x 1 튜브 균형 (회전자 세부 사항에 대 한 재료의 표 참조).
    참고: 가속 중 자당 계층의 중단을 방지 하기 위해 천천히 가속 화 하기 위해로 터 200 rpm 회전 급강하의 처음 3 분 동안 ultracentrifuge를 설정 합니다. 유사 하 게, 천천히 0 rpm 회전 급강하의 끝에 3 분 이상 200 rpm에서 회전자를 감속에 ultracentrifuge를 설정 합니다.
  4. 신중 하 게 깨끗 한 튜브 (그림 2)에 30-60% 자당 분수를 수집 합니다. 감기 1 추가 풀링된 분수 PBS x 100 ml; 볼륨을가지고 여러 번 왔다 갔다 pipetting으로 혼합.
  5. 신중 하 게 자당 쿠션에 바이러스 준비를 레이어 링 여 자당 쿠션 단계를 진행 합니다. 이 위해, 뒤에 튜브 당 바이러스 솔루션의 20 ~ 25 mL 튜브에 (1 x PBS)에서 20% 자당의 4 mL를 추가 합니다. 튜브는 3-4 분 미만 하는 경우 전체, 살 균 1 x PBS와 충전을.
  6. 신중 하 게 균형 그리고 원심에서 70000 x g 17 ° C에서 2 시간에 대 한 샘플 전에. 부는 상쾌한 어 고 나머지 액체를 종이 타 올에 튜브를 거꾸로 하 여 배출.
  7. 펠 릿에서 모든 액체를 제거 하려면 나머지 방울을 발음. 이 단계에서 바이러스를 포함 하는 펠 릿 겨우 작은 반투명 반점으로 표시 되어야 합니다.
  8. 1 x PBS의 70 µ L 첫 번째 튜브와 철저 하 게 정지를 pipetting, 이후 다음 튜브에 정지를 전송 및 추가 계속 하기 전에, 모든 펠 릿 resuspended 때까지 혼합 하 여 펠 릿을 resuspend.
  9. 이전과 PBS와 믹스 감기 1의 추가 50 µ L 튜브를 헹 구 십시오. 최종 서 스 펜 션의 결합 된 볼륨 ~ 120 µ L 이며, 약간 밀키; 나타납니다 확인 30에 대 한 10000 x g에서 원심 분리 하 여 취소 탁상 microcentrifuge에 s.
  10. 신선한 microfuge 관에는 상쾌한 전송, 10 µ L aliquots, 고-80 ° c.에서 그들을 저장합니다
    참고: lentiviral 샘플에 반복된 freeze-thaw 주기를 수행 하지 마십시오. 원심 분리가 필요한 때를 제외 하 고 노력 해야 조직 문화 후드의 나머지 단계를 수행 하려고 또는 적절 한 biosafety 조치 (내용 참조)를 사용 하 여 조직 문화 객실을 지정.

6입니다. 바이러스 Titers의 추정

  1. p24 -효소-연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 메서드
    참고: 분석 결과 수행으로 에이즈-1 p24 를 위한 NIH 에이즈 백신 프로그램의 지시 당 항 원 캡처 시험 키트 ( 재료의 표참조) 수정29높은 바인딩 96 잘 접시를 사용 하 여.
    1. 다음 날 씻어 200 µ L 0.05%로 세 번 우물 차가운 PBS (PBS-T 솔루션)에 트윈 20. 1:1500 1 x PBS에 희석에 항 체 단일 클로 널 반대로 p24 의 100 µ L 플레이트 코트와 4 ° c.에서 밤새 품 어
    2. 일반적인 바인딩 제거, 차단 PBS;에서 200 µ L 1 %BSA 접시 200 µ L 0.05%로 세 번 세척 실 온에서 1 시간 이상에 대 한 차가운 PBS (PBS-T 솔루션)에 트윈 20.
    3. 샘플을 준비: 집중된 벡터 준비, 대 한 약 1 µ L 샘플의 희석 Triton X-100 (최종 농도 10%)의 dd-H20과 10 µ L의 89 µ L을 추가 하 여. 비 집중 준비에 대 한 ten-fold 희석된 샘플 (샘플의 10 µ L 트라이 톤 X-100 (최종 농도 10%)의 dd-H20과 10 µ L의 80 µ L 추가)을 준비 합니다.
      참고: 샘플을 저장할 수 있습니다이 단계에서-20 ° C에서 나중 사용을 위해 시간의 연장된 기간에 대 한.
    4. 에이즈-1 표준 적용 (시작 농도 5 ng/mL)와 2-fold 직렬 희석 하 여 준비 합니다.
    5. 설정 1:10, 000, 0.2% 트윈 20, 1 %BSA 보충 RPMI 1640 년에 (1: 100 미리 희석된 주식)에서 집중된 샘플을 희석 1:50, 000, 그리고 1:250,000 희석. 비 집중 샘플 희석 (1시 10분에서 미리 희석 주식) 설정 1: 500, 1: 2500, 그리고 1:12,500 희석 하 0.2% 트윈 20, 1 %BSA 보충 RPMI 1640 년에.
    6. Triplicates에서 접시에 샘플을 적용 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
    7. 다음 날, 세척 우물 6 번 하 고 37 ° C 4 h 100 µ L polyclonal 토끼 안티-p24 항 체, RPMI 1640, 10 %FBS, 0.25 %BSA, 및 2% 정상 마우스의 혈 청 (NMS)에 희석된 1:1000에서 품 어.
    8. 6 배 위와 같이 세척 하 고 5% 정상 염소 혈 청, 2 %NMS, 0.25 %BSA 및 0.01% 보충 RPMI 1640에 IgG 희석 1:10,000 염소 안티 토끼 양 고추냉이 과산화 효소와 함께 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어 트윈 20.
    9. 위의 접시를 세척 하 고 15 분 동안 실 온에서 TMB 과산화 효소 기질으로 품 어.
    10. 1 N HCL의 100 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다. 450에 샘플의 흡 광도 측정 nm에서 흡 광도 사용 하 여 플레이트 리더.
  2. 기자는 형광 강도 측정
    1. FACS 메서드
      참고: 셀에 GFP 신호 고갈의 범위 수 있습니다 정확 하 게 추정 하실 cytometry 통해 transduced 셀의 의미 형광 강도 측정 하 여. FACS 데이터 분석, 프레 젠 테이 션, 및 해석에 대 한 최근 종이 28 을 참조 하십시오. 프로토콜은 다음과 같이 설명 되어 있습니다.
      1. 1 x PBS에 바이러스 준비 (10-510-1 )에서 준비의 ten-fold 직렬 희석을 확인 합니다.
      2. 잘 당 2 mL의 최종 볼륨에서 6 잘 플레이트의 각 음에 약 5 x 105 293T 세포 씨앗 셀에 각 바이러스 희석의 10 µ L을 추가 하 고 셀 48 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
      3. FACS 분석에 대 한 셀을 다음과 같이 수확: 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° C 5 분 추가 2 mL의 완전 한 DMEM 미디어에서 세포를 품 어 15 mL 원뿔 튜브 샘플을 수집.
      4. 4 ° C에 400 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 고 차가운 1 x PBS의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend.
      5. 고정,이 서 스 펜이 션에 4% 포름알데히드 솔루션의 동일한 볼륨을 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
      6. 고정된 셀 펠 렛 및 1 x PBS의 1 mL에 resuspend. Ortinski 외 에 설명 된 대로 GFP 식 FACS 악기를 사용 하 여 분석 28 잠시, 수식을 사용 하 여 다음 바이러스 기능 titer를 결정:
        figure-protocol-2
        참고: 여기 Tg = GFP-긍정적인 세포 계산; Tn = 계산; 세포의 총 수 N = 불리고; 세포의 총 수 V = (µ L)에서 볼륨을 사용 하는 변환에 대 한. 예: 1 x 106 세포 바이러스의 10 µ L로 불리고 있었다, 2 x 104 의 세포 라면 계산 및 5 x 103 GFP-긍정적인, 기능 titer 것 위의 방정식에 따라 했다:
        figure-protocol-3
    2. GFP-긍정적인 세포 계산
      1. 감염 (MOI) 변환에 대 한 사용의 다양성을 계산 합니다. MOIs 높은 변환 효율성이 증가 광범위 한 범위 MOIs (1-10)를 테스트 합니다.
      2. Transfection, 전에 대략 3-4 배 잘 당 105 셀 6 잘 플레이트 씨앗. 일단 셀 도달 > 90 %confluency (24 시간) 이내 transduce pre-determined MOIs에서 순화 된 바이러스.
      3. GFP 신호에 변화에 대 한 1-7 일에 대 한 표준 조직 문화, 5% CO2 와 37 ° C에서 접시와 정기적으로 모니터 세포를 품 어.
      4. GFP-긍정적인 세포의 수를 계산 하는 형광 현미경 (계획 4 X 목표, 0.1 한다 40 배 확대) 장착 GFP 필터 세트 (여기 파장 470 nm, 방출 파장-525 nm), 순진한 (유엔 transduced) 셀을 사용 하 여 인구를 설정 GFP 부정과 긍정적인 세포.
      5. 희석 비율 및 다음 수식을 사용 하 여 볼륨을 조정 하 여 최종 titer를 예상:
        figure-protocol-4
        참고: 여기에서, N = GFP-긍정적인 세포, D의 수 희석 요인, M = 확대 비율 (보통 20 X), V = = 변환에 사용 되는 바이러스의 볼륨. 예를 들어 20 GFP-긍정적인 세포 (N) 10-4 (1:10, 000) 20 X 10 µ L 샘플 (V)의 희석에서 계산에 대 한 배율 (M) (D) 귀 착될 것입니다 (10) x x x (20) (20 x 104)의 기능 titer (100 *) = 4 × 108 화/mL.
        (* mL 당 조정 하기)

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결과

IDLV-CRISPR/Cas9 벡터의 녹아웃 효율성의 유효성 검사
우리는 유전자 녹아웃 CRISPR/Cas9-중재의 효율성을 확인 하기 위해 모델 GFP 표현 293T 세포를 사용. GFP + 셀 HEK 293T 세포 pLenti-GFP (vBK201a) 0.5 (그림 3b, "no 바이러스" 패널)의 나에의 변환에 의해 생성 되었다. SgRNA-GFP/Cas9 모든-에-하나의 벡터 카세트 IDLV 또는 ICLV 입자에 포장 되었다 그리고 생산 효율 p24 일 라 (위; 참조 고 그림 3a)에 의해 평가 되었다. S p 1-바인딩 사이트 (다음 농도)를 포함 하는 벡터의 titers 10의 범위에 있을 것을 발견 했다10 화/mL. 우리는 다음 형광 현미경 검사 법 (

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토론

IDLVs는 vivo에서 유전자-편집, mutagenesis 배달 플랫폼22 통합에 비해 이러한 벡터와 관련 된의 낮은 위험 때문에 크게 유전 질병의 맥락에서 특히 선택의 차량으로 등장 하기 시작 했습니다. , 28. 현재 원고, 우리는 우리의 실험실28에 최근 개발한 향상 된 모든-에-하나의 IDLV-CRISPR/Cas9 시스템의 생산과 관련 된 프로토콜에 자세히 설명 하고자.

기존 플랫폼을 수정
이 방법으로 1 x 1010 화/mL (그림 3a)의 범위에서 IDLV-CRISPR/Cas9와 ICLV-CRISPR/Cas9 벡터 titers에서 생성할 수 있었습니다. 생산 효율에서이 향상이 모두 한 CRISPR/Cas9 벡터 카세트에 ...

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공개 사항

USC-499-P 특허 (1175)이이 원고에 설명 된 작업에 관하여 사우스 캐롤라이나 대학에 의해 제기 되었다.

감사의 글

우리는 신경 생물학의 학과 듀크 대학의과 대학 및 기초 과학, 듀크 대학에 대 한 학장의 사무실 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 원고에 의견에 대 한 공작 바이러스 성 벡터 코어의 회원을 감사합니다. 플라스 미드 pLenti CRISPRv2 Feng 장 (브로드 연구소)에서 선물 했다. LV-포장 시스템 플라스 미드 psPAX2를 포함 하 여, VSV G, pMD2.G, pRSV 계 Didier Trono (EPFL, 스위스)에서 종류 선물 했다. 이 작품에 대 한 재정 지원에의 사우스 캐롤라이나의과 대학에 의해 제공 된 RDF18080 E202 (B.K) 부여 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Equipment
Optima XPN-80 초원심분리기Beckman CoulterA99839
Allegra 25R 탁상용 원심분리기Beckman Coulter369434
xMark Microplate 흡광도 플레이트 리더Bio-Rad1681150
BD FACSBecton Dickinson338960
도립 형광 현미경LeicaDM IRB2
0.45-μ m 필터 장치, 500mLCorning430773
원뿔형 바닥 초원심분리 튜브Seton Scientific5067
원뿔형 튜브 어댑터Seton ScientificPN 4230
SW32Ti 스윙 버킷 로터Beckman Coulter369650
15 mL 코니컬 원심분리기 튜브Corning430791
50mL 코니컬 원심 분리기 튜브Corning430291
고 결합 96 웰 플레이트Corning3366
150mm TC 처리 된 세포 배양 접시 20mm 그리드코닝353025
100mm TC 처리 배양 접시Corning430167
0.22 μ M 필터 장치, 1LCorning430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)Qiagen27104
조직 배양 피펫, 5 mLCorning4487
조직 배양 피펫, 10 mLCorning4488
조직 배양 피펫, 25 mLCorning4489
혈구계(커버 슬립 포함)Cole-ParmerUX-79001-00
NameCompany카탈로그 번호Comments
>세포 배양 시약
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cellsATCCCRL-3216
293FT cellsThermo Fisher ScientificR70007
DMEM, 고포도당 매체Gibco11965
Cosmic Calf SerumHycloneSH30087.04
항생제-항진균 용액, 100XSigma AldrichA5955-100ML
피루브산 나트륨Sigma AldrichS8636-100ML
비필수 아미노산(NEAA)HycloneSH30087.04
RPMI 1640 매체Thermo Fisher Scientific11875-085
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
트립신-EDTA 0.05%Gibco25300054
BES (N, N-bis(2-하이드록시에틸)-2-아미노-에탄술폰산)Sigma AldrichB9879 - BES
젤라틴Sigma AldrichG1800-100G
NameCompany카탈로그 번호Comments
>p24 ELISA 시약
monoclonal anti-p24 항체NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램3537
HIV-1 표준NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램SP968F
폴리클론 토끼 항-p24 항체NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램SP451T
염소 항 토끼 양 고추냉이 과산화효소 IgGSigma Aldrich12-348작업 농도 1:1500
일반 마우스 혈청, 멸균, 500mLEquitech-BioSM30-0500
염소 혈청, 멸균, 10mLSigmaG9023작동 농도 1:1000
TMB 과산화효소 기질KPL5120-0076작동 농도 1:10,000
NameCompany카탈로그 번호<strong>코멘트
Plasmids
psPAX2Addgene12260
pMD2.GAddgene12259
pRSV-RevAddgene12253
lentiCRISPR v2Addgene52961
NameCompany 카탈로그 번호Comments
Restriction enzymes
BsrGINew England BiolabsR0575S
BsmBINew England BiolabsR0580S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
KpnINew England BiolabsR0142S
PacI뉴잉글랜드 BiolabsR0547S
SphI뉴잉글랜드 BiolabsR0182S

참고문헌

  1. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  2. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).
  3. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  4. Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).
  5. Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
  6. Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146(2016).
  7. Wang, W., et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9 (12), e115987(2014).
  8. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv Genet. 87, 125-197 (2014).
  9. Lebbink, R. J., et al. A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape. Sci Rep. 7, 41968(2017).
  10. Xu, L., et al. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. , (2017).
  11. Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).
  12. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), e147(2014).
  13. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).
  14. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  15. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  16. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
  17. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  18. Schaefer, K. A., et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).
  19. Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  21. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  22. Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).
  23. Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors. Virol J. 3, 27(2006).
  24. Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
  25. Hoban, M. D., et al. Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).
  26. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  27. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  28. Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).
  29. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).
  30. Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).
  31. Gomez-Gonzalo, M., et al. The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter. J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).
  32. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  33. Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength. J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).
  34. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  35. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  36. Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors. Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).
  37. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations. , Available from: https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf (2017).
  38. CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2017).
  39. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  40. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  41. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  42. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).

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