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방법 논문

패-리 신에서 랄 아미노 알콜의 합성을 위한 효소 캐스케이드 반응

11.6K 조회수

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DOI:

10.3791/56926

⸱

2018년 2월 16일

 ,  , 
1Génomique Métabolique, Genoscope, Institut François Jacob, CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay

이 논문에서

요약

카이 랄 아미노 알콜 건설 기계 유기 합성에 사용 하기 위해 다양 한 분자입니다. 패-리 신에서 시작, 우리 diastereoselective C H 산화 촉매 dioxygenase에 의해 해당 수 아미노산의 carboxylic 산 moiety의 분열에 의해 다음에 의해 결합 하는 효소 캐스케이드 반응에 의해 아미노 알콜을 합성 한 decarboxylase입니다.

초록

아미노 알콜은 다양 한 응용 프로그램으로 다양 한 화합물. 예를 들어, 그들은 유기 합성에서 랄 공중 발판으로 사용 되었습니다. 기존의 유기 화학에 의해 그들의 합성은 종종 stereochemical 결과의 어려운 제어와 지루한 여러 단계의 합성 과정을 필요합니다. 선물이 효소 synthetize 아미노 알콜 48 h에 쉽게 사용할 수 있는 L 리 진에서 시작 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 매우 전통적인 유기 합성 하 여 수행 하기 어려운 두 화학 반응 결합 합니다. 신의 unactivated C H 본드의 첫 번째 단계, regio-와 diastereoselective 산화에 사이드 체인 dioxygenase;에 의해 촉매는 두 번째 regio-와 diastereoselective regiodivergent dioxygenase에 의해 촉매 산화는 1, 2-diols의 형성으로 이어질 수 있습니다. 마지막 단계에서 carboxylic 그룹의 알파 아미노산은 pyridoxal 인산 염 (PLP) decarboxylase (DC)에 의해 죽 습. 이 decarboxylative 단계 베타/감마 위치에 대체 hydroxy stereogenic 센터 유지 아미노산의 알파 탄소를만 영향을 줍니다. 결과 아미노 알콜은 광학 농축 따라서. 프로토콜의 4 개의 아미노 알콜 semipreparative 규모 합성에 성공적으로 적용 되었습니다. 반응의 모니터링 실시 했다 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 derivatization 후 1-플 루 오로-2, 4-dinitrobenzene에 의해. 고체 상 추출 (SPE)에 의해 간단 정화 받으면 우수한 수익률 아미노 알콜 (93% > 95%).

서론

Biocatalysis 제공 하는 혜택에도 불구 하 고 합성 경로 또는 총 biocatalytic 노선 biocatalytic 단계의 통합 주로 효소 키네틱 해상도 제한 남아 있습니다. 이러한 노선 비대칭 화학 효소 합성의 첫 번째 단계로 널리 사용 되었습니다 하지만 높은 stereoselectivity,12,3 기능 그룹 interconversions에 더 많은 가능성을 제공 하는 biocatalysis . 또한, biocatalytic 반응 비슷한 조건에서 실시 하 고로 그것은 가능한 한 냄비 패션4,5에서 캐스케이드 반응을 수행 하 따라서.

카이 랄 아미노 알콜은 보조 또는 유기 합성6공중 발판으로 사용 하기 위해 다양 한 분자. 아미노 알콜 moiety 이차 대사 산물 및 활성 제약 성분 (API)에 자주 발견 된다. 기본 β-아미노 알콜 랄 γ-아미노 알콜에는 기존의 화학 합성, 하지만 액세스 하 여 해당 α 아미노 산에서 쉽게 사용할 수 또는 보조 아미노 알콜은 종종 민감한 함께 지루한 합성 경로 필요 입체 화학7,8,,910의 제어 합니다. 그것의 높은 stereoselectivity 때문에 biocatalysis이 카이 랄 빌딩 블록11,12,,1314우수한 합성 경로 제공할 수 있습니다.

우리는 이전 diastereoselective 효소 hydroxylation 철 (II)의 dioxygenases에 의해 촉매에 의해 합성의 모노-및 디-hydroxy-L-lysines를 보고 / α-ketoacid-종속 oxygenase 가족 (αKAO) (그림 1)15. 특히, KDO1 dioxygenase-hydroxy 파생 (4R) 하면서 (1)-(3S)의 형성을 catalyzes L-리 신에서 시작, 파생 (2) KDO2 dioxygenase 가진 반응에 의해 형성 된다. KDO1와 KDO2에 의해 연속 regiodivergent hydroxylations-dihydroxy-L (3R, 4R)의 형성으로 이어질-광학적으로 순수한 형태로 lysine (3). 그러나,이 효소의 제한 된 기판 범위 α-아미노 그룹의 위치에 carboxylic 산 moiety 활동16를 위해 근본적으로 간단한 아민의 hydroxylation에 특히 화학 합성에 큰 사용률을 방해 한다.

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그림 1: L-리 신 Biocatalytic 변환. (3S)으로 변환-hydroxy-L-리 신 (1) KDO1 dioxygenase;에 의해 촉매 (4R)-hydroxy-L-리 신 (2) KDO2 dioxygenase;에 의해 촉매 그리고 (3R, 4R)-dihydroxy-L-리 신 (3) 캐스케이드 반응 KDO1 및 KDO2 dioxygenases에 의해 연속적으로 촉매에 의해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Decarboxylation 신진 대사17에 일반적인 반응입니다. 특히, 아미노산 Dc (EC 4.1.1) 공동 인자 없는 (pyruvoyl) 또는 PLP 의존 효소 이며 박테리아와 더 높은 유기 체18,19 에 해당 polyamines로 아미노산의 decarboxylation 촉매 , 20 , 21 , 22. hydroxylated cadaverine, L-리 신의 decarboxylation에 의해 얻은 diamine에 해당 하는 모노-및 dihydroxy 화합물 (그림 3) 4-7, 10,-11 . Cadaverine 화학 산업에 대 한 주요 빌딩 블록, 특히 폴 리아 미드와 폴리우레탄 중합체의 구성 요소입니다. 따라서,이 diamine 재생 가능 자원에서의 바이오 기반 생산 석유 기반 경로 대신 관심을 모으고 있다 그리고 다양 한 미생물이이 목적을 위해 설계 되어 있다. 이러한 대사 경로에서 lysine DC (LDC) 주요 효소 이다. LDC는 알라닌 racemase (AR) 구조 가족23에 속하는 PLP 의존 효소 이다. PLP 의존 Dc (PLP-DCs) 높은 기판 특정 알려져 있습니다. 그러나 몇 가지 효소 예를 들면 Selenomonas rumirantium (LDCSrum)에서 LDC로 L ornithine 및 L-리 신 아미노산으로 활성화 되 고 약간의 성행위의 기능을 소유 하는, 유사한 운동 상수에 대 한가 lysine과 ornithine decarboxylation24,25. 이 확장된 기질 특이성은이 효소 decarboxylation의 모노-및 디-hydroxy-L-리 신에 대 한 좋은 후보. 또한, Dc 찾을 신의 수 파생 상품으로 활성, 우리 인코딩 αKAO 효소 유전자의 genomic 컨텍스트를 검사 합니다. 실제로, prokaryotic 유전자에서 인코딩 효소 같은 생 합성 경로에 관여 하는 유전자는 일반적으로 공동 지역화 유전자 클러스터에. 공동 유전자 인코딩 putative PLP-DC (그림 2)와 지역화 ( Chitinophaga pinensis)에서 KDO2 유전자 발견. 반면, DC에 대 한 인코딩 없이 유전자 발견 되었습니다 KDO1 dioxygenase의 게놈 컨텍스트를 분석할 때. C. pinensis (DCCpin)에서 PLP DC 단백질 따라서 캐스케이드 반응의 decarboxylation 단계를 촉매를 유망한 후보자로 선정 되었다.

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그림 2: C. pinensis에 KDO2 유전자의 Genomic 맥락. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

따라서, 우리는 dioxygenases 및 아미노산 (그림 3)에서 지방 족 랄 β-및 γ-아미노 알콜의 합성을 달성 하기 위해 Dc 효소 캐스케이드 반응 설계. 이전 보고는 αKAO에 의해 촉매 C H 산화 총 diastereoselectivity;와 hydroxy 대체 stereogenic 센터 소개 Cβ/γ 카이랄성 아미노산 moiety16의 Cα 탄소에만 영향을 줍니다 decarboxylative 단계에서 유지 됩니다.

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그림 3: Retrosynthetic 분석. (R5) (4) β-및 γ-아미노 알콜 (R)-1, 5-diaminopentan-2-ol의 (A) Retrosynthesis-hydroxy-L-라이 신, 그리고 (S)-1, 5-diaminopentan-2-ol (5) 및 1, 5-diaminopentan-3-ol (6)에서 패-리 신입니다. (B) Retrosynthesis의 β, γ-β, δ-아미노 diols (2S, 3S)-1, 5-diaminopentane-2, 3-diol (10) 및 (R,S4 2)-1, 5-diaminopentane-2, 4-diol (11) 5 (R)에서 시작- hydroxy-L-라이 신, 및 (R,R3 2)-1, 5-diaminopentane-2, 3-diol (7) L-리 신에서 시작. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

패-리 신 (5R)에서 시작-hydroxy 파생, 우리 여기는 2/3 단계, 한 냄비, dioxygenases와 PLP-Dc를 대상 아미노 알콜 효소 절차 보고. 사전 종합 대상 분자의 실험실 규모에서 메서드는 반응 조건, 예를 들면, 원자재;의 전체 변환 수 있도록 하는 데 필요한 효소 농도 조정 분석 규모에서 개발 되었다 우리는 또한이 절차를 제시.

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프로토콜

1. 효소 준비

  1. 표현 하 고 앞에서 설명한26으로 단백질 정화.
    참고: 재조합 단백질 다음 최종 농도와 가져온: αKAO에서 Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1.35 mg/mL; C. pinensis, UniProtKB ID에서에서 αKAO: C7PLM6 (KDO2), 2.29 mg/mL; PLP-Dc에서 S. rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (LDCSrum), 셀 무료 12.44 mg/mL;에서 총 효소 추출 PLP-DC에서 C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (DCCpin), 2.62 mg/mL.

2입니다. 솔루션의 준비

참고: 아래의 모든 솔루션 이온된 수에 준비가 되어 있습니다.

  1. HEPES 버퍼, pH 7.5;의 1 M를 준비 5 m NaOH의 조정.
    참고: pH 조정 단계 동안 얼굴 보호 (P280), 눈 보호, 보호복, 보호 장갑 착용. 눈 (P338 P305, P351,)와 접촉, 여러 분 제거 콘택트 렌즈 가능 하면 물으로 조심 스럽게 씻어. 세 정을 계속 하 고 즉시 독극물 센터나 의사 (P310) 전화. P 코드 예방 문 참조 (위험 클래스 및 카테고리; 참조, 예를 들어, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).
  2. 100 m m L-리 신, 100 mM (5S) 준비-hydroxy-L-리 신, 150 m m α-ketoglutaric 산, 100mm 나트륨 하는데, 10mm 암모늄 iron(II) 황산 염 hexahydrate (모어 소금), 100mm pyridoxal 5-인산 염 (PLP), 및 100 m m dithiothreitol (DTT).
  3. 1 M, 2 M, 그리고 37 %HCl 솔루션 (approximatively 12 M 솔루션), 염 산 (HCl)의 6 분 2.1에 설명 된 대로 동일한 안전 지침에 따라 준비 합니다.
    참고: α-ketoglutaric 산, 나트륨 하는데, 및 암모늄 iron(II) 황산 염 hexahydrate의 솔루션 이루어져야 합니다 신선한 사용 당일. 실 온에서 몇 달 동안 리 솔루션을 저장할 수 있습니다. PLP 솔루션 4 ° c.에 한 달 동안 저장 될 수 있다 DTT 솔루션-20 ° c.에 한 달 동안 저장 될 수 있다

3. 분석 규모 반응

  1. 5 (R)의 decarboxylation 반응에 대 한 방법 개발-hydroxy-L-리 신
    1. 11 µ L HEPES 버퍼 pH 7.5의 1 M 솔루션의 추가 (최종 농도 50 m m) 2 mL microtube 하. 다음, 100 mM (5S)의 22 µ L을 추가-hydroxy-L-리 신 (최종 농도 10 m m), 2.2 100mm PLP의 µ L (최종 농도 1 m m), 및 2.2 µ L 100 mM DTT의 (최종 농도 1 m m).
      참고: 경우 LDCSrum와 반응, DTT의 추가 필요 하지 않습니다.
    2. 순화 PLP DC를 추가 (최종 농도 0.1 mg/mL). H2O 220 µ L의 최종 볼륨에 대 한 완전 한.
    3. 3 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
      참고: 반응 매체의 좋은 산소를 하면 야외에서 열린 뚜껑으로 반응 혼합물을 떨고. 따라서 반응 미디어에 산소 거품 필요가 있다.
    4. 6 단계에 설명 된 반응 모니터링 절차에 따라 분석 반응 혼합물의 10 µ L를 수집 합니다. 샘플은 가급적 derivatized 및 샘플링 후 직접 분석.
  2. 결합 한 hydroxylation 단계 PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation와 αKAO에 의해 촉매 작용을 미치는 효소 캐스케이드 반응 위한 방법 개발
    1. 11 µ L HEPES 버퍼 pH 7.5의 1 M의 추가 (최종 농도 50 m m) 2 mL microtube 하. 다음, α-ketoglutaric 산의 150 m m의 22 µ L을 추가 (최종 농도 15 m m), 5.5 µ L의 나트륨 하는데 100 m m의 (최종 농도 2.5 m m), 22 모어의 10 m m의 µ L의 소금 (최종 농도 1 m m), 그리고 L-리 신의 100 m m의 22 µ L (최종 농도 10 m m).
    2. H2O 단계 3.2.3에서에서 추가 될 효소 솔루션의 볼륨을 고려해 220 µ L의 최종 볼륨에 대 한 완전 한.
    3. 대상된 regioselectivity에 따라 필요한 정화 αKAO 효소 추가: 위치 C-4 L-리 신에 대 한 위치 C-3 또는 KDO2에에서 hydroxylation에 대 한 KDO1. 정제 효소의 최종 농도 (0.05-0.5 mg/mL) 3 h approximatively에 완전 한 변환 수 있도록 결정 했다.
    4. 3 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
    5. 2.2 µ L PLP의 100 mM의 추가 (최종 농도 ~ 1 m m) 및 DTT의 100 mM의 2.2 µ L (최종 농도 ~ 1 m m).
      참고: 경우 LDCSrum와 반응, DTT의 추가 필요 하지 않습니다.
    6. 18 h LDC: 완전 한 변환 사용 농도에 순화 된 PLP DC를 추가Srum 0.1 mg/ml KDO1, 및 DCCpin 0.5 mg/mL의 대략적인 최종 농도에서 캐스케이드 반응에 대 한 대략적인 최종 농도 KDO2와 캐스케이드 반응입니다.
    7. 18 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
    8. 3.1.4 단계와 모니터링 절차를 실행 합니다.
  3. PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation와 αKAOs에 의해 촉매 두 hydroxylation 단계를 결합 하 여 효소 캐스케이드 반응 위한 방법 개발
    1. 단계 3.2.1-3.2.2를 실행 합니다.
    2. 0.05 mg/mL의 최종 농도에 KDO1를 추가 합니다. 3 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
    3. 0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에 KDO2를 추가 합니다. 18 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
    4. 3.2.5 단계를 실행 합니다.
    5. 0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에서 순화 PLP DC DCCpin 을 추가 합니다. 18 h 300 rpm에서 야외에서 열린 뚜껑으로 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
    6. 3.1.4 단계와 모니터링 절차를 실행 합니다.

4. 반 대리점 한 냄비 Biocatalytic 반응

참고: 효소 반응 노천 250 mL 유리 10 ml 전체 볼륨에 대 한 삼각 플라스 크에에서 0.1 mmol의 L-리 신에 수행 됩니다.

  1. Monohydroxylated 유도체의 합성
    1. 1 M HEPES 버퍼, pH 7.5의 0.5 mL을 추가 (최종 농도 50 m m) 플라스 크에. 다음, 100 m L-리 신 m 1 개 mL를 추가 (최종 농도 10 m m), 150 m m α-ketoglutaric 산의 1 mL (최종 농도 15 m m), 100 mM 나트륨 하는데의 0.25 mL (최종 농도 2.5 m m), 그리고 10 mM 모어의 1 mL의 소금 (최종 농도 1 m m).
    2. H2O 10 mL, 4.1.3 단계에서 추가 될 효소 솔루션의 볼륨을 고려의 마지막 볼륨에 대 한 완전 한.
    3. 대상된 regioselectivity에 따라 필요한 정화 αKAO 효소 추가: 0.075 m g/l L-리 신의 위치 C-4 0.5 mg/mL의 최종 농도에서 C-3 또는 KDO2 위치에 hydroxylation의 최종 농도에 KDO1. 정제 효소의 최종 농도 3 h approximatively에 완전 한 변환 수 있도록 결정 했다.
    4. 적절 한 기간 동안 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어. 때 완료 된 hydroxylation 반응 (반응 프로토콜 모니터링에 대 한 6 단계에 자세히 설명 하는 모든 단계를 실행 하는)를 나타냅니다 반응 모니터링, 4.1.5 단계로 진행 합니다. 전형적인 반응 시간은 3 h 이다.
    5. ΑKAO 반응 혼합물에 100mm PLP의 100 µ L를 추가 (최종 농도 ~ 1 m m). 그런 다음, 100 mM DTT의 100 µ L를 추가 (최종 농도 ~ 1 m m), LDCSrum사용 하는 경우를 제외 하 고.
    6. 순화 PLP-DC 추가: LDCSrum KDO1 또는 KDO2와 캐스케이드 반응에 대 한 0.5 mg/mL의 대략적인 최종 농도에서 DCCpin 캐스케이드 반응에 대 한 0.05 mg/mL의 대략적인 최종 농도에서.
    7. 실내 온도에, 18 h 300 rpm, 반응 혼합물을 흔들어 고 직접 단계 4.3에에서 대 한 자세한 단계를 계속 합니다.
  2. Dihydroxylated 유도체의 합성
    1. 1 M HEPES 버퍼, pH 7.5의 0.5 mL을 추가 (최종 농도 50 m m), 100 m L-리 신 m의 1 mL (최종 농도 10 m m), 150 m m α-ketoglutaric 산의 1 mL (최종 농도 15 m m), 100 mM 나트륨 하는데의 0.25 mL (최종 농도 2.5 m m) 그리고 10 mM 모어의 1 mL의 소금 (최종 농도가 1 m m). H2O 10 mL, 4.2.2 단계에서 추가 될 효소 솔루션의 볼륨을 고려의 마지막 볼륨에 대 한 완전 한.
    2. 0.075 mg/mL의 최종 농도에 KDO1를 추가 합니다. 적절 한 기간 동안 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
    3. 때 완료 된 hydroxylation 반응 나타냅니다 반응 모니터링 (프로토콜을 모니터링 하는 반응에 대 한 6 단계 참조), 4.2.5 단계로 진행. 전형적인 반응 시간은 3 h 이다.
    4. 150 m m α-ketoglutaric 산의 1 mL를 추가 (최종 농도 15 m m), 100 mM 나트륨 하는데의 0.25 mL (최종 농도 2.5 m m), 그리고 10 mM 모어의 1 mL의 소금 (최종 농도 1 m m).
    5. 0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에 KDO2를 추가 합니다. 18 h 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
    6. 때 완료 된 dihydroxylation 반응 나타냅니다 반응 모니터링 (프로토콜을 모니터링 하는 반응에 대 한 6 단계 참조), 4.2.7 단계로 진행. 전형적인 반응 시간은 18 h 이다.
    7. DTT의 100 m m의 100 µ L를 추가 (최종 농도 ~ 1 m m), LDCSrum사용 하는 경우를 제외 하 고.
    8. 0.5 mg/mL, 초기 반응 볼륨을 사용 하 여 계산의 대략적인 최종 농도에서 순화 된 DCCpin 을 추가 합니다.
    9. 18 h 300 rpm에서 실 온에서 반응 혼합물을 흔들어.
  3. 냉각
    1. 얼음 목욕에서 250 mL 유리 삼각 플라스 크를 배치 하 여 반응 혼합물을 식혀.
    2. 신중 하 게, approximatively 1 분, 0.25 mL 6 M HCl 수동으로 부드럽게 흔들어 냉각된 반응 혼합물의 이상 추가 합니다. 2.1 단계에서 설명한 대로 동일한 안전 지침을 따르십시오.
    3. 50 mL 원뿔 바닥 원심 분리기로 산 성 혼합물 튜브 전구, 파스퇴르 피 펫 장비는 유리를 사용 하 여 전송 다음 1680 x g와 15 분 동안 4 ° C에서 원심.
    4. 철회는 상쾌한 고 250 mL 둥근 바닥 플라스 크에 옆으로 계속.
    5. 펠 릿을 포함 하는 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브에 이온을 제거 된 물 10 mL를 추가 합니다. 다시는 펠 릿을 일시 중단 하는 소용돌이.
    6. 1680 x g에서 원심 분리기, 4 ° C, 15 분.
    7. 철회는 상쾌한 고 첫 번째 상쾌한 (4.3.4 단계)를 포함 하 250 mL 둥근 바닥 플라스 크에 추가 합니다.
    8. 소용돌이, 지속적인 손으로 수집된 supernatants 액체 질소에는 플라스 크의 침수로 고정 하 고 벤치탑 매니폴드 녹고에서 물자를 방지 하기 위해 동결 건조 기에 플라스 크를 즉시 전송.
    9. 완료 된 후 동결 과정 (야간), 동결 건조 기에서 플라스 크를 제거 합니다.

5. 정화 조 효소 반응 혼합물에서 아미노 알콜의

  1. 이온 교환 수 지
    1. 수성 0.1 m HCl (approximatively 4 mL)의 최소 금액에 동결된 제품을 용 해 고체 입자는 더 이상 벌 거 벗은 눈을 볼 수 때까지.
    2. 방출 대기압에서 1 M HCl (4 열 볼륨) 0.1 뒤 여는 술 폰 산 기능 그룹 양이온 교환 수 지, 유리 열 (20 x 250 m m)에 200-400 메쉬 조건 M HCl (4 열 볼륨; 열 볼륨 10 mL =).
    3. 신중 하 게 사용 하 여 1000 µ L micropipette 유리 열 벽에 수 지의 상단에 샘플을 로드 합니다. 다음, 린스 조 제품을 포함 하는 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브 세 번 1 mL 0.1 M HCl 용액 당의 세척와 같은 방법으로 열에 결과 린스 볼륨을 로드.
    4. 비-선형으로 elute 그라데이션: 4 열 양의 0.1 M HCl, 4 열 양의 물, 4 열 양의 5% NH4오, 4 열 양의 10% NH4오, 4 열 양의 15% NH4오, 4 열 양의 20% NH4오 4 열 양의 25% NH4오 및 마지막으로 4 열 28% NH4오의.
    5. HPLC에 의해 정화 모니터링 (6 단계 참조).
    6. 수영장 분수 화합물 (NH4오 20-28%)를 포함 하 고 단계 4.3.8-4.3.9에 설명 된 대로 freeze-dry.
      참고: 이온 교환 열 이온 물 차입 물 (approximatively 50 mL) 1 m HCl의 50 mL와 함께 방출 하 여 가공 뒤의 중립화로 차입 후 다시 수 있습니다.
  2. SPE
    1. H3포4/water (20 µ L/mL)의 2 ml approximatively 동결된 화합물 solubilize
    2. 장소는 혼합된 모드 양이온 교환 SPE 6 mL-카트리지 추출 매니폴드에 물 펌프에 연결. 매니폴드에서 제공 하는 감압에서 메탄올의 조건 4 mL를 통해 여 카트리지. H3의 4 mL를 통해 포4/water (20 µ L/mL) 여 카트리지를 equilibrate.
    3. 유리 열 벽에 수 지의 상단에 1000 µ L micropipette를 사용 하 여 카트리지에 샘플을 로드 하 고 세 번 세척 당 H3포4/water (20 µ L/mL)의 0.75 mL와 함께 제품을 포함 하는 유리병을 씻어. 같은 방법으로 열에 결과 린스 볼륨을 로드 합니다.
    4. 매니폴드, 2%의 4 mL를 제공한 감소 압력 방출 하 여 카트리지를 씻어 HCOOH 물, 그리고 물 4 mL와 함께. NH4물에서 오의 그라데이션으로 elute (4% NH4오에서에서 시작 각 차입에 대 한 4 mL: 10%, 15%, 15%, 20%, 및 28%).
    5. 6 단계에 설명 된 프로토콜을 모니터링 하는 반응에 따라 각 분수를 분석 하 여 HPLC에 의해 정화를 모니터링 합니다. 자외선 (UV) 크로마에 따르면 순수 원하는 파생 상품을 포함 하는 모든 분수를 유지 하 고 5.2.6 단계로 진행.
    6. 수영장 원하는 포함 된 분수 100 mL 둥근 바닥 플라스 크에 복합, 물으로 분수를 포함 하는 튜브를 헹 구 고 린스 볼륨 100 mL을 추가 둥근 바닥 플라스 크.
    7. 40 ° C에서 온도 물 목욕 주전자를 장착 하 고 10 mbar에서 진공 펌프에 연결 된 회전 증발 기를 사용 하 여 감소 압력에서 용 매를 제거 합니다.
    8. 물의 최소 볼륨에서 솔리드를 solubilize 고 무게 25 mL 둥근 바닥 플라스 크에 솔루션을 전송. 린스 물 최소 볼륨으로 플라스 크 25 mL 플라스 크에 린스 볼륨을 추가 하 고 5.2.9 단계로 진행.
    9. 정화 제품 무게 하 고 수익률을 계산 합니다.
    10. 고체 입자는 더 이상 벌 거 벗은 눈을 볼 수 때까지 2 m HCl의 최소 볼륨에서 정화 제품을 녹이 고 단계 4.3.8-4.3.9에 설명 된 대로 freeze-dry.
      참고: 아미노 알콜 민감한 화합물 및 그들의 염 산 염 소금으로 유지 됩니다.

6. 반응 모니터링 및 제품 분석

  1. 기판 및 HPLC 분석에 앞서 제품의 derivatization
    참고: 기판 및 제품 증가 그들의 UV 컬럼에 detectivity 방향족 유도체로 derivatized를 해야 합니다. 1-플 루 오로-2, 4-dinitrobenzene (DNFB) 사용 했습니다. 각 샘플은 derivatization 직후는 HPLC에 주입 했다.
    1. 효소 반응 및 전송의 10 µ L 1.5 mL microtube 가져가 라. 에탄올에 0.25 m NaHCO3 수성 해결책의 10 µ L, 에탄올, 100 µ L 및 DNFB 솔루션의 2.5 mg/mL의 30 µ L를 추가 합니다.
    2. microtube 닫고 1000 rpm에서 65 ° C에서 1 시간에 대 한 결과 솔루션을 흔들어. 10 µ L로 끄다 1 M HCl의.
    3. 0.22 μ m 기 공 크기 친수성 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막 1 mL 루어 주사기를 사용 하 여 4 m m 직경 비 멸 균 주사기 필터를 통해 필터링.
  2. Derivatized 아미노산 분리의 모든 시스템을 사용 하 여 dioxygenase 반응의 모니터링을 수행 합니다. 이 프로토콜 dinitrobenzene (DNB) 발 색 단 그룹27여 derivatized 아미노산의 자외선 탐지를 포함 한다.
    1. 유통 silyl endcapping 반전된 단계 열 (5 µ m, 3 x 150 m m)와 C18와 HPLC를 맞습니다.
    2. (과) eluent B C18 열 equilibrate (MeCN + 0.1 %TFA) eluent A (H2O + 0.1 %TFA) (approximatively 20 열 볼륨에 해당) 15 분 동안 35 ° C의 1 mL/min 흐름 속도로.
    3. 10 µ L derivatized 반응 혼합물의 주입 (단계 6.1 참조) HPLC C18 열에. MeCN, 0.1 %TFA / H2O와 0.1%의 혼합물을 사용 하 여 선형 그라데이션으로 eluent로 TFA (9 분, 온도 35 ° C에에서과 하 비과 흐름 1 mL/min).
    4. UV 탐지 400 설정을 사용 하 여 크로마 열에 eluted 제품 분석 nm. DNB lysine은 일반적으로 약 6.5 분, hydroxylated DNB-신 약 5.5 분, DNB-신 약 4.2 분, dihydroxylated 및 DNB-aminodiol 약 5.3 분을 elutes.

7. NMR 분석의 정화 아미노 알콜

  1. D2O 정화 아미노 알콜 분해 (700 µ L) 핵 자기 공명 (NMR) 튜브를 솔루션을 전송.
  2. 1H 및 13C NMR 스펙트럼에 따라 적절 한 NMR 시설 프로토콜28습득.

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결과

우리가 이전에 보고 된 합성의 모노-및 디-hydroxy-L-lysines diastereoselective 효소 hydroxylation 철 (II)의 dioxygenases에 의해 촉매에 의해 / αKAO 가족 (그림 1)16. PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation 단계 뒤는 αKAO에 의해 촉매는 하나 또는 두 개의 hydroxylation 단계를 결합 하는 여기, 전체 폭포의 프로토콜 최적화 반응 조건 모두의 요구 사항을 충족 조정 되었다 효소 반응입니다. 우리는 두 개의 Dc, LDCSrum 및 DCCpin, 상용 (5R)으로 활동을 조사 하 여 시작-hydroxy-L-리 신. 다음 우리는 적절 한 αKAO에 의해 촉매 산화 단계 캐스케이드에서 모노 파생 상품, 3-hydroxy-L-라이 신 (<...

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토론

카이 랄 아미노 알콜 및 파생 상품 유기 합성 제약 치료에 대 한 카이 랄 조력자에서 응용 프로그램의 넓은 범위가 있다. 아미노 알콜 기존의 유기 합성에 의해 생산을 위한 다단계 합성 수많은, 하지만 않을 수 있습니다 항상 효율적인 입체 화학16의 민감한 컨트롤과 함께 지루한 보호/deprotection 단계. Biocatalytic 접근 보호/deprotection 단계 dispenses 이며 일반적으로 매우 stereoselective 좋은 대안을 나타냅니다.

이전 작업 동적 운동 비대칭 변환 (DYKAT)에 의해 2-phenylethan-1-아민의 백본와 다양 한 β-아미노 알콜의 합성을 보고. 이 경로에서 hydroxy 대체 stereogenic 센터 aldolisation benzaldehyde와 파생 상품, 트레오닌 aldolase에 의해 촉매에 의해 소개 되었다. 낮은 diastereoselectivity 및 적당 한 수익률...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 유익한 토론에 대 한 베로 니 크 드 Berardinis와 알랭 Perret, 크리스틴 Pellé, 및 기술 지원에 대 한 페 기 Sirvain 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
HEPES시그마 알드리치H3375
L-라이신 염산염시그마 알드리치L5626
(5S)-하이드록시-L-라이신시그마 알드리치GPS NONH아웃 소싱
알파;-케토글루타르산시그마 알드리치75892
아스코르브산나트륨 시그마 알드리치A7631
암모늄 철(II) 황산염 육수화물아크로스201370250
피리독살 포스페이트(PLP)시그마 알드리치82870
3,4-디머캅토부탄-1,2-디올(DTT)시그마 알드리치D0632
1-플루오로-2,4-디니트로벤젠(DNFB)시그마 알드리치D1529
에탄올VWR20825.290
나트륨 탄산수소시그마 Aldrich71631
HCl 37%Sigma Aldrich435570
HCl 0.1MFluka35335
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MSVWR83640.320
2,2,2,2-trifluoroacetic acidVWR153112E
암모니아 28%VWR21182.294
LC-MSVWR83638.32
포름산아크로스270480010
인산 85 %아크로스201145000
중수소 산화물아크로스320,710,075
NaOH시그마 AldrichS5881
C18 HPLC 컬럼Phenomenex00F-4601-Y0
Accela UHPLC 시스템ThermoFisher Scientific
Accela PDA 검출기ThermoFisher Scientific
4mm 주사기 필터 - 0,22µ m - PVDFMerckSLGVR04NL
ml 눈금이 있는 일회용 투베르쿨린 주사기, Luer 팁VWRHSWA5010.200V0
양이온 교환 수지 100-200  meshSigma Aldrich217506
혼합 모드 양이온 교환 고체상 추출 카트리지 6 mLWaters186000776
추출 매니폴드WatersWAT200609
회전 증발기Bü chi531-0103
동결 건조기 알파 1-2 LDplus그리스도L083302
마이크로 피펫 20 &마이크로; LEppendorf3121000031
Micropipette 100 µ LEppendorf3121000074
Micropipette 500 &마이크로; LEppendorf3121000112
Micropipette 1000 &마이크로; LEppendorf3121000120
300 MHz 분광계Bruker
2 mL 마이크로튜브CLEARLineCL20.002.0500
50 mL 코니컬 바닥 원심분리기 튜브Fischer Scientific05-539-8
25 mL 둥근 바닥 플라스크 14/23Fischer Scientific10353331
100 mL 둥근 바닥 플라스크 29/32Fischer Scientific11786183
250 mL 둥근 바닥 플라스크 29/32Fischer Scientific11786183
250 mL 삼각 플라스크Fischerbrand15496143
&

참고문헌

  1. Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
  2. Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  3. Turner, N. J., O'Reilly, E. Biocatalytic retrosynthesis. Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).
  4. Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. Enzyme catalysed tandem reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).
  5. Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).
  6. Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. 1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis. Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).
  7. Abiko, A., Masamune, S. An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4. Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).
  8. McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).
  9. Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles. Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).
  10. Colomer, I., et al. Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries. Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).
  11. Steinreiber, J., et al. Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation. Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).
  12. Steinreiber, J., et al. Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations. Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).
  13. Kohls, H., et al. Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction. Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).
  14. Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114 (0), 65-71 (2015).
  15. Martinez, S., Hausinger, R. P. Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases. J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).
  16. Baud, D., et al. Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds. ChemCatChem. , (2014).
  17. Suzuki, H., Kurihara, S. Ch. 4. Polyamines. Kusano, T., Suzuki, H. 4, Springer Japan. 47-59 (2015).
  18. Kind, S., Wittmann, C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).
  19. Schneider, J., Wendisch, V. F. Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).
  20. Qian, Z. -G., Xia, X. -X., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).
  21. Shin, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives. Microb. Cell. Fact. 13, (2014).
  22. Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum. Metabolites. 5 (2), 211(2015).
  23. Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies. Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).
  24. Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).
  25. Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).
  26. Baud, D., et al. Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation. Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).
  27. Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).
  28. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy (2017).
  29. Hibi, M., Ogawa, J. Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).
  30. Hüttel, W. Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).
  31. Kourist, R., Guterl, J. -K., Miyamoto, K., Sieber, V. Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources. ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).
  32. Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases. J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).
  33. Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis. ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).

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