마우스에 부분적 담 관 결 찰: 지역화 된 폐쇄성 Cholestasis의 제어 모델

Summary

여기, 선물이 간 부상 및 설치류에서 중생의 외과 모델로 부분 담 관 결 찰.

Abstract

설치류, 일반적인 담 관의 완전 한 담 관 결 찰 (cBDL)에서는 폐쇄성 cholestasis 및 담 즙 덕트 확산 연구 설립된 수술 방법입니다. 그러나, 장기 실험 증가 병 적 상태와 사망률 이어질 수 있습니다. 선택 마우스 기본 간 질환과 긴장, 의미 있는 비교 동물 손실 및 비용을 줄일 수 있는 간, 단일 엽의 결 찰으로도 만들 수 있습니다. 여기, 우리 왼쪽된 엽만 하지 나머지 돌출부에 담 즙 방해를 일으키는 부분 담 관 결 찰 (pBDL)는 간 담 즙 덕트 왼쪽된만 출혈은, 마우스에서 설명 합니다. 주의 microsurgical 기법, pBDL 실험 수 비용, 같은 동물에 동일한 조건을 복종 때 unligated 엽 합자 돌출부를 내부 통제 역할 때문. CBDL, 달리 별도 운영 하는 가짜 제어 그룹 필요 하지 않습니다. pBDL은 cholestasis 및 기타 유지 담 즙 구성 요소 조직의 효과 대 지역화 직접 비교에 매우 유용 합니다. pBDL 또한 메커니즘 약물 및 세포 마이그레이션에 관련 된 조사를 새로운 방법으로 repurposed 수 있습니다.

Introduction

급성 간 손상 및 수리, 부분 hepatectomy 등 일반적인 담 관 결 찰 (cBDL)의 외과 모델 간 재생 pathobiology^1,2를 공부 하 고 설치류에 수십 년 동안 사용 되었습니다. CBDL에서 일반적인 담 관 (간에 서 생산 하는 모든 담 즙을 빼낸)는 출혈, 폐쇄성 cholestasis, 염증과 섬유 증 수술, 간 경 변³최종 진행 후 첫 2-3 주에 결과. 담 즙 덕트 확산, transdifferentiation, 및 주민 간 조상 세포의 유도 또한 cBDL^4,5의 기능. 비록 cBDL 보통 잘 재현할 결과 야생-타입 마우스와 정상적인 간 은^6,,78그 긴장 특징이 있는 폐쇄성 cholangiopathy의 특정 메커니즘에 절차는 높은 사망률 및 사망 시간이 지남에 담 즙 방해의 예상 보다 더 많은 동물을 요구 하는 간 질환의 일부 유전자 변형 마우스 모델에 기술적으로 요구 될 수 있습니다. 이 기술은 또한 유전자 변형 생쥐 기본 간 질병, 그렇지 않으면 장기간된 시간 과정 실험 cBDL 다음의 스트레스를 용납 하지 않을 수 있습니다 공부에 대 한 도움이 됩니다.

pBDL는 이러한 문제 들을 극복할 수 있도록 적당 한 대안을 제공할 수 있습니다. 초기 pBDL 로컬 행동 및 조직의 염증⁹의 중재자를 구별 하는 목적으로 야생-타입 쥐에 있는 학문. PBDL에서 일반적인 담 관 위에 좌우 간 담 관의 담 즙 주 합류는 hilum에서 신중 하 게 시각 이다 고만 왼쪽된 간 담 즙 덕트 지역화 된 폐쇄성 cholestasis 생성 하 출혈. pBDL은 cBDL에 여러 이점을 제공합니다. PBDL에서 unligated 오른쪽 엽 합자 왼쪽된 엽, 영양 상태 등 요소를 순환 같은 조직의 효과를 받게에 대 한 동일 하 게 일치 하는 내부 통제 역할을 합니다. 조직 프로-염증 성 중재자 존재 했지만, 오 사와 외 적은 섬유 증 및 unligated 돌출부에 괴 사를 관찰 하지만 염증 성 세포와 변형 성장 인자-β 표현의 합자 엽⁹증가.

더 최근에, pBDL는 유지 담 즙¹⁰간 parenchymal 효과 연구 재정의 되었다. 내부 제어 (unligated "가짜") 및 실험적인 그룹 같은 동물을 사용 하 여 pBDL는 효과적으로 차례 차례로 더 비용 효율적인 실험 당 필요한 동물의 수를 반. 이상적인 시간 과정 실험 (≥2 주) 합자 엽에서 달성 될 수 있다 그래야 쥐 훨씬, pBDL의 효과 용납. 가장 중요 한 것은, pBDL의 폐쇄성 cholestasis 직접 intrahepatic 효과 구분할 수 있습니다 하 고 합자 엽, unligated 제어 엽에 비해 담 즙 구성 요소를 유지. 전반적으로, pBDL 간에서 지역화 cholestasis의 엽 특정 효과 공부 하는 매력적인 방법입니다.

Protocol

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 피츠버그 대학교의 윤리 지침에 따라 실시 했다.

1. 기본 기술 및 공통 절차

1. 압력솥 사용 하기 전에 모든 microsurgical 장비.
2. 마우스 마 취에 의해 살해를 방지 하려면 신중 하 게 그것의 호흡 패턴을 확인 합니다.
3. 터치 기관 및 내장 기관 손상 및 출혈을 일으키는 방지 하기 위해 가능한 한 작은. 젖은 면봉 이나 거 즈 스폰지 출혈 포인트를 누릅니다.
4. 젖은 면봉을 사용 하 여 장기의 부드러운 조작. 3.5 × 3.5 cm 및 6.0 × 6.0 cm. 작은 하나를 사용 하 여 전체 간 안전 거리를, 젖은, 비-짠 거 즈 스폰지 2 개 크기에서 사용 된다. 더 큰 하나를 사용 하 여 크고 작은 창 자 하.

2. presurgical 준비

1. 남성 c57/b6 쥐, 부분적 담 관 결 찰에 대 한 (때 몸 무게는 약 20-35 g) 나이의 8-12 주를 사용 합니다.
2. 마 취의 유도까지 쥐 물과 음식에 대 한 무료 액세스를 허용 합니다.

3. 부분 담 관 결 찰 수술

1. 1.5-2.0 %isoflurane 및 1 L/min 산소의 혼합으로 유도 챔버에서 동물을 넣어 마우스를 anesthetize. 호흡 속도 관찰 하 여 동물을 신중 하 게 모니터링 합니다. 동물의 호흡 속도 초당 한 호흡, 마우스 잘 마 취입니다. 앞 다리 철수 반사는 더 빠르게 사라집니다, 이후 철수 반사의 완전 한 부재를 확인 뿐만 아니라 뒷 다리 발 핀치. 눈 각 막 궤 양을 방지 하기 위해 안과 윤 활 에이전트와 기름을 바른 다 한다. 참고 진통제의 그 첫 번째 복용량 통증 수용 체의 자극을 방지 하기 위해 수술 전 주어질 수 있다.
2. 헤어 클리퍼 스로 복 벽을 면도 하 고 수술 현미경 수술 테이블에 마우스를 놓습니다. 테이프와 함께 테이블에 모든 사지를 수정 합니다. Isoflurane 흡입을 사용 하 여 전신 마 취 아래 마우스를 유지.
   1. Isoflurane 기화 기를 조정 하 고 유도 2.0-3.0 %isoflurane 사용 합니다.
3. 복 벽을 소독 멸 균 면봉을 사용 하 여, 먼저 0.3-0.5 mL povidone-요오드 응용 몸에 붙이기, 70% 에탄올에 의해 따라. 동물 살 균 드 레이프와 함께 처리 되어야 합니다.
4. 긴 중간 복 부 절 개를 고 칼에서 Adson 집게와가 위를 사용 하 여 액을 확인 합니다. 복 부 절 개 후, 줄일 isoflurane 0.8-1.0% 유지 보수에 대 한.
5. 마이크로-견인을 사용 하 여 복 부 구멍을 노출 합니다. 모기 겸 자는 칼 잡고 하 고 마우스의 머리 쪽으로 철회. 모기 겸 자 부드러운 흙을 사용 하 여 장소를 수정 했다.
6. 따뜻하게 (37 ° C)의 1-2 mL를 주입 멸 균된 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 복 부 장기 부상 방지 하려면 복 부 구멍으로. 젖은 면봉으로 소장 누른 부드럽게 마우스의 머리 쪽으로 그들을 취소 합니다. 작은 창 자, 작은 창 자 (그림 1A) 부상 피하려고 retroperitoneum 사이 인 대를 잘라.
7. 랩, 비-짠 젖은 거 즈 스폰지와 크고 작은 창 자. 복 부 구멍의 꼬리 쪽에 넣어. 멸 균 거 즈에 싸서 내장 오염을 피하기 위하여 메 마른 draped 필드에 배치할 수 있습니다.
8. 부드럽게 간 hilum와 성질과 십이지 장 인 대 (그림 1B)에 작은 젖은 비 짠 거 즈 스폰지를 사용 하 여 전체 간으로는 칼을 철회.
9. 간장 hilum의 것인지 확인 합니다. 일반적인 담 관은 포털 정 맥의 복 부 측에 있습니다. 오른쪽 및 왼쪽된 간 담 관 간 hilum에서 주요 담 즙 합류에 드레인의 위치를 확인 합니다.
10. 왼쪽된 간 담 즙 덕트는 왼쪽된 엽 빼낸 식별 하 고 10-0 나일론 봉합 봉합 바늘 (그림 2A)의 무딘 사이드를 사용 하 여 함께 그것을 둘러싸 자. 문맥, 간 동맥, 및 간 표면 부상 하지 마십시오.
11. 10-0 나일론 왼쪽된 담 관 선 (그림 2B)입니다.
12. 젖은 면봉을 사용 하 여 크고 작은 창 자 작업 이전에 같은 위치에 배치 합니다.
13. 장 비틀림 및 내부 복 부 출혈, 확인 후 근육과 4-0 vicryl와 2 개의 층에 피부를 닫습니다. 꼰된 봉합 (Vicryl) 피부 폐쇄를 위해 사용 되었다 그러나 monofilament 감염의 가능성을 줄이기 위해 선호 된다.
    참고: 액, 하 칼에서 지속적인된 봉합 하 여 근 막 닫고 액에서 칼에 계속된 봉합 하 여 피부를 닫습니다.
14. 절 개를 닫은 후 마 취를 중지 합니다.

4. 수술 후 치료 및 후속

1. 그냥 수술 후, 마우스의 등 쪽 피부를 꼬 집 고 주사 Buprenex (0.1 mg/kg) 및 Cefazolin (100mg/kg), 피하 주입에 의해 Buprenex 모든 12 h 3 일, 그리고 Cefazolin에 대 한 모든 24 h 3 일 뒤에 각각^{11,12 ,13}. 참고 진통제의 그 첫 번째 복용량 통증 수용 체의 자극을 방지 하기 위해 수술 전 주어질 수 있다. Cefazolin 및 다른 요정 요원 항생제만 이식 연구에 사용 된 같은 면역 억제 동물에 대 한 필요 하다.
   참고: 경우에 수술을 성공적으로 수행 하 고, 마우스 일반적으로 복구 30 분 이내 쥐의 활동 거의 수술 전 상태와 동일 있을 것입니다.
2. 고통의 어떤 표시 든 지를 위한 매일 쥐를 확인 하십시오.
   1. PBDL 후 간 및 정의 된 시간 점 (즉, 7, 14, 21 일)에서 다른 조직 샘플을 조달 전신 마 취하에 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 희생.

Results

이 전형적인 실험에 대 한 pBDL (A1AT) 알파-1 antitrypsin 결핍에서 발견 인간의 간 질환 정리는 triplicate 피 즈 유전자 변형 생쥐에서 수행 되었다. 피 즈 마우스 overexpresses transgene 조각의 여러 genomic DNA의 돌연변이 인간 A1AT 유전자, introns 및 업스트림 및 다운스트림 영역^{14, 측면의 ~ 2 kilobases 발기인의 코딩 영역을 포함 하는 구성 된 15}. 정상적인 A1AT 간에서 생산 분 비 혈 청 단백질 이다. A1AT의 돌연변이 형태 간 독성 스트레스를 일으키는에 자발적으로 누적 되는 불용 성 단백질 집계를 생성 합니다. 실험 3 달 오래 된 남성 피 즈 쥐, 단백질 집계 봉우리¹⁶이 질병의 가장 심각한 표현 형 표현 활용.

Discussion

CBDL cholestasis 폐쇄성에 대 한 가장 일반적인 실험 기술 이지만, 그것은 설치류에 여러 과제를 제시할 수 있습니다. 끝점을 달성 하는 데 필요한 수술 일 수에 따라 동물 중요 한 병 적 상태와 사망률 진행으로 경험할 수 있습니다. 조직 상해 및 담 즙 괴 사 정도 간 질병의 비정상적인 간 실질 및 기준선에서 기능을 설명 하는 몇 가지 유전자 변형 마우스 모델에서 작업할 때 더 악화 됩니다. CBDL에 비해, pBDL의 보고서는, 하지만이 기술은 부정적인 결과 및 동물 손실을 줄이기 위해 선택 실험에서 다른 방법으로 적용 될 수 있다.

PBDL 방법에 있는 변이 또한 보고 되었다. 하인리히 외의 방법에는 외부 곡선된 바늘 합자 일반적인 담 관 및 바늘¹⁷주위 다음 일반적인 담 관에 인접 한 배치 됩니다. 바늘은 다음 복 부 벽 폐쇄, 담 관¹⁷의 좁게 루멘 (...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
현미경-Leica Wild M650, 6– 40&회; 확대	Leica Microsystems	n/a
Tec 3 이소플루란 깔때기 채우기 기화기	일반 마취 서비스	n/a
스티븐스 테노토미 가위	정확한 수술 & Scientific Instruments Corporation	ASSI.9193
Adson 집게	미세 과학 도구	11006-12
모기 클래식 섬세한 지혈 집게	Codman	30-4472
마이크로 견인	머독; Roboz 수술 기구	RS-6550
부직포 거즈 스폰지	Fisherband	870-PC-DBL
청교도 6" 나무 손잡이가 있는 작은 면 면봉	Puritan Medical Products Company	868-WCS
Dumont SS 펜치 - 표준 팁/스트레이트/이녹스/13.5cm	세밀 과학 도구	11203-23
듀몬트 SS 포셉스 - 표준 팁/각도 45도;/이녹스/13.5cm	세밀 과학 도구	11203-25
Vannas 스프링 가위 - 3mm 커팅 엣지	세밀 과학 도구	15000-00
마이크로니들 홀더	Aesculap 수술 기구	FD231R
Micro ARO봉합사, 멸균 10-0 나일론 봉합사, 70 µ m, TAP 포인트	AROSurgical Instruments Corporation	T4A10N07
4-0 Vicryl	Ethicon	J662H
5-ml 주사기	BD	309646
Falcon 조직 배양 접시, 60 × 15 mm	Corning	353002
Isoflurane, 미국 약전 (USP) 액체 흡입, 250 ml	Piramal Healthcare	NDC 66794-017-25
Buprenex 주사 가능한 (부프레노르핀 염산염)	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals	NDC 12496-0757-1
주입용 Cefazolin, USP	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-238-61
PVP 스크럽 솔루션 (povidone– 요오드 7.5%)	Medline	NDC 12496-0757-1
70% 에탄올	Decon Labs	2716
칼슘 또는 마그네슘 없는 인산염 완충 식염수	LONZA	17-516F
Sirius Red	Sigma	365548
Hematolxylin	Fisher (Richard-Allan Scientific)	22-050-111 (7211)
Eosin	Anatech (Fisher)	832 (NC9686037)
포르말린	피셔	SF100-20