Lignification 역학 클릭 화학 식물에서 시각화: 행복은 듀얼 라벨!

요약

블 리스, lignification 역학 공부에 대 한 이중 라벨 프로토콜 개발 되었다. 합성 monolignol를 사용 하 여 기자와 SPAAC 및 CuAAC bioorthogonal의 순차적 결합 반응,이 방법론 포장 lignins에서 planta에의 속 규제 요인의 심층 분석 하는 방법 클릭 합니다.

초록

리그 닌은 지구상에서 가장 널리 퍼진 biopolymers 중 lignocellulosic 바이오 매스의 주요 구성 요소. 이 페 놀 폴리머 개발 및 더 높은 식물의 생활에 중요 한 구조 및 보호 역할을 하고있다. Lignification 프로세스에서 vivo에서 강력 하 게 규제 하는 복잡 한 메커니즘에 영향을 많은 식물 유래 제품의 산업 어, 비록 과학계는 여전히 그들을 해독 하기 위해 갈 길이 있다. 간단한 3 단계 워크플로에서 여기에 소개 하는 듀얼 라벨 프로토콜 bioimaging 연구를의 적극적으로 식물 조직의 영역을 lignifying 수 있습니다. 첫 번째 단계는 2 명의 독립적인 화학 기자, lignin H와 G 단위를 두 개의 네이티브 monolignols의 대리 모 알선 대사 관에 구성 되어 있습니다. 리그 닌 고분자 성장으로 설립, 후 각 기자 특별히 bioorthogonal SPAAC/CuAAC 클릭 반응의 순차적 조합을 통해 그것의 자신의 형광 프로브 표시 다음 됩니다. 리그 닌 autofluorescence와 결합,이 방법은 식물 세포 벽 내의 리그 닌의 3 색 지역화 맵 생성 공초점 형광 현미경 검사 법에 의해 고 활성의 유무에 정확한 공간 정보를 제공 합니다. 식물 조직, 세포와 다른 세포 벽 층의 규모에 lignification 기계.

서론

지난 2 년간 화학 기자 전략 역학과 비 유전자 인코딩된 생체의 기능을 조사 하기 위해 강력한 2 단계 방법론으로 떠오르고 있다. ^{1 , 2 , 3} 이 전략에서- 화학 기자 -작은 변조에 대 한 관심의 biomolecule의 합성 아날로그는 먼저 대사 살아있는 유기 체 그리고 화학 조사에 의해 (예., fluorophore 형광에 대 한 confocal 현미경 검사 법 영상) covalently bioorthogonal 클릭 화학을 통해 통합된 기자에 연결 됩니다. 조사 신속 하 고 구체적으로 반응 해야 합니다 생활 시스템에 어떤 생체 불활성 하면서 소개 화학 수정. 많은 방법에서는,이 방법은 그로 인하여 대사 산물 또는 이전 접근 되지 않은 biomacromolecules를 추적 하기 위해 기회를 제공 하는 매우 구체적인 클릭 화학 ligations 사용을 통해 일반적인 bioconjugation 기술의 한계 극복 생활에서 시스템^4,,56.

세균 및 동물 세포에이 강력한 방법의 빠른 성장 인기에도 불구 하 고 식물 생물학에 있는 그것의 사용을 설명 하는 보고서는 의외로 몇과^{7,,89,10, 사이 11,12}. 우리는 식물의 리그 닌, 지구상에서 가장 널리 퍼진 biopolymers 중 고 lignocellulosic 바이오 매스의 주요 구성 요소 형성 연구에이 전략을 적용 하는 데 특히 관심이 있었다. ^{13 , 14} 리그 닌 구조와 보호 역할을 하는 개발 및 더 높은 식물의 생활에는 페 놀 폴리머입니다.

그것은 일반적으로 3 4 hydroxyphenylpropanoid moieties 구성 되어있습니다: H (p-hydroxyphenyl), G (guaiacyl)와 S (syringyl) 단위 각각 3에서 파생 된 'monolignols' (p-coumaryl, coniferyl 및 sinapyl 알콜)는 (그림 1) 세포의 세포질에서 phenylpropanoid 통로 통해 합성. 세포 벽에 수출 되 고, 후 monolignols 산화는 peroxidases 또는 laccases 후 그들은 리그 닌 고분자에 유해를 순전히 화학 급진적인 커플링 반응의 받을 래 디 칼, 하는 프로세스 라고 lignification. ^{15 , 16} 비록 lignins 강하게 영향을 많은 식물 유래의 산업용 어 제품, 과학계 아직도 있다 lignification를 규제 하는 복잡 한 메커니즘을 해독 갈 길이.

그림 1: 식물 세포에서 lignification 과정. Monolignols는 cytosol에서 페닐알라닌에서 biosynthesized 있습니다. 세포 벽에 수출 되 고, 후 monolignols 산화는 peroxidases 또는 laccases 후 그들은 리그 닌 고분자에 유해를 순전히 화학 급진적인 커플링 반응의 받을 래 디 칼, 하는 프로세스 라고 lignification. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Glycan 분석 bioorthogonal 반응의 사용에 대 한 보고서는 수많은,^2,,317 생체의 다른 종류를 그들의 응용 프로그램 예제는 적은. 리그 닌 bioimaging 목적 bioorthogonal 화학을 사용 하 여 Tobimatsu 그 외 여러분 에 의해 최근에 개척 했다 ⁸ 애기 thaliana 알코올 대리 모 알선 리그 닌 고분자 그것은 G 단위, 따라서 개념의 증거를 보여주는^8,9 를 형성 하는 어디에 coniferyl의 설립에 대 한 정보를 제공 하는 화학 기자 전략은 이런이 맥락에서 적용 됩니다. CuAAC의 사용은 또한 그림 사용 하 여 다른 coniferyl 알코올 파생 몇 달 나중 Bukowski 외. ^{그러나 9} , 리그 닌 또한 포함 H와 S 단위 및 lignification 과정의 깊은 이해는 monolignols의 모든 고분자에 통합 하는 방법에 대 한 더 많은 지식이 필요 하 고 어떤 요인 그것의 구성을 제어할 수 있습니다. 현재이 분야에서 새로운 발전은 생활 시스템에서 동시에 여러 화학 기자를 추적 하기 위해 효율적인 방법론의 개발에 따라 달라 집니다. Glycans에 대 한 몇 가지 기사는 최근 몇 년 동안^18,19,에 기초를 마련 하더라도^20,,2122, 듀얼 접근 라벨 주요 과제 남아 bioorthogonal 화학입니다. 재현할 수 단일 레이블 클릭 프로토콜 개발 어렵다, 다음 듀얼 라벨 접근 상호 2의 연동에 최적화를 필요로 하는 경우 두 명의 별도 화학 기자에 호환 bioorthogonal 반응을 더욱 있습니다. 이 측면을 개척 하는 몇 가지 예 동물 세포에서 glycans 연구 스트레인 승진 아 지 드 alkyne cycloaddition (SPAAC)과 알 켄-tetrazine 역 전자 수요 Diels 오리 나무 (다_inv) 반응의 조합 사용. 그러나, 우리는 DAinv 반응의 bioorthogonality (전자-가난한 반응 수 전자 풍부한 대체 cinnamyl 형 단위체를 이루어져 있는 리그 닌의 구조 기능 때문에이 응용 프로그램에서 보장 되지 않을 수 있습니다 생각 DAinv 반응에 사용 되는 tetrazine 프로브 등 dienes)이 아닌 특정 라벨 생성 될 수 있습니다. 다_inv 반응 합성으로 액세스로 부피가 고 질 성 그로 인하여 가능성을 제기 하기 어려운 화학 처리를 요구 하는 또한, 그 법인, 전송 그리고/또한 화학 제품의 지역화의 속도 vivo에서 기자 수 있습니다 영향을 받을. 후자의 측면은 lignification을 공부에 대 한 클릭 화학 접근의 경우 특히 관련 된 것으로 간주, 우리는 다른 방향으로 선택 하 고는 Bioorthogonal 결 찰 이미징 순차적 전략 (행복)을 사용 하 여 개발 된 Strain-Promoted 아 지 드 Alkyne Cycloaddition (SPAAC)와 구리 Catalysed 아 지 드 Alkyne Cycloaddition (CuAAC)의 조합 vivo에서. ²³

이 두 반응은 있으며 실제로 두 가지 주요 bioorthogonal 클릭 날짜, 사용 된 반응 특히에서 리그 닌의 몇 가지 예는 이미징 최근에 간행 되었다. ^{8 , 9} 우리의 듀얼 라벨 전략 i) 생물학으로 관련 구조 쪽으로 unreactive, ii) 매우 작은 크기 (그림 2 에 두 개의 화학 처리 한 monolignol 기자에 아 지 드 moiety 및 다른 터미널 alkyne 사용할을 수 있습니다. ). 결과적으로, 이러한 합성 수정 연구 biomolecule의 물리 화학적 특성에 미치는 영향 최소화 호텔측 교통 측면에서 부 자연스럽 고 자연 monolignol 기판 사이 감소 및 metabolization 신진 대사 설립 단계 속도입니다. 비록 SPAAC와 CuAAC의 조합 처음 보면 매우 직관적인 것, 그것은 우리의 지식 구조 glycans 이외에이 전략 및 첫 번째 응용 프로그램을 사용 하 여 이중 표시에만 두 번째 예. ^{12 , 23}

그림 2: 블 리스 듀얼 전략 라벨. 화학 기자 H_AZ 와 G 기본 H와 G monolignols의 태그 아날로그는. 그들은 먼저 세 먹이 (1 단계)에 의해 세포 벽의 성장 리그 닌 고분자에 통합 됩니다. Cyclooctyne-와 아 지 드-기능성 형광 프로브는 다음 순차적으로 출혈 통합된 기자에 의해 bioorthogonal 화학 클릭: SPAAC 반응 (단계 2) H_AZ 단위의 매우 구체적이 고 뒤에 CuAAC 반응 ( 3 단계) 그는 G 단위 (3 단계)의 특정 되므로 하지 두 기자 들의 특정 지역화 독립적으로 동일한 견본에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

우리는 첫째로 설계 하 고 유효성을 아 지 드 태그 monolignol 기자 H_AZ ( p-coumaryl 알코올의 대리) 및 리그 닌 H 단위의 선구자 다음 그것 함께에서 사용 되는 블 리스 듀얼 레이블 전략 고안에 이전 보고 alkyne 태그 G,⁹ (coniferyl 알코올의 대리) 및 리그 닌 G 단위의 선구자. 이 재현 프로토콜을 개발 하 고 아마에서 테스트, 경제적으로 중요 한 식물 종, 리그 닌으로 H_AZ 와 G 듀얼 대사 설립 먼저 순차 SPAAC/CuAAC 전에 달성은 라벨. 여기, 태그 H_AZ 단위는 처음 구체적으로 표시 된 통해 태그 G_{가 두 번째 형광 프로브 CuAAC 중재 결 찰에 의해 따라 cyclooctyne 기능성된 fluorophore의 SPAAC 결 찰} 단위. 이 메서드와 식물 세포 벽 내의 lignification 과정의 역학 조사 하는 데 사용 되었습니다 적용 vivo에서 횡단면, 줄기 종의 서로 다른 식물의 모 종 생활 될 수 있습니다.

프로토콜

참고: 액체와 고체 ½ MS 미디어 보충 표 1에 설명 된 대로 미리 준비 되어야 한다.

1. 공장 문화

1. 2 개월 된 아마 식물의 문화
   1. 아마 (눔 usitatissimum L.) potting 퇴 비를 사용 하 여 플라스틱 화분에 씨앗을 뿌린.
   2. 성장 photoperiod의 16 h/8h와 22 ° C에서 성장 챔버에 아마 주/야.
   3. 1 개월 후 수직 지원으로 식물을 장비 하 고 2 개월 될 때까지 성장.
2. 2 주 된 아마 묘 문화
   1. 치즈 헝겊 조각에서 12 아마 씨앗 포장 하 고 번들을 고무 밴드와 함께 해결.
      참고: 다음 단계는 층 류 연기 후드 무 균 조건 하에서 실시 합니다.
   2. 이전 압력가 250 mL 유리병에 종자 번들을 놓습니다.
   3. 추가 70%의 70 mL EtOH 병 고 부드럽게 1 분 저 어.
   4. 조심 스럽게 이동 하면서 병에 번들으로는 EtOH를 제거.
   5. 2% 염소의 100 mL를 추가 하 고 10 분 동안 부드럽게 저 어.
   6. 병에 번들을 떠나 있는 동안 이동에 의해 염소 솔루션을 제거 합니다.
   7. 1.2.5-1.2.6 단계를 반복 합니다.
   8. 불 임 초순 물 100 mL를 추가 하 고 1 분 동안 저 어.
   9. 반복 단계 1.2.8 헹 구는 시간을 각 린스 (5, 10 및 15 분)에 3 번.
   10. 단단한 ½ MS 매체를 따뜻하게 하 고 2 cm의 높이까지 메 마른 식물 문화 상자에 부 어 응고까지 진정 하자.
   11. 섬세 하 게 살 균 집게를 사용 하 여 단단한 매체에 각 씨앗을 놓습니다.
   12. 무 균 상자를 닫습니다.
   13. Photoperiod의 16 h/8h와 22 ° C에서 성장 챔버에 상자를 전송 주/야 2 주 동안 아마 묘 종 성장.

2. 신진 대사 설립 화학 기자

참고: 아래 3 가지 실험 모델 제시: 줄기의 횡단면, ii) 전체 줄기 및 iii) 식물 묘 i) 대사 라벨. 각 프로토콜은 하나의 생물 복제에 대 한 제시 하 고 수량 필요한 생물 복제 수에 적응 시킬 수 있다. Monolignol 솔루션을 실험 하기 전에 표 2 에 설명 된 대로 재고 솔루션에서 준비 된다. 재고 솔루션-20 ° c.에 몇 개월을 저장할 수 있습니다. H_AZ: G 또는 H:G 비율 모든 맞춤 실험적인 디자인에 맞게 조정 될 수 있다.

1. 2 개월 된 아마 줄기 횡단면이으로 화학 기자 설립
   1. G_가 10 µ M 및 10 µ M H_AZ 의 액체 살 균 ½ MS 매체에서 300 µ L 화학 기자 솔루션을 준비 합니다.
   2. 소용돌이는 H_AZ/G_가 솔루션은 micropipette와 48-잘 접시의 한 우물을 전송.
   3. G 의 10 µ M와 액체 살 균 ½ MS 매체에서 H 의 10 µ M를 포함 하는 300 µ L 부정적인 제어 솔루션을 준비 합니다.
   4. 소용돌이는 H/G 솔루션 같은 48-잘 접시의 두 번째 음을 전송.
   5. 새로운 면도날을 사용 하 여 토양 위 10 cm에서 2 개월 아마 식물의 줄기를 잘라.
   6. 섬세 하 게 50 자유 횡단 횡단면 면도날 (약 150-250 µ m 두께)를 사용 하 여 줄기의 준비.
   7. 바로 시계 유리에 액체 살 균 ½ MS 매체에서 횡단면을 놓습니다.
   8. 육안으로 직접 검사 그대로 전체 횡단면을 선택 하 고 임의로 h _AZ잘 채워진에 그들의 10를 배포 /G_가 솔루션.
   9. 반복 단계 2.1.8 잘 채워진된 h/G 솔루션 (부정적인 제어)로.
   10. 3 잘 ½ MS 매체의 300 µ L (confocal 현미경 이미지의 연속적인 데이터 처리 중 형광 기준선을 조정 배경 제어)으로 가득 2.1.8 단계를 반복 합니다.
   11. 20 ° c에서 20 h에 대 한 성장 챔버에 연속 빛에서 접시를 품 어.
   12. 각 잘은 micropipette에서 monolignol 솔루션을 제거 합니다.
   13. 각 음을 ½ MS 매체의 500 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 부드럽게 저 어는 micropipette 솔루션을 rinsing이 제거. 4 번을 반복 하 고 블 리스 즉시 라벨 (제 3) 진행.
2. 2 개월 된 아마 전체 줄기로 화학 기자 합동
   1. G_가 10 µ M 및 10 µ M H_AZ 의 액체 살 균 ½ MS 매체에서 포함 된 5 mL 화학 기자 솔루션을 준비 합니다.
   2. 소용돌이는 H_AZG_가 솔루션 및 전송 20 cm 높이 유리 테스트 하는 피 펫 튜브 /.
   3. G 의 10 µ M 및 10 µ M H 의 액체 살 균 ½ MS 매체에 포함 된 5 mL 부정적인 제어 솔루션을 준비 합니다.
   4. 소용돌이는 H/G 솔루션 및 전송 20 cm 높이 유리 테스트에 관.
   5. ½ MS 매체의 5 mL (confocal 현미경 이미지의 연속적인 데이터 처리 중 형광 기준선을 조정 배경 제어)으로 포함 된 세 번째 유리 시험관을 준비 합니다.
   6. 새로운 면도날을 사용 하 여 토양 위 10 cm에서 2 개월 아마 식물의 줄기를 잘라. 루트 시스템 및 줄기의 아래 부분을 버립니다 그리고 식물 줄기의 상단 부분으로 다음 단계를 수행 하십시오.
   7. H_AZ포함 된 튜브에 전체 컷된 줄기의 기지를 담가 /G_가 솔루션. 건조에서 그것을 방지 하기 위하여 루트 시스템의 제거 직후의 부 화 솔루션에 줄기를 놓습니다.
      참고: 메서드가 적용 되 면 더 오래 된 젊은 식물 및 다른 종, monolignol 솔루션의 볼륨을 조정 해야 크기에 따라 나이 / 식물의 줄기의 직경의.
   8. 그것을 똑 바른 유지 하기 수직 지원에 줄기를 연결 합니다.
   9. 솔루션의 증발을 피하기 위해 parafilm으로 유리관을 봉인.
   10. H와 부정적인 컨트롤 샘플에 대 한 단계 2.2.6-2.2.9를 반복 /G 솔루션.
   11. ½ MS 매체를 포함 하는 형광 배경 컨트롤 샘플 2.2.6-2.2.9 단계를 반복 합니다.
   12. 네온 빛을 사용 하 여 지속적인 빛에 20 h에 대 한 각 줄기를 품 어.
   13. 후 대사 관 20 h, H_AZ에서 incubated 줄기 제거 /G_가 솔루션 ½ MS 매체와 그것을 씻어.
   14. 잘라 1cm 면도날을 사용 하 여 줄기의 아래쪽 삭제 하 고 나머지 줄기의 기지에서 1 cm 높은 실린더 준비.
   15. 신중 하 게 20 자유 가로 횡단면 (약 150-250 µ m 두께)이이 실린더에서 준비 하 고 ½ MS 매체는 시계 유리에 즉시 넣어.
   16. 48-잘 접시의 한 잘에 ½ MS 매체의 500 µ L를 넣어.
   17. 육안으로 직접 검사 고 그대로 전체 횡단면을 선택 하 고 임의로 배포에 ½ MS 솔루션으로 가득 잘 그들의 10.
   18. 2.2.13-2.2.17 H/G 솔루션 incubated 부정적인 제어 줄기에 대 한 단계를 반복.
   19. ½ MS 매체와 형광 배경 제어 줄기에 대 한 단계 2.2.13-2.2.17 incubated 반복.
   20. 조심 스럽게는 micropipette 각 잘에서 솔루션을 제거 합니다.
   21. 각 음을 ½ MS 매체의 500 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 부드럽게 저 어는 micropipette 솔루션을 rinsing이 제거. 4 번을 반복 하 고 블 리스 즉시 라벨 (제 3) 진행.
3. 2 주 된 아마 모 종으로 화학 기자 설립
   참고: 다음 단계는 모두 수행 무 균 조건 하에서.
   1. G_가 10 µ M 및 10 µ M H_AZ 의 액체 살 균 ½ MS 매체에서 포함 된 2 mL 화학 기자 솔루션을 준비 합니다.
   2. 소용돌이는 H_AZG_가 솔루션 및 전송 20 cm 높은 유리 테스트 하는 피 펫 튜브 /.
   3. G 의 10 µ M 및 액체 살 균 ½ MS 매체에서 H 의 10 µ M 2 mL 부정적인 제어 솔루션을 준비 합니다.
   4. 소용돌이는 H/G 솔루션 및 전송 20 cm 높은 유리 테스트에 관.
   5. ½ MS 매체의 2 mL (confocal 현미경 이미지의 연속적인 데이터 처리 중 형광 기준선을 조정 배경 제어)으로 포함 된 세 번째 20 cm 높이 유리 시험관을 준비 합니다.
   6. 긴 핀셋의 쌍을 사용 하 여 고체 ½ MS 매체에서 2 주 된 아마 경종을 섬세 하 게 제거 (섹션 1.2.의 위).
   7. 부드럽게 H_AZ포함 된 튜브에는 종묘를 전송 /G_가 솔루션, 뿌리가 솔루션에 몰입 하는 보장.
   8. 유리 튜브 증발을 피하기 위해 플라스틱 캡을 닫습니다.
   9. H와 부정적인 제어 튜브에 대 한 단계 2.3.6-2.3.8를 반복 / G 솔루션.
   10. ½ MS 매체를 포함 하는 형광 배경 제어 튜브에 대 한 2.3.6-2.3.8 단계를 반복 합니다.
   11. 각 모 종 20 ° c.에 20 h에 대 한 성장 챔버에 지속적인 빛에서을 품 어
   12. 섬세 하 게 H_AZ에서 incubated 경종 제거 /G_가 솔루션 ½ MS 매체와 그것을 씻어.
   13. 섬세 하 게 20 자유 횡단면 (approximatively 150-250 µ m 두께)는 hypocotyl의 준비.
   14. 48-잘 접시의 한 잘에 ½ MS 매체의 500 µ L를 넣어.
   15. 육안으로 직접 검사 고 그대로 전체 횡단면을 선택 하 고 임의로 배포에 ½ MS 솔루션으로 가득 잘 그들의 10.
   16. 2.3.12-2.3.15 H/G 솔루션 incubated 부정적인 제어 경종에 대 한 단계를 반복.
   17. ½ MS 매체와 형광 배경 제어 경종에 대 한 단계 2.3.12-2.3.15 incubated 반복.
   18. 조심 스럽게는 micropipette 각 잘에서 솔루션을 제거 합니다.
   19. 각 음을 ½ MS 매체의 500 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 부드럽게 저 어는 micropipette 솔루션을 rinsing이 제거. 4 번을 반복 하 고 블 리스 즉시 라벨 (제 3) 진행.

3. 듀얼 형광 라벨 SPAAC와 CuAAC에 의해 식물 횡단면 샘플의

참고: 프로토콜 라벨 블 리스는 모든 3 실험 모델 (제 2) 동일 합니다.

1. 아 지 드 Alkyne Cycloaddition (SPAAC) 라벨 스트레인 승진
   1. 1 mL DBCO 말뚝₄-5의 5 µ M를 포함 하는 SPAAC 솔루션의 준비/6-carboxyrhodamine 110 액체 살 균 ½ MS 매체에서. 소용돌이 솔루션 고 어둠 속에서 그것을 유지.
   2. 최종 세척 후 [2.1.13, 2.2.21 또는 선택한 실험적인 디자인에 따라 2.3.19] 변화 법인 프로토콜의 단계 ½ MS 매체를 제거 하 고는 micropipette 잘 당 SPAAC 솔루션의 300 µ L을 추가.
   3. 알루미늄 호 일로 덮 음 또는 상자에 그것을 배치 하 여 빛 으로부터 48-잘 접시를 방패.
   4. 부드럽게 주위 온도에 어둠 속에서 1 시간에 대 한 기계적 통에 접시를 저 어.
2. 아 지 드 Alkyne Cycloaddition (CuAAC) 라벨 구리 촉매
   1. 어둠 속에서 접시를 유지 하면서도 4 번에 설명 된 대로 단계 2.1.13 각을 씻어.
   2. CuAAC 솔루션 포함 된 나트륨 하는데 2.5 m m, 0.5 m m CuSO₄ 및 5-TAMRA-말뚝₃5 µ M의 1 mL를 준비-액체 살 균 ½ MS 매체에 아 지 드. 소용돌이 솔루션 고 어둠 속에서 그것을 유지.
      참고:이 CuAAC 솔루션 갓 사용 하기 전에 준비 되어야 한다 고 4 ° c.에 몇 일을 저장할 수 없습니다.
   3. 각 잘에서 ½ MS 매체를 제거 하 고 잘 사용 하는 micropipette 당 CuAAC 솔루션의 300 µ L를 직접 추가.
   4. 부드럽게 주위 온도에 어둠 속에서 1 시간에 대 한 기계적 통에 접시를 저 어.
   5. micropipette를 사용 하 여 CuAAC 솔루션을 제거 합니다.
   6. micropipette를 사용 하 여 ½ MS의 500 µ L을 추가, 10 분 동안 어둠 속에서 저 어 다음이 세척 솔루션을 제거 합니다. 두 번 반복 합니다.
   7. 7:3 MeOH/물 솔루션의 500 µ L을 추가, 1 시간에 대 한 어둠 속에서 저 어 다음 솔루션 제거
      주의: 메탄올은 피부 접촉 또는 흡입, 독성 그리고 인간 발암 물질로 지정. 그것의 사용에는 화학 증기 두건 장갑 필요합니다.
   8. ½ MS의 500 µ L을 추가, 10 분 동안 어둠 속에서 저 어 다음 솔루션을 제거 합니다. 4 회 반복 한다.

4. 장착 현미경에 샘플의 슬라이드

1. 장소 5 방울 유리 현미경 슬라이드에 장착 매체의.
2. 신중 하 게 각 H_AZ입금/G_가슬라이드에 횡단면을 태그.
3. 슬라이드의 2 개의 반대 측에 폴란드어를 적용 합니다.
4. 커버는 coverslip로 슬라이드. 공기 방울을 피하기 위해 주의 해야 합니다.
5. 종이 타월을 사용 하 여 초과 설치 매체를 제거 합니다.
6. 4 면 모두에 매니큐어와 샘플을 봉인. 실내 온도 (대략 30 분)에서 건조 래커 못 하자.
7. 부정적인 제어 H/G 횡단면 4.1 4.6 단계를 반복 합니다.
8. 형광 배경 제어 횡단면 4.1 4.6 단계를 반복 합니다.
9. Confocal 현미경 관찰까지 어둠 속에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.
   참고: 준비 슬라이드 준비의 품질에 따라 몇 개월에 몇 주 동안 저장할 수 있습니다. 새로운 관찰 하는 경우 저장 후 만들 수, 샘플 건조 하지가 확인 합니다.

5. 이미지 수집 형광 Confocal 현미경 검사 법에 의해

1. 제조업체의 지침에 따라 올바른 순서로 confocal 현미경 시스템의 모든 필요한 단위 설정.
2. 최대한 숫자 조리개와 함께 원하는 목표를 선택 하 고 여기 및 방출 파장 적응 (예: obj와 같습니다. 60 x, N.A. 1.2. Autofluorescence 채널: λ_전 405 nm, λ_em 450 nm /25; SPAAC H_AZ 채널: λ_전 488 nm, λ_em 525 nm /25; CuAAC G_가 채널: nm_전 561 λ, λ_em 595 nm /25; 연속 모드)입니다.
3. 소프트웨어 (12 또는 16-비트, Nyquist 조건에 적응 하는 픽셀 크기)에서 이미지의 생성에 대 한 원하는 매개 변수를 선택 합니다.
4. 현미경 단계에 H_AZ/G_가 슬라이드를 놓고 목표 렌즈 아래 샘플 위치 합니다.
5. 관찰 하 고 식물 조직의 원하는 영역.
6. 고품질 이중 레이블이 H_AZ/G의 공초점 이미지_가 샘플.
   1. Z 축에서 형광 비행기를 선택 합니다.
   2. 조정 하는 이득, 오프셋 및 레이저 전원 각 채널 (autofluorescence, H_AZ 와 G_가)에 대 한 전체 회색 레벨 범위에 따라 최적의 신호 분배를 달성 하기 위해. 모든 다음 인수에 대 한 동일한 매개 변수를 적용 합니다.
   3. 선택한 이미지의 수집을 시작 하 고 파일을 저장 합니다. 샘플의 각 관련 영역에 대 한 반복 합니다.
      참고: 필요한 경우 3D Z 스택 복원 또한 취득 수 있습니다.
7. 동일한 설정을 사용 하 여, 태그 샘플만 autofluorescence 레벨 (2 절에 설명 된 대로 배경 컨트롤 형광)을 ½ MS에서 incubated의 이미지를 취득 합니다.
8. 동일한 설정을 사용 하 여, 이미지 네이티브 monolignols 일반적인 fluorophore 접착 샘플을 확인 하려면 H/G 와 incubated 부정적인 컨트롤 샘플에 대 한 취득.
9. H/G 부정적인 제어 이미지와 H_AZ/G_가 이미지에 빼기 배경 autofluorescence 신호 획득 이미지 데이터 처리를 적용.

결과

그것은 식물에 lignification 프로세스의 역학을 시각화 수, 합성 monolignol 아날로그 및 bioorthogonal 제시 블 리스 프로토콜을 사용 하 여 화학을 클릭 합니다. 리그 닌에 대 한 설립된 기법과 달리 시각화 (예: 조직화 학적인 얼룩, immunolocalization 또는 autofluorescence),이 ' 더블 클릭 ' 프로토콜 독점적으로 대사 법인 중 생산 하는 리그 닌 드 노 보 대상 공초점 형광 현미경 검사 법 (그림 3)에 의해 트리플 채널 세포 이미징으로 샘플의 기존 리그 닌에서 그것을 분화 하 고. H _AZ-단위 DBCO 말뚝₄-5의 여기 및 방출 파장을 사용 하 여 검색/6-아 지 드의 기능에 특히 클릭 되는 carboxyrhodamine 110 SPAAC 단계 (λex H_AZ 분자를 통합 501 nm /λ_em 526 nm, 녹색 채널), 반면_가 G-단위 유사 하 게 특히 G의 통합된 터미널 alkyne 태그에 클릭 되는 azidefluor 545 프로브 특성 파장에서 감지 CuAAC 단계 (λex 546 nm /λ_em 565 nm, 빨간 채널); 기존의 리그 닌, 405에서 그것의 본질적인 autofluorescence를 사용 하 여 감지 되는에 해당 하는 세 번째 채널 nm (파랑 채널). 이 이렇게 장기 (그림 3A의 다른 조직 사이 존재에 정확한 공간 정보를 제공 하는 식물 세포 벽 내의 리그 닌의 3 색 지역화 지도 또는 활성 lignification 기계 부재의 세대를 이끌어 ), (그림 3B-C) 동일한 조직 내에서 같은 셀 (그림 3D)의 다른 벽 레이어 내의 다른 세포 유형 사이. 즉,이 방법을 수 있습니다 강조 하 고 특히 지역화 '활성' lignification 사이트 (H_AZ 와 G_가 채널) 리그 닌 이전에 형성 되었다 영역에서 그들을 차별화 하 여 공장 개발 (autofluorescence 채널)의 무대입니다. 또한, autofluorescence에 비해 기술의 감도 극적으로 향상 된 고 갓 합성된 리그 닌의 훨씬 작은 양의 수 감지 (그림 3B).

그림 3: 아마 줄기에 법인된 monolignol 화학 기자의 이미징. (A) 아마 줄기, 복원된 그림의 손으로 만든 횡단 섹션의 절반. Xylem 분화의 첫 번째 레이어 (B) 클로즈업. 왼쪽 패널: 리그 닌 autofluorescence (블루, 405 nm), 중간 패널: 리그 닌 autofluorescence (파란색)와 H_AZ 형광 병합 (녹색, 526 nm) 채널, 오른쪽 패널: 리그 닌 autofluorescence (블루)와 G_{가 병합} 형광 (빨강, 565 nm) 채널. 화살표에서 autofluorescence와 비교 하는 행복의 증가 감도 보여주는 레이어의 첫 번째 레이블이 지정 된 세포 벽을 나타냅니다. 다른 세포 유형의 이차 xylem 및 (D) 같은 세포 벽의 다른 층에서 라벨 변화를 설명 하는 이차 xylem 세포에 가까이에 (C) 표시. 왼쪽 패널: 리그 닌 autofluorescence (파란색)와 H_AZ 형광 병합 (녹색, 526 nm) 채널, 중간 패널: 리그 닌 autofluorescence (파란색)와 G 형광을 병합 (빨강, 565 nm) 채널, 오른쪽 패널: 리그 닌 autofluorescence (블루), H_AZ (녹색) 및 G (레드) 형광 채널 병합. H_AZ 와 G 공동 지역화 노란색으로 그려져 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

여기에 제시 하는 블 리스 메서드 또는 Tobimatsu 그 외 여러분 에 의해 출판 이전 단일 레이블 프로시저 등 화학 기자 전략 ⁸ 따라서 면역-또는 구현 하기 매우 간단 하면서 조직화 학적인 얼룩 같은 이전 접근 방법 보다 훨씬 세밀 하 게 연구를 수 있습니다. 예를 들어, 그림 4 는 설명 H_AZ에 대 한 신호 강도 / 아마 이차 xylem의 섬유 tracheids/선박 (FT)에G_가 설립 된 레이어의에서 처음 몇 세포 벽에 매우 높습니다 하지만 이전 셀에 점차적으로 감소합니다. 이 프로 autofluorescence의 반대 이며 그 최대 lignification는 레이어의에서 처음 2 ~ 3 피트 세포 층에 매우 빠르게 도달 나타냅니다. 레이 (R) 셀 H_AZ로 그들의 발달의 많은 후기를 lignification를 계속 표시 하는 반면,G_가 설립은 훨씬 더는 속에는 레이어의에서 모든 셀의 벽에 일정 /. 이러한 세포 유형 그들의 개발 프로그램에 관련 된 차이와 다른 생물학 역할 이후 피트와 R 세포 유형 대조 lignification 역학를 표시 놀라운 일이 아니다. FTs는 성숙 하 고 급속 하 게 죽을 실제로 길쭉한 튜브, R의 좁은 행 세포 반면 기계적 지원 및 물과 무기물의 수직 전송에 필수적인 역할을 재생 하는 두꺼운 lignified 벽 떠나 죽은 빈 셀은 물 관 부 작성 가오리는 두꺼운 lignified 벽 필요 없이 그들의 성숙 하 고 기능적인 상태에 살아 있습니다.

그림 4: 아마 xylem에 셀 전용 monolignol 기자 관. 브라이트 필드 confocal 현미경 검사 법 아마 줄기에서 자유형 횡단면의 일부의 보기 (A). 핑크 (레이 실질 세포, R), 노랑 (섬유 tracheid 셀, FT) 화살표는 속으로 cambial 영역에서 걸친 벡터 나타내고 405에서 리그 닌 autofluorescence에 대 한 스캔 nm (B), 526에서 H_AZ 형광 nm (C)와 G _가 에서 565 형광 nm (D). 이차 xylem의 (E) 보기. 왼쪽 패널: 리그 닌 (블루) autofluorescence, H_AZ (녹색), 및 G (빨간색) 형광 채널 병합. H_AZ 와 G 공동 지역화 노란색으로 그려져 있습니다. 오른쪽 패널: 아마 줄기에 이차 xylem 구조의 개략도 그림. V, 선박; FT, 섬유 tracheid; R, 레이 실질 세포입니다. 이 사자 외 에서 수정 되었습니다. ²³ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

또한, 두 가지 화학 기자를 H-및 G-단위 블 리스 프로토콜에서 두 bioorthogonal 반응에 해당를 사용 하 여 더 많은 양적 결과를 얻을 수 있습니다. 다중화와 같은 블 리스 설립 비율 다양 한 조건에서 monolignol의 제어에 추가 통찰력을 제공할 수 해독 하기 어려운 lignification 과정에 기여할 수 있는 전략을 라벨. Lignins에 H, G, S monolignols의 상대적 비율은 실제로 아주 종, 조직, 나이 또는 식물의 환경 조건에 따라 가변,이 작곡을 규제 하는 복잡 한 메커니즘 이해 여전히 완전 하지 않게 된다. 듀얼 라벨 기술 규제 lignin 구성 매개 변수 중 일부를 조사 하는 강력한 방법을 나타냅니다. 예를 들어 H_AZ를 다양 한: G_가 비율 약 이다 이차 xylem 조직에서 리그 닌 조성은 직접 아닌 세포 벽 내에 monolignol 여부 따라 달라 보여 수 있었습니다 과산화 효소/laccase 특이성 (그림 5)

그림 5: 효과의 G 그리고 H_AZ 의 다른 백분율 비율으로 아마 줄기 섹션 잠복기. H_AZ: G% 비율 그림의 각 열 위에 받는다. 위: H_AZ 와 G 채널 병합. 아래: 히스토그램 H_AZ 와 G 다른 % 비율의 평균 형광 강도 나타내는. 값은 회색 레벨 ± sd. 규모에에서 평균 형광 강도의 의미로 표시 바 = 100 µ m. 이 그림 사자 외 에서 수정 되었습니다 ²³ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

아마 섬유, 고급 논문 또는 환경 친화적인 복합 재료를 제조 하는 데 사용 되는 그것의 인 피 섬유 (BF)에 대 한 성장 이다. 그들의 산업 어의 중요 한 측면은 그들은 매우 두꺼운 S2/G 보조 레이어^19,24에 의해 특징은 그들의 세포 벽에서 리그 닌의 매우 낮은 수준입니다. 블 리스 같은 세포 벽의 다른 층 사이 lignification 역학 차이 강조할 수 있다. 그림 6A H_AZ 와 G 기자 관 셀 모서리 및 일부 인 피 섬유의 중간 얇은 판자/기본 세포 벽을 보여줍니다. Monolignol 화학 기자는 것 경우에 두꺼운 인 피부 섬유 중 셀 벽 레이어에서 lignification의 총 부재 제공 분자 환경 적합의 부재에서 발생 하는 그들의 hypolignified 상태를 계시 한다 산화 효소 중재 및 성장 중합체 사슬에 monolignols의 설립 그리고 그 하지 그냥 monolignol 생 합성 유전자의 transcriptional 규칙 이전²⁵보고. 이 관찰 또한와 상관 한다 잘 사실 유전자는 통제해 위로 통제 lignified 인 피 섬유²⁶을 아마 화학 lbf1 돌연변이의 외부 줄기 조직에는 아마 과산화 효소.

그림 6: 블 리스 세포 벽 구조 또는 계층-차이점 하이라이트. (A) 왼쪽된 패널: 아마 줄기 섹션의 필드 밝은 이미지. 원 섬유 번들을 나타냅니다. 오른쪽 패널: 인 피 섬유에 가까이. (와 밝은 필드 없이) H_AZ 와 G 채널 병합 그 lignification은 셀 모서리 표시 ()와 일부 인 피 섬유의 중간 얇은 판자/기본 세포 벽. BF, 인 피 섬유; 파, 실질 세포; M, 중간 얇은 판자; P, 1 차 세포 벽; S1, 2 차 세포 벽;의 첫 번째 레이어 2 차 세포 벽의 S2/G, 보조 레이어/젤라틴 층. (B) 2 차원 조각과 confocal z-스택의 3D 개조 아마 루트 endodermis 영역의 확대. Casparian 지구 ()만 autofluorescence를 표시 하 고 H_AZ 또는 G포함 되지 않습니다. 관련된 fluorogram 보여줍니다 G가/H_AZ 안티 상관 관계: 높은 녹색 형광이 낮은 붉은 신호 (피 질)과 반대 (endodermis) 연결. Pericycle (P), Endodermis (E), Cortex (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

마지막으로,이 두 색 방법론 제공할 수 있습니다 또한 귀중 한 정보 콘텐츠의 세포 벽의 'lignification 상태'에 다양 한 발달 단계에서 및 줄기 이외의 식물 기관에서. 예를 들어 아마 뿌리의 endodermis 개발의 초기 단계 동안에 방사형 및 가로 셀 벽 Casparian 밴드의 존재에 의해 특징입니다. 소수 biopolymer suberin의 리그 닌, 만든이 밴드 물과 용액은 apoplast를 통해 수 동적으로 입력에서 루트에 의해 촬영을 방지 하 고 그들에 기여 하는 그로 인하여 symplastic 경로 통해 플라즈마 멤브레인을 통과 하는 식물 뿌리의 선택적인 통풍 관 용량입니다. 아마 뿌리에 적용, 우리의 전략 H_AZ 와 G Casparian 밴드 (그림 6B) 결 석은 방사형 벽의 부분에서 뿐만 아니라 endodermal 셀의 접선 벽에 통합 했다. 그러나, monolignol 기자 합동 Casparian 밴드 자체에서 총 부재는 그것이 성숙이 발달 단계에서 다른 벽은 여전히 추가 biopolymer 증 착의 사이트 동안 나타냅니다. Z-스택 복원된 3D 보기는 명확 하 게 빛을 Casparian 밴드를 제공합니다. 흥미롭게도, 일부 대뇌 피 질의 세포는 endodermis에 인접 한 벽 또한 입증 H_AZ 를 우선적으로 통합의 능력 (그로 인하여 아마 루트 피에서 리그 닌/suberin의 존재를 나타내는) 하지 G하지만. 공동 지역화 분석 H_AZ 와 G이 두 개의 인접 한 세포 유형에 서 특정 세포 벽 구조/효소 기계의 존재를 제안 사이 반대로 상관 관계를 보였다.

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보충 표 2: 화학 기자 재고 솔루션의 준비 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

앞서 언급 했 듯이,이 문서에 소개 된 듀얼 라벨 블 리스 프로토콜^2312, vivo에서SPAAC/CuAAC 결합의 첫 번째 예제 중 하나입니다. 각 단계는 철저 하 게 최적화 및 검증, 그리고 그것은 매우 중요 한 있는 두 클릭 화학 라벨 반응을 순차적으로 수행 하는 순서는 존경 (즉, SPAAC 먼저, 다음에 CuAAC). 모든 크로스-컨트롤 보였다 라벨 각 단계는 특정 때 블 리스 프로토콜 적용된²³ : 높은 chemoselective를 처음 리드 SPAAC 단계 수행 H_AZ 아 지 드 함수의 라벨은 빠른 속도와 [3 + 2] cycloaddition 반응을 통해 cyclooctyne 기능성된 fluorophore. H_AZ 단위 태그는, 일단 아 지 드 fluor 545 프로브 triazole 링크 반응에 의해 생성 하 G_가 터미널 alkynes의 copper(I) 촉매 활성화를 필요로 하는 CuAAC 단계 실행 될 수 있습니다. 반면, 역순 (즉, CuAAC 먼저, 다음 SPAAC)가 G H_AZ 단위 리드 사용할 수 없습니다 fluorophore 결 찰과 경쟁 하 고 신호의 극적인 손실 유도 크로스 커플링 . 그것은 또한 일반적인 얼룩 피하기 위해 중간 세척 단계의 필요성을 강조 하는 것이 중요입니다.

우리는 우리의 방법은 다양 한 생물학적 실험 디자인을 적용할 수 있습니다 나타났습니다. 블 리스 프로토콜 라벨 먼저 잘라 이전 되었고 클릭 준비 monolignols와 함께 알을 품는 아마 줄기 (약 150-250 µ m 두께)의 자유형 횡단면에 적용 되었습니다. 하지만이 디자인 (외피 볼륨 감소 된다)로 화학 기자의 필요한 수량을 최소화 및 통계 복제의 생산을 촉진의 이점이 있다, 그것은, 엄밀히 말하면, vivo에서 시스템 일부에 경우, 팬 들은 진짜 spatio 시간적 lignification 역학의 모든 측면의 정보를 반영 하지 않을 수 있습니다. 두 번째 실험 설계에서 우리는 따라서 블 리스 프로토콜 이전 소나무와 은행나무²⁷방사선된 monolignols의 연구에 사용 된 방법에 적응. 이 방법에서는, 뿌리와 식물의 줄기는 물리적으로 분리 하 고 전체 줄기의 기지에서 무슨 '꽃병' 접근을 불리 수 있습니다 monolignol 솔루션에 알을 품. 떠난 후 줄기 원하는 (보육) 시간, 횡단면 컷 하 고 수행 하는 블 리스 프로토콜 있습니다. 이 지역화 패턴은 기본적으로 동일 (ii) (i) 수정 된 monolignols 생활 줄기를 통해 수송을 성장 하는 세포 벽 내의 리그 닌 고분자에 통합 표시 허용 접근입니다. 실험의이 유형은 실제 생활 공장에서 수행 되 고의 장점을 / 라이브 셀 더 이상 실험 하 고 더 깊이 있는 연구, 허용 접근 화학 기자의 큰 수량을 요구 한다. 마지막으로, 블 리스 프로토콜도 아마 식물 묘 목, 공장 모델 화학 기자 줄기를 이송 되 고 전에 뿌리를 통해 흡수 되어야 합니다는 살아있는 진짜 대표와 함께 사용 되었다. 이 모델은 실제로, 식물에 수행 되 고의 명확한 이점이 그것 젊은 묘 종에 제한 되며 (긴 보육 시간, 높은 실용적인 이유로 이전 식물 lignification 역학 조사에 정말 적합 하지 않습니다. 화학 기자 양)입니다. 그럼에도 불구 하 고,이 세 가지 실험 디자인은 보완 그리고 모든 실용적인 측면과 답변 생물학 질문의 유형에 따라 생물 학적 의미에 관하여 그들의 장단점 있다.

아마 lignification 역학 연구 개발, 우리의 프로토콜은 높은 적응력, 생물학 실험 디자인의 관점에서 뿐만 아니라 다른 응용 프로그램의 관점에서 식물 종 및 장기/조직. 예를 들어, 블 리스는 애기 또는 다양 한 유전자에 대 한 노크 아웃 또는 노크 다운 뮤턴트와 연구에 더 많은 의무가 있다 Populus 속에 쉽게 전송할 수 있습니다. 원칙적으로, 우리의 접근 방식으로 듀얼 라벨 연구 확장할 수 있습니다 또한 다른 생체에 식물 세포 벽 고분자-모든 세 가지 주요 monolignols 또는 그들의 신진 대사 선구자 뿐만 아니라 다양 한를 포함 하 여 두 가지 수정된 선구자를 사용 하 여 다 당 류 매트릭스를 구성 하는 단 처음 소개 된 이래, bioorthogonal 화학 실제로 주로 개발 되었습니다 통해 대사 처리한후 엔지니어링 (모에)^4,5,17,28, glycans/류를 조사 하 하지만 놀랍게도 되었습니다만 거의 응용 생물학 공장 까지는^{7,8,9,10,,1112}. 반응의 호환성 측면에서 리그 닌의 연구 실제로 두 화학 기자는 같은 reticulated 폴리머에 통합으로 해결 하기 위해 복잡 한 사건 이었다. 레이블이 없는 H_AZ-의 가능성G_가 상호 형성이 했다 G_가 와 3D 내 H_AZ 단위 공간 근접 때문에 극복 하기 위해 주요 문제 리그 닌²³, 않을 수 있습니다 두 명의 화학 기자 포함 되지 않은 경우 동일한 유형의 biopolymer 나 어떤 주어진된 셀의 동일한 공간 영역 제한 구조.

넓은 범위에서 블 리스 방법론 본질적으로 두 가지 화학 기자는 아 지 드와 터미널 alkyne 태그를 각각 베어링을 사용 하 여 세균 이나 동물 모델에서 어떤 두 색 형광 이미징 연구에 적용 될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)페놀 (HAZ)			Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 3, 326-338
(E)-4-하이드록시-3-프로파르길옥시신나밀 알코올 (GALK)			에서와 같이 합성 Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
2% 차아염소산
20cm 높이의 유리관
250mL Schott 유리병
48웰 플레이트
5/6-TAMRA-PEG3-Azide	Jena Bioscience	CLK-AZ109-1
알루미늄 호일
, 치즈 천
퇴비, 점토
코니페릴 알코올(<강>G)시	그마, 알드리치	MFCD00002922,
(II), 황산염(II), 수화물
, DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110	Jena 함유 생명과학	CLK-A127-1
Milli-Q 초순수
Eppendorf 1,5 mL
EtOH
아마씨 (L. usitatissimum L.)
플루오로마운트-G&트레이드; 슬라이드 장착 매체	전자 현미경 과학	17984-25
유리 커버 슬립
유리 현미경 슬라이드
성장 챔버	CLF-식물 기후학		2 주 된 식물 배양
성장 챔버	Angelantoni 생명 과학		2 개월 된 식물 문화
마젠타 식물 배양 상자			2주 된 묘목 배양의
경우 메탄올			독성(SGH02, SGH06, SGH08), 후드 아래 장갑 사용
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p-쿠마릴 알코올 (H)	Carbosynth	FC145653
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플라스틱 냄비			2개월 된 식물 배양
면도날
고무 밴드
Sodium Ascorbate
멸균 클램프
수직 지원
Vortex
액체 및 고체 ½용 시약; MS 매체
KH2PO4
KNO3
NH4NO3
MgSO4.7H2O
CaCl 2.2H2O
MnSO4. H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO< sub>4.5H2O
CoCl2.6H2O
Na2EDTA.2H2O
FeSO4.7H2O
Thiamine.HCl
Pyridoxine.HCl
, 글리신
, 니코틴산
Myo-inositol
당,
MES, 수화물
한천