Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

신경 통신 원형질 막¹시 냅 스의 소포를 포함 하는 신경 전달 물질의 규제 융합을 통해 발생 하는 신경 전달 물질 방출에 의존 합니다. Exocytosis^2,,34,,56 라고 하는이 프로세스는 매우 동적 이며 업 또는 다운-통제 자극⁷의 속도 변동에 따라 될 수 있습니다. 이러한 프로세스에 관련 된 단백질 브라운 모션 적용 되며 따라서 전체 조직 유지 하는 다양 한 바인딩 이러한 생리 기능을 보강 하는 작업의 수를 표시. 플라즈마 막 단백질은 매우 동적, 원형질 막^{7,,89,10,11에 nanoclusters로 분자의 측면 트래핑을 허용 12}. 따라서, 이러한 단백질의 이동성 조사 작업⁸의 그들의 모드를 명료 하 데 도움이 됩니다. 지금 알려진 다 측면 빠른 기동성을 전시 하 고 옆쪽으로 분자 제공할 수 있다 nanoclusters 내에서 트랩핑 녹는 N-ethylmaleimide 민감한 요소 첨부 단백질 수용 체 (SNAREs), 예를 들면 Syntaxin-1A, 같은 시 냅 스 단백질 창 고 그리고 소포 융해^9,13,,1415에 대 한 사이트.

Photoconvertible 형광 단백질 단위체 (m) Eos^16,17 가¹⁸, 등의 최근 개발 허용 했다 접근의 사용을 통해 신경 플라즈마 막 단백질의 전체 해상도 등 사진 활성화 지역화 현미경 (팜) 및 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍)^14,,1519. 이러한 발전 성과 교양된 라이브 세포와 신경 생물학 단백질의 nanoclustering에 대 한 조사를 활성화 했습니다. 최근에, 연구는 실시 되었습니다 명료 (비슷한 높은 해상도)에서 역학과 라이브 그대로 생물의 신경에 있는이 막 단백질의 조직 같은 생쥐, 꼬마 선 충, 및 를 초파리 melanogaster^14,20,,2122.

하지만 또한 같은 hindrances를 극복 하는 능력 뿐만 아니라 (예: 팜, 폭풍우, 및 photoconvertible fluorophores), 최근에 개발 된 슈퍼 해상도 이미징 도구를 사용 해야 역학과는 단백질에서 생체 내에서 의 조직 조사 단백질 및 이미징 레이저의 침투 깊이 접근으로 그대로 동물에 세포내 단백질 이미징 본질적으로 이미지 그대로 마우스의 해 마 같은 그대로 동물의 생활 조직 내의 깊은 포함 하는 구조 단백질으로 도전 이다. 따라서, 단백질 또는 직물의 표면 가까이는 몇 군데 더 쉽게. Vivo에서 화상 진 찰과 다른 어려움은 동물에서 재현성 보장 이다. 로 해부학 한 샘플에서 다른 다를 수 있습니다, 다른 그대로 동물 샘플에서 복제의 용이성과 구조를 선택 하면 증명할 수 있는 또한 도전. 틀에 박힌 구조를 사용 하 여 같은 synapses, 이러한 어려움 들을 극복에 도움이.

최근 연구 결과 다른 조사 예는 조직/기관의 표면에 단백질 조직 몇 군데 있다 하는 동안 꼬마 선 충²², 같은 광학 투명 한 표 피와 동물에서 단백질 이동성을 몇 군데 있다 살아있는 마우스²¹의 두개골을 통해 대뇌 피 질의 뉴런에 걸 이미지입니다. 경우에 따라 마 취약 사용 되었습니다 움직이지; 동물 유지 그러나, 특정 마 취약 관심사의 단백질을 저하 수 있습니다. 따라서 오류를 최소화 하기 위해 vivo에서 화상 진 찰 동안 동물을 움직이기 힘 드는 유지 하는 대체 수단을 탐험 한다.

슈퍼 해상도 이미징 vivo에서 다른 경고는 관심사의 단백질을 조명 하는 데 사용 하는 레이저 부정적인 주변 조직에 영향을 미칠 수 및 따라서 여기 강도 가능한 한 낮게 유지는 것이 좋습니다. 레이저에 의해 주변 조직의 조명 또한 배경 신호를 증가 경향이 있다. 낮은 자극 강도 사용 하 여 백그라운드를 줄이는 데 도움이 됩니다, 그리고 그것은 되 고 경고는 또한 형광 단백질 광자 수확량에서 감소 이어질 수 있습니다. 분석 하는 동안 배경 빼기 대안 이미지 분석 전에 배경 신호를 줄이기 위해 수단으로 사용 될 수 있습니다.

초파리 는 vivo에서 특정 단백질 기능 조사에 대 한 기초가 튼튼한 유전 도구 제공 이미징에 대 한 이상적인 유기 체를 선물 한다. 상류 활성화 순서 (UAS)-Gal4 시스템 단백질의 시간적, 공간적 표현 가능 하 고 따라서 neurotransmission²³, 조작 하는 데 사용 될 그런 초파리 과도 사용 하 여 열 유전자 자극 수용 체 잠재력 하위 가족 A1 (dTRPA1)²⁴ 또는 광학 유전자 자극 훨씬 red 이동 CsChrimson²⁵ 를 사용 하 여 이미징¹⁴와 결합 될 수 있다. 우리는이 시스템에서 수행 하는 단일 분자 이미징 vivo에서 의 합병증의 많은 극복 하 고 지금 설명 하는 방법 단일 입자 추적 실시 될 수 있습니다 초파리 melanogaster 3 탈피 애벌레에서.

1. 유전자 변형 초파리 mEos2 태그 단백질 표현 디자인

1. 태그 mEos2 단백질와 단백질을 선택 합니다. 이미징 성공률을 높이기 위해 선택 도메인 막 횡단 단백질 신경 원형질 막¹⁴ (예를 들어, Syntaxin-1A), 시 냅 스 소포 또는 autophagosomes^26,27 (예를 들어, 단백질 Synaptobrevin-2), 또는 cytosolic 단백질 신경 플라즈마 막 단백질 (예를 들어, Munc18-1)와 가까운 상호 작용을.
2. MEos2 태그 단백질 (그림 1) 인코딩 transgenes를 생성 합니다. 단백질 및 mEos2에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관 디자인.
   참고: mEos2 코딩 순서는 관심사의 단백질의 C-말단에 융합 하도록 설계 되었습니다 pmEos2 N1 플라스 미드에서 증폭 될 수 있다. 복제 예 수행할 수 vivo에서 재결합 Saccharomyces cerevisiae 사용 하는 pFL44S에에서 의해-attB-MCS-w + 벡터^14,28, 깁슨 등 다른 복제 메서드를 사용할 수 또는 어셈블리 프로토콜²⁹
   1. BamHI 및 XbaI 벡터를 선형화 하 고 공동 인코딩 mEos2 및 관심사의 단백질 PCR 파편 함께 ura3- 효 모 세포로 변환. 유전자 변형 플라이 라인³⁰를 생성 하는 구문으로 초파리 배아를 주사.
3. 후방 표준 효 모와 당 밀 매체 또는 플라스틱 튜브에 포함 된 다른 어떤 적당 한 대체에 유전자 변형 비행 문화. 건강 하 고 상당히 큰 시 냅 스 boutons³¹, 튜브, 인구 과잉 파리 방지 고 계란-누워;의 매일 후 새로운 튜브에 파리를 플립 이렇게 세 번째 탈피 애벌레는 먹이 잘 하면 그들은 매체에 방황 시작 시간에 의해 적절 한 크기를 도달 합니다. 실 온 (25 ° C)에서 유전자 변형 비행을 올립니다.
   참고: 큰 시 냅 스 boutons 이미징 동안 구상 단백질의 큰 수량을 산출 하는 경향이 있다.

2입니다. 유 충 탈피 3의 해 부

1. 지름 및 적절 한 실리콘 엘라 스토 머 키트 (그림 2A)를 사용 하 여 높이에 mm ≤20 mm 원통형 또는 semicylindrical 모양된입니다 (PDMS) 기본 ≤20을 확인 합니다. 실리콘 엘라 스토 머는 실리콘 경화제 10: 1의 비율로 믹스.
   1. 철저 하 게 5 분 부는 dimsensions와 금형에 혼합물 위에 나열 된에 대 한 혼합물을 저 어. 오븐에서 45 분 동안 100 ° C에서 강화 하자. PDMS 기본 해 부를 실시 하는 재단 될 것입니다. PDMS 자료 유리 바닥 문화 접시의 우물에 맞는 있는지 확인 합니다.
2. 유리병 벽에서 방황 하 고 세 번째 탈피 애벌레를 선택 합니다. 4.5 확대 광학 스테레오-현미경을 사용 하 여 시각화를 지 면 PDMS 원통형 기지에 배치 하는 유 충.
3. 곡선 및 minutien 핀 입 걸 앞쪽 spiracles, 확장 하는 2 사이 머리에 그리고 두 후부 spiracles 사이의 항문에 꼬리에 붙어 핀셋을 각도 사용 합니다. 고정된 유 충에 실 온에서 슈나이더의 곤충 매체의 40 µ L를 추가 합니다.
   참고: Hemolyph 같은 솔루션 (HL3 또는 HL6) 또한 슈나이더의 솔루션^32,33대신 사용할 수 있습니다.
4. Minutien 핀 벽의 중간에 incise을 사용 하 여 유 충의 복 부 체 벽의 지 면을 통해 액세스를 제공 합니다.
5. 체 벽을 사용 하 여 봄이 위 절 개 포인트에서 엽니다. 이전 후부 방향³⁴에서 중간을 따라 자릅니다.
6. 미세 집게를 사용 하 고 사람은 유 충을가 위 봄: 침 샘, 기관, 창 자 등 내장을 제거. 슈나이더의 곤충 매체와 두 번 유 충을 씻어.
7. 좋은 집게 두 체 벽 날개를 잡고, 부드럽게 그들을 밖으로 기지개와 각 측면에 2 개의 minutien 핀을 스틱. 이 육각형 모양의 준비 (그림 2A)을 생산 한다.
8. 봄이 위를 사용 하 여 이미징; 동안 근육 움직임의 가능성을 감소 하 고 복 부 신경 코드에서 뇌를 분리 이 또한 평면 이미징 요리에 대 한 준비를 제공 합니다. PDMS 베이스에 모든 6 개의 minutien 핀을 밀어 곡선된 핀셋을 사용 합니다.
   참고: 핀의 단지 작은 부분 복 부 벽 안에 포함 한다.
9. 유 충 해 부 절차 살아있다 확인, 약간 복 부 신경 코드를 찌 르 지,이 유 충 복 부 벽의 연동 수축을 유도 한다.

3. 약간 비스듬한 조명 단일 입자 추적 현미경

1. 유리 바닥 문화 접시에 해 부 유 충-PDMS 기지 반전. 실내 온도 슈나이더의 곤충 매체 (그림 2B)의 2 개 mL로 이미징 접시를 채우십시오.
2. 복 부 근육 6 및 7³⁵ 63 x를 사용 하 여 시 냅 스와 함께 두 번째 및 세 번째 세그먼트에 모터 뉴런을 찾습니다 / 1.2 형광 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경에 나 물 침수 목표.
3. 해 부 유 충;를 사용 하는 현미경의 접 안경 밝은 분야 조명 사용 하 여 근육 6를 식별 합니다.
4. 현미경 수집 소프트웨어를 사용 하 여 참조 테이블의 재료, 구성에 TIRF에 침투 깊이 증가, 그렇지 않으면 간접 조명 달성 TIRF 중요 한 각도에서 이동 1 °를 겨냥 틀 카메라 각도 밀어.
5. 녹색에서 mEos2를 시각화 하는 488 nm 레이저를 켠다. 낮은 레이저 파워를 사용 하 여 (22.8의 5% 미만 mW)을 피하기 위해 녹색 형광 표백. (어떤 문자열에 구슬 처럼 보이는) 신경 근육 접합 찾아서 낮은 해상도 TIRF 이미지를 취득 합니다.
6. 동시에 405 nm 레이저에 전환 (빨간 종 녹색에서 photoconverts mEos2)와 확률론 단일 mEos2 형광 단백질을 지역화 하려면 561 nm 레이저 (이미지 빨간 photoconverted mEos2).
   참고: 낮은 405 nm 레이저 힘의 사용은 권장 (4.78의 0.9%를 0.005 mW)이 영화 중 비교적 일정 photoconversion 속도 대 한 수 있습니다. 50와 75 %561 nm 레이저의 사용 (20.1 mW), 이것이 신경 근육 학 교차로 주변 근육 조직의 형태에 부정적인 영향을 주지 않고 빨간 mEos2 종에서 형광을 확보 하기에 충분.
7. 각 신경 근육 접합 체인 시리즈 이상으로 구성 15000 프레임 33 Hz.에 as.czi 형식 저장 가능한 참조에 대 한 함께 메타 데이터를 보존 하기 위해 한 번 취득.
8. ImageJ를 사용 하 여 '.tiff' 파일을 '.czi' 동영상 파일을 변환.
9. 추적 분석 소프트웨어^11,14,36 TrackMate 같은 피지/ImageJ³⁷ 에 적합 한 단일 분자와 인수 영화 분석 ( 재료의 표참조). 'X' 및 'y' 강도 포인트의 가우스 맞는 각 지역화의 좌표 확산 기능 (PSF).
   참고: 문제 해결: 녹색 형광 관찰 되지 않거나 488 nm 레이저에 노출 되 면 신경 근육 학 교차로에서 너무 희미, 짧게는 photoconverting 및 레이저 이미징에 스위치 (405 nm 및 561 nm),이 레드의 더 생산 하는 데 도움이 mEos2의 종입니다. 다음 488 nm 레이저로 다시 전환 하 고 TIRF 이미지.

4. 단일-분자 지역화 고정된 애벌레에

1. 팜 통해 단백질 nanocluster 크기를 측정 해 부 고정 제-4 %paraformaldehyde 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 희석 된 후 슈나이더의 곤충 매체를 바꿉니다.
2. 실 온에서 30 분 동안 유 충을 품 어.
3. 제거 해 부 핀 고 고정된 유 충 1.7 mL에 스냅 잠금 microcentrifuge 튜브를 선택을 취소 합니다.
4. 해 부 및 다른 많은 애벌레 필요에 따라 다음 그들 3 회로 씻어 PBS로 수정.
5. 블록 버퍼 (PBS, 0.1% 트라이 톤 X-100 그리고 3% 정상 염소 혈 청의 솔루션)에 PBS를 바꿉니다.
6. PBS와 애벌레 세 번 세척 후 필요한 기본 항 체 (블록 버퍼 솔루션에 희석)으로 품 어.
7. 4 ^oc.에서 밤새 품 어
8. 3 회와 함께 PBS, 애벌레를 세척 후 필요한 이차 항 체 (블록 버퍼 솔루션에 희석)으로 품 어.
9. 세 번 PBS와 애벌레를 씻고, 다시 PDMS 기지, 앞에서 설명한 단일 분자 추적에 대 한 이미지에 유 충을 첨부.

위에 나열 된, Syntaxin-1A-mEos2 유전자 변형 Drosophilamelanogaster 했다 프로토콜을 사용 하 여 생성 (그림 1). 유전자 변형 3 탈피 초파리 애벌레 PDMS 원통형 자료 (그림 2A-F)에 해 부 했다. Syntaxin-1A의 단일 분자를 시각화 하려면 우리는 약간 비스듬한 레이저 조명14TIRF 현미경에 팜 사용.

Syntaxin-1A의 단일 분자는 두 번째 복 부 세그먼트의 6 근육에 모터 신경 연 접 맨끝에 추적 했다. MEos2의 녹색 형광 형식 1b boutons 488 nm 레이저 (그림 3A)를 사용 하 여 흥분 하는 경우에 Syntaxin-1A-mEos2의 저해상도 이미지와 같이 검출 될 수 있었다. 이미징 실험, 405 nm 및 561 nm 여기 레이저 이미징 깊이 했다 133.5 및 165.6 nm, 각각. 녹색 이미지는 16 개별 프레임의 평균으로 인수 되었다. 이 녹색 이미지는 photoconverted 동영상 혼자 연 접 모터 신경 맨끝을에 지 방화의 분석을 제한 하는 데 사용 하는 관심의 영역을 만드는 사용 되었다.

취득된 photoconverted sptPALM 영화 분석 슈퍼 해결된 강도, 확산 계수, 생성 및 궤적 지도 (그림 3A). Syntaxin-1A-mEos2 이동성 개별 궤적 (그림 3B)의 제곱 변위 (MSD)의 분석에 의해 정량 추가 되었다. 통계 비교를 할 수 있는 엠 곡선 (그림 3B)에서 영역을 사용 하 여. 이동성의 추가 분석 Syntaxin-1A-mEos2의 확산 계수 분포 있고이 부동 인구 (그림 3C)을 모바일의 비교에서 통계적으로 계산 될 수 있습니다.

그림 1 : MEos2 태그 구문을 생성. pFL44S-attB-MCS-w + 벡터 BamHI 및 XbaI 오는지. 겹치는 연쇄 반응 (PCR) 관심 (POI)의 단백질을 인코딩 조각 그리고 mEos2, 각각, 수 복제 될, 예를 들어 ura3- 효 모 세포에서 vivo에서 재결합 또는 깁슨 어셈블리. 참고 Syntaxin-1A-mEos2 transgene 생성, 우리는 구조 복제 어귀 생 Syntaxin-1A 발기인 및 종결자 시퀀스. 결과 구문 이후에 표현 관심 (POI)의 mEos2 융합 단백질 유전자 변형 플라이 라인을 만들 초파리 배아에 주입 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 초파리 유 충 해 부 및 간접 조명입니다. (A) 스키마 초파리 유 충 절 개 반 원통형 PDMS 기지에 실시를 보여주는. 모 깎기 애벌레에 열렸다는 PDMS의 minutien 핀을 사용 하 여 젤. (B-C) 유 충 PDMS 준비 슈나이더의 곤충 매체를 포함 하는 유리 바닥 문화 접시 안에 배치 했다. 약간 비스듬한 조명 구성에 TIRF 현미경 모터 신경 맨끝에서 Syntaxin-1A-mEos2를 시각화 하기 위해 사용 되었다. (D F) 해 부 초파리 애벌레는 반 원통형 PDMS 기지. 유 충은 팜 슈퍼 해상도 현미경에 몇 군데와 애벌레 PDMS 준비 슈나이더의 중간, 가득 이미징 접시에 배치 되었다. 스케일 바, 10 m m. (이 그림 수정 되었습니다14에서). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : Vivo에서 Syntaxin-1A-mEos2 연 접 모터 신경 터미널에서 추적. (A) A 저해상도 TIRF의 이미지 Syntaxin-1A-mEos2 형식 1b 모터 신경 맨끝에. Photoconversion 영화 분석 33 Hz 생성 된 sptPALM 초 해결, 확산 계수, 강도와 궤적에서 지도 몇 군데. 5,309 개별 궤적 군데 이상의 16000 프레임 영화 수집 했다. 스케일 바, 3 μ m입니다. (B-C) Syntaxin-1A-mEos2의 제곱 변위 (MSD) 6 다른 모터 신경 맨끝;에서 플롯은 MSD 곡선 (AUC) 지역 이동성의 수준을 계량에 사용 되었다. 확산 계수 분포 보여;의 비율으로 양이 정해질 수 있는 모바일 및 부동 Syntaxin-1A 인구 모터 신경 터미널 당 ~ 2400 궤도의 평균 가져온 (n = 3 애벌레). 데이터의 평균 표준 오차로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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