헬리코박터 감염과 위 Pathologies의 마우스 모델

요약

마우스 감염 및 위장 미생물으로 인 한 질병 연구에 귀중 한 비보에 모델을 나타냅니다. 여기, 세균성 식민과 헬리코박터 파일로리의 마우스 모델에서 histopathological 변화를 공부 하는 데 사용 하는 방법 설명-관련 질병.

초록

헬리코박터 파일로리 는 세계 인구의 절반에 사망률 및 인 간에 있는 사망률의 중요 한 원인이 위 병원 체 이다. 여러 마우스 모델 위 헬리코박터 감염의 분자 및 세포 메커니즘에 의하여 헬리코박터 박테리아 인간의 호스트의 위 식민지와 원인 질환 연구 개발 되었습니다. 여기, 우리는 프로토콜을 설명: 1) 세균성 정지 intragastric gavage; 통해 쥐의 비보에 감염에 대 한 준비 2) 연쇄 반응 (PCR)와 가능한 계산;에 의해 마우스 위 조직, 세균성 식민 수준을 결정합니다 그리고 3) 조직학 병리학 변화 평가. 설정 하려면 Helicobact어 쥐에 감염, 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 동물 먼저 정지 (≥10⁵ 식민지 형성 단위, CFUs를 포함 하는) 중 헬리코박터 파일로리 의 마우스 식민지 긴장의와 주사는 또는 다른 위 Helicobacter 종 동물에서와 같은 헬리코박터 felis. 적절 한 시간-포인트 후 감염에서 위장 excised 고 해 부 sagittally 2 개의 동등한 조직 파편으로 동굴 및 본문 영역을 구성 하는 각각. 다른 조직학 처리를 거쳐야 하는 동안 이러한 조각 중 하나는 가능한 계산 또는 DNA 추출에 사용 됩니다. 세균성 식민과 뱃속에 histopathological 변경 Warthin-별이 빛나는, Giemsa 또는 Haematoxylin 및 오신 (H & E) 얼룩으로, 적절 한으로 얼룩진 위 조직 단면도에 정기적으로 평가 될 수 있습니다. 추가 면역 분석 또한 immunohistochemistry 또는 면역 형광 마우스 위 조직 단면도에 의해 이루어져야 수 있습니다. 아래에 설명 된 프로토콜으로 인간 관련 헬리코박터 에 닮은 위 pathologies의 쥐에 있는 평가 수 있도록 설계 된 질병, 염증, 선 위축 및 림프 여 포 형성을 포함 하 여. Inoculum 준비 및 intragastric gavage 프로토콜 쥐, 살 모 넬 라 Typhimurium 등 Citrobacter rodentium식민지 다른 장의 인간 병원 체의 병 인 연구에 적응 될 수 있습니다.

서론

헬리코박터 파일로리 감염률 80¹순서 것으로 추정 하는 개발 도상국에서와 전 세계에 걸쳐 나선형 모양, 그람 음성, 인간의 위 병원 체 모든 인구에 이다. 하지만 대부분 헬리코박터-감염 된 개인은 무 증상, 일부 더 심각한 질병, 소화 궤에서 위 암²까지 개발. 헬리코박터-관련된 암은 상피 세포 (GECs)의 악성 변화에 의해 또는 형성에 의해 여분 꾸벅꾸벅 졸 기 림프 조직 위장, 위 선 암에 결과 또는 점 막 관련 림프 광범위 하 게 특징 이다 림프 조직 (맥 아), 각각. 헬리코박터 는 매우 다양 한 독성 요인 및 준수, 성장과이 틈새 시장에서 신진 대사를 촉진 하는 메커니즘의 존재로 인해 위장의 가혹한 생태 틈새에서 살아남기 위해 적응 된다. 특히 헬리코박터 의 악성 긴장 보유 40 kb cag 인코딩하는 유형 4 분 비 시스템 (T4SS)^{3,4의 생산에 필요한 약 30 유전자 Pathogenicity 섬 (cag파이)} . cag 파이-긍정적인 헬리코박터....

프로토콜

1. 성장과 세균성 Inocula의 준비

1. 헬리코박터 파일로리 또는 H. felis¹⁵ -80 ° C와 구성 말 혈액 한 천 (HBA) 접시에 서브 컬쳐에서의 글리세롤 주식을 녹여: 혈액 한 천 자료 2 호 ( 재료의 표참조). 변경 된 "Skirrow의 항생제 선택 보충" (vancomycin, 10 μ g/mL; 구성 된 polymyxin B, 25 ng/mL, trimethoprim, 5 µ g/mL, 암포 B, 2.5 μ g/mL); 그리고 5-10% (v/v) 말 혈액^15,16. 박테리아는 혐 기성 단지 포함 하는 적절 한 가스 팩 ( 재료의 표참조), 37 ° c.에 2.5 또는 3.5 L microaerobic 조건 하에서 잘 성장
   참고:이 조건 하에서 성장 하는 헬리코박터 파일로리 긴장 부 화, 1-1.5 일 후 H. felis, 외피의 적어도 2 일은 일반적으로 필요한 반면 subcultured 해야 합니다. 적합 한 문화 및 스토리지 미디어 설명에 자세히 이전

결과

이 프로토콜 murine 마우스 모델 (그림 1) 헬리코박터 와 H. felis intragastric 감염을 달성 하는 구강 기법을 설명 합니다. 안락사, 다음 위장은 제거, 무게와 동굴, 몸과 위 조직 (그림 2)의 선 비 영역을 구성 하는 2 동등한 반으로 나누어. 선 비 지역 어떤 분석을 수행 하기 전에 제거 됩니다.

동물의 성공적인 식민지는 일반적으로 헬리코박터에 가능한 계산을 수행 하 여 확인-위 homogenates, 감염 하 고 이후에 HBA 접시 (그림 3)에 개별 식민지를 열거. 또는, PCR H. felis H. felis 와 H. pylori ureB 유전자 (그림 4.......

토론

이 프로토콜에서는 헬리코박터 감염에 대 한 vivo에서 마우스 모델의 사용을 설명합니다. 절차의 중요 한 단계는: 1) 포함 하는 실용적이 고 운동 박테리아; Helicobacter inocula의 준비 2) intragastric gavage;를 통해 마우스를 박테리아의 적절 한 숫자의 배달 3) 식민지 계산 및/또는 PCR; 세균 감염의 탐지 그리고 4) 위 조직의 활성화에 histopathology 평가 처리 위장 감염. 수정, 문제 해결 및 기술 고려 사항에 대 한 추가 제안 아래 설명 되어 있습니다.

혈액 한 천 자료 2 말 혈액 보충을 사용 하 여 헬리코박터 종 성장의 방법은 우리의 실험실에서 잘 설립 되었습니다. 그러나, 대체 한 기지와 같은 세라 한과 컬럼비아 혈액 한 천 사용된²²에 영향을 수도 있습니다. 만 메 마른 유리 세제 무료 성장 매체를 준비 하는 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Bacteriological reagents
Oxoid Blood Agar Base No.2	Thermo Fischer Scientific	CM0271B	살균 전에 탈이온화된 물에 용해
프리미엄 제세마 혈액	Australian Ethical Biologicals	PDHB100
Bacto Brain Heart Infusion Broth	BD Bioscience	237500	살균 전에 탈이온화된 물에 용해
CampyGen 가스 팩	Thermo Fischer Scientific	CN0035A/CN0025A
Histological reagents
Formalin, neutral buffered, 10%	Sigma Aldrich	HT501128
Absolute alcohol, 100% Denatured	ChemSupply	AL048-20L-P
이소프로판올(2-프로판올)	Merck	100995
Xylene(무황)	ChemSupply	XT003-20L
Mayer's Haematoxylin	Amber Scientific	MH-1L	필터 사용 전
Eosin, 수성 염색	Amber Scientific	EOCA-1L	필터 사용 전
Wright-Giemsa Stain, modified	Sigma Aldrich	WG80-2.5L	사용 전 희석(Giemsa 20%, 탈이온수 80%)
Histolene	Grale Scientific	11031/5
DPX 마운팅 매체	VWR	1.00579.0500
Molecular biology reagents
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermo Fischer Scientific	Q32850
올리고뉴클레오티드	Sigma Aldrich		이 연구에서 사용된 ureB 프라이머의 어닐링 온도는 61°C입니다. C
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8291	키트에는 10x PCR 완충액 및 염화마그네슘
dNTP가 포함되어 있습니다.	Bioline	BIO-39028	사용 전 멸균 뉴클레아제가 없는 물에서 10mM로 희석
분자 등급 Agarose	Bioline	BIO-41025
탄산수소	Univar (Ajax Fine Chemicals)	A475-500G
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트	Chem-Supply	MA048-500G
Antibiotics
Vancomycin	Sigma Aldrich	V2002-1G	탈이온수에 용해
Polymyxin B	Sigma Aldrich	P4932-5MU	탈이온수에 용해
Trimethoprim (≥ 98% HPLC)	Sigma Aldrich	T7883	100%(절대) 에탄올
암포테리신	Amresco (Astral Scientific)	E437-100MG	탈이온수에 용해
Bacillus licheniformis	Sigma Aldrich	B0125	탈이온수에 용해
Naladixic acid	Sigma Aldrich	N8878	탈이온수에 용해
기타 시약
Methoxyflurane (Pentrhox)	Medical Developments International	해당
파라핀 왁스	Paraplast Plus, Leica Biosystems	39601006
장비 및 플라스틱 제품
Oxoid 혐기성 항아리	Thermo Fischer Scientific	HP0011/HP0031
COPAN 파스퇴르 피펫	Interpath Services	200CS01
Eppendorf 5810R 원심분리기			2,200 rpm에서 4°F에서 10분 동안 원심분리로 세균 펠릿 수집; C
23 g 정밀 글라이드 바늘	BD Bioscience	301805
Parafilm M	Bemis, VWR	PM996
Portex 세밀 보어 폴리에틸렌 튜빙	Smiths Medical	800/100/200
플라스틱 급식 카테터	Instech  Laboratories	FTP20-30
1 mL tuberculin luer slip 일회용 주사기	BD Bioscience	302100
1.2 - 2 mL 튜브용 Eppendorf micropestle	Sigma Aldrich	Z317314	위 균질화에 사용되는 오토클레이브 폴리프로필렌 유봉
GentleMACs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	마우스 위 조직에 사전 설정된 gentleMACS 프로그램 사용
M 튜브 (주황색 캡)	Miltenyi Biotec	30-093-236
Qubit 형광계	Thermo Fischer Scientific	Q33216
멸균 플라스틱 루프	LabServ	LBSLP7202
냉각판, Leica EG1160 임베딩 시스템	Leica Biosystems	해당
Tissue-Tek Base Mold System, Base Mold 38 x 25 x 6	Sakura, Alphen aan den Rijn	4124
Tissue-Tek III Uni-Casette 시스템	사쿠라, Alphen aan den Rijn	4170
Microtome, Leica RM2235	Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus 유리 슬라이드	Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific	4951PLUS4

은 합니다. 나트륨 없음없음