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방법 논문

헬리코박터 감염과 위 Pathologies의 마우스 모델

20.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56985

⸱

2018년 10월 18일

 ,  ,  , 
1Centre for Innate Immunity and Infectious Diseases, Hudson Institute of Medical Research, 2Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute and Department of Microbiology, Monash University

이 논문에서

요약

마우스 감염 및 위장 미생물으로 인 한 질병 연구에 귀중 한 비보에 모델을 나타냅니다. 여기, 세균성 식민과 헬리코박터 파일로리의 마우스 모델에서 histopathological 변화를 공부 하는 데 사용 하는 방법 설명-관련 질병.

초록

헬리코박터 파일로리 는 세계 인구의 절반에 사망률 및 인 간에 있는 사망률의 중요 한 원인이 위 병원 체 이다. 여러 마우스 모델 위 헬리코박터 감염의 분자 및 세포 메커니즘에 의하여 헬리코박터 박테리아 인간의 호스트의 위 식민지와 원인 질환 연구 개발 되었습니다. 여기, 우리는 프로토콜을 설명: 1) 세균성 정지 intragastric gavage; 통해 쥐의 비보에 감염에 대 한 준비 2) 연쇄 반응 (PCR)와 가능한 계산;에 의해 마우스 위 조직, 세균성 식민 수준을 결정합니다 그리고 3) 조직학 병리학 변화 평가. 설정 하려면 Helicobact어 쥐에 감염, 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 동물 먼저 정지 (≥105 식민지 형성 단위, CFUs를 포함 하는) 중 헬리코박터 파일로리 의 마우스 식민지 긴장의와 주사는 또는 다른 위 Helicobacter 종 동물에서와 같은 헬리코박터 felis. 적절 한 시간-포인트 후 감염에서 위장 excised 고 해 부 sagittally 2 개의 동등한 조직 파편으로 동굴 및 본문 영역을 구성 하는 각각. 다른 조직학 처리를 거쳐야 하는 동안 이러한 조각 중 하나는 가능한 계산 또는 DNA 추출에 사용 됩니다. 세균성 식민과 뱃속에 histopathological 변경 Warthin-별이 빛나는, Giemsa 또는 Haematoxylin 및 오신 (H & E) 얼룩으로, 적절 한으로 얼룩진 위 조직 단면도에 정기적으로 평가 될 수 있습니다. 추가 면역 분석 또한 immunohistochemistry 또는 면역 형광 마우스 위 조직 단면도에 의해 이루어져야 수 있습니다. 아래에 설명 된 프로토콜으로 인간 관련 헬리코박터 에 닮은 위 pathologies의 쥐에 있는 평가 수 있도록 설계 된 질병, 염증, 선 위축 및 림프 여 포 형성을 포함 하 여. Inoculum 준비 및 intragastric gavage 프로토콜 쥐, 살 모 넬 라 Typhimurium 등 Citrobacter rodentium식민지 다른 장의 인간 병원 체의 병 인 연구에 적응 될 수 있습니다.

서론

헬리코박터 파일로리 감염률 801순서 것으로 추정 하는 개발 도상국에서와 전 세계에 걸쳐 나선형 모양, 그람 음성, 인간의 위 병원 체 모든 인구에 이다. 하지만 대부분 헬리코박터-감염 된 개인은 무 증상, 일부 더 심각한 질병, 소화 궤에서 위 암2까지 개발. 헬리코박터-관련된 암은 상피 세포 (GECs)의 악성 변화에 의해 또는 형성에 의해 여분 꾸벅꾸벅 졸 기 림프 조직 위장, 위 선 암에 결과 또는 점 막 관련 림프 광범위 하 게 특징 이다 림프 조직 (맥 아), 각각. 헬리코박터 는 매우 다양 한 독성 요인 및 준수, 성장과이 틈새 시장에서 신진 대사를 촉진 하는 메커니즘의 존재로 인해 위장의 가혹한 생태 틈새에서 살아남기 위해 적응 된다. 특히 헬리코박터 의 악성 긴장 보유 40 kb cag 인코딩하는 유형 4 분 비 시스템 (T4SS)3,4의 생산에 필요한 약 30 유전자 Pathogenicity 섬 (cag파이) . cag 파이-긍정적인 헬리코박터 긴장의 위 선 암5필수적인 전조로 연루 되어 호스트에 만성 염증의 높은 수준의 유도와 관련 된.

Vivo에서 동물 모델, 특히 쥐, 되었다 매우 유익한 호스트, 헬리코박터 감염 및 질병 결과6세균성과 환경 요인의 상대적 기여를 조사 연구 함으로써. 학문은 그 연장 헬리코박터 설명 했다 이전에 개발에 만성 위 염과 동맥의 결과 유전 배경 C57BL/6 쥐의 감염 위축, 헬리코박터 감염7의 두 특징. 또한, 감염 관련된 고양이/개 세균 종, H. felis, 비슷한 병 리 및 질병 진행 인간의 맥 아 림프 종8,9에서 보듯이 쥐 몰 트 형성을 유도 하기 위해 표시 되었습니다. 가장 일반적으로 사용 하는 헬리코박터 파일로리 마우스 식민지 연구에 격리 "시드니 스트레인 1"은 (SS1) 스트레인10, cag파이+ 하지만 비 기능 T4SS (T4SS−)11. 다른 널리 사용 되는 긴장 포함 헬리코박터 B128 7.13 (cag파이+/T4SS+)12 과 X47 2AL (cag파이-/T4SS−)13. H. felis 감염, CS1 스트레인에 대 한 ("고양이 나선형 1", cag파이-/T4SS−)는 일반적으로 사용 된14.

여기, vivo에서 감염에 대 한 Helicobacter inocula, 쥐의 intragastric gavage 절차 histopathological 변경의 연구에 대 한 조직의 처리 방법의 준비를 설명 하는 프로토콜 제공 에 위. 특히,이 기사 세균성 식민을 시각화 하 고 감염 된 쥐의 위 점 막에서 몰 트 형성을 포함 한 histopathological 변화를 평가 하는 데 사용 하는 조직학 방법에 초점. 여기 설명 하는 방법 중 일부 미 등 다른 용기 병원 균의 연구에 적용할 수 있습니다. Typhimurium 또는 C. rodentium.

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프로토콜

1. 성장과 세균성 Inocula의 준비

  1. 헬리코박터 파일로리 또는 H. felis15 -80 ° C와 구성 말 혈액 한 천 (HBA) 접시에 서브 컬쳐에서의 글리세롤 주식을 녹여: 혈액 한 천 자료 2 호 ( 재료의 표참조). 변경 된 "Skirrow의 항생제 선택 보충" (vancomycin, 10 μ g/mL; 구성 된 polymyxin B, 25 ng/mL, trimethoprim, 5 µ g/mL, 암포 B, 2.5 μ g/mL); 그리고 5-10% (v/v) 말 혈액15,16. 박테리아는 혐 기성 단지 포함 하는 적절 한 가스 팩 ( 재료의 표참조), 37 ° c.에 2.5 또는 3.5 L microaerobic 조건 하에서 잘 성장
    참고:이 조건 하에서 성장 하는 헬리코박터 파일로리 긴장 부 화, 1-1.5 일 후 H. felis, 외피의 적어도 2 일은 일반적으로 필요한 반면 subcultured 해야 합니다. 적합 한 문화 및 스토리지 미디어 설명에 자세히 이전15.
  2. 마우스 감염 초기에-중간 로그 단계 문화에 대 한 세균 inocula를 준비 합니다. 각 플레이트 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 국물의 1-2 mL와 범람 하 여 부드럽게 한 천 배지에서에서 박테리아를 수확. 파스퇴르 펫 접시에서 정지 발음
    1. 또는, inocula 16-18 h15BHI 국물에 전파 된 헬리코박터 박테리아에서 준비 합니다. 이 경우에, 낮은 속도에서 2200 x g 4 ° c.에서 10 분 원심 분리 하 여 박테리아를 수집
  3. 단계 대조 현미경 검사 법 (100 X 목표) 아래 젖은 마운트 준비를 검토 하 여 생존 능력 및 박테리아의 운동 성을 평가 합니다. 유리 현미경 슬라이드에 국물 BHI의 10-20 μ 물방울에 박테리아의 loopful resuspending에 의해 젖은 산을 준비 합니다. H. felis, 헬리코박터보다 훨씬 더 큰 박테리아 인 경우는 haemocytometer을 사용 하 여 정확 하 게 실행 가능한 박테리아의 숫자의 개수 계산. 그램 얼룩을 수행 하 여 문화 순도 확인 합니다.
    참고: 대부분의 박테리아 세균 또는 나선형 모양 (형태 변형에 따라 다를 수 있습니다.) 만약만 헬리코박터 inocula를 사용 합니다. H. felis inocula 주로 나선형 모양 박테리아. 를 포함 한다 대부분의 박테리아는 coccoid 형태, 이러한 형태의 가능한 고 마우스에서 감염을 설정 하지 않습니다 경우에 inocula을 사용 하지 마십시오.
  4. 단계 대조 현미경 검사 법에서 필드 (100 X 목표) 박테리아의 대략적인 수를 계산 하 여는 inoculum에 박테리아의 수를 예상 하는 다음과 같은 가이드를 사용 하 여: 1 박테리아 필드 당 약 10 =6 콜로 니 형성 단위 ( CFU) 헬리코박터/mL;의 필드 당 10 박테리아 약 10 =7 CFU/mL; 필드 당 100 박테리아 = 약 108 CFU/mL, 등
    1. haemocytometer를 사용할 때 계산 CFU/mL는 다음 수식을 사용 하 여:
      CFU/mL (4 x 4 필드에 박테리아의 평균 수) = x (희석 요소) x (104).
  5. 필요한 경우 약 107– 108 CFU/mL BHI 국물에 희석 하 여 inoculum의 세균성 세포 밀도 조정 합니다.
    1. 최대한 세균 생존 능력을 보장 하기 위해, intragastric gavage에 대 한 inocula을 사용 하 여 준비 후 가능한 한 빨리.
    2. 항상 gavage 절차 (아래 참조) 후 즉시 inocula의 가능한 계산을 수행 하 여 헬리코박터 셀 밀도 생존 능력을 확인 합니다. 이건 항상 H. felis, 수로 그것은 일반적으로 문화 미디어에 고립 된 식민지를 형성 하지 않습니다. 으로이 방법은 실용적 사이 차별 하지 않습니다 광학 밀도 측정 (600) 혼자에 의해 inocula에 가능한 헬리코박터의 숫자를 확인할 수 없습니다 (즉, 세균/나선/헬리컬) 및 비-가능한 ( 즉, coccoid) 박테리아.
    3. 광학 밀도 값을 사용 하 여 가능한 헬리코박터 의 숫자를 추정 하는 수단으로 박테리아 inocula, 하지만 경우에, 그것은 성장 곡선을 생성 하기 위해 먼저 필요한. 이 위해, 헬리코박터 문화의 A600 값 시간이 지남에 모니터링 되며 접시 계산 하 여 결정 가능한 박테리아의 숫자에 대해 직접 상관.
      참고: 표준 플랫 바닥 조직 배양 플라스 크 10% CO2 배양 기에 배치 사용 하 여 액체 매체 (섹션 1.2)에서 문화 박테리아 같은 성장 곡선 결정을 수행 하기 위한 편리한 방법이입니다. CFUs에서 얻은 모든 4-6 h 2-3 일 동안 문화의 aliquots 결정의 숫자 다음 해당600 값17비교 됩니다. 중요 한 것은, 성장 곡선으로 이러한 서로 다른 속도로 성장할 수 있습니다, 또한, 모든 변종 10% CO2에서 잘 성장 각 헬리코박터 스트레인에 대 한 메시지를 생성 합니다.

2. intragastric Gavage 헬리코박터 와 쥐의

참고: intragastric gavage의이 방법에 적용할 수는 용기 예 미 식민지 다른 세균 종 TyphimuriumC. rodentium, Listeria monocytogenes.

  1. 6-8 주-오래 된, 특정 병원 체 자유롭게 (SPF)을 사용 하 여 헬리코박터-남성 또는 여성 쥐를 무료. C57BL/6 유전 배경으로 동물을 사용 하 여 헬리코박터 와 H. felis감염 실험에 대 한. 현재 연구에서 우리 야생-타입 (WT)를 사용 하 고 유전자 변형 C57BL/6 쥐 (노크 아웃 또는 코 동물 불리) 키 타고 난 면역 수용 체 부족.
    그러나 참고: 헬리코박터 감염에 대 한 다른 유전 배경에 마우스를 사용하실 수 있습니다, 그리고, 식민지 수준 및 질병 심각도 수 있습니다 의해 영향을 받을 호스트 배경18,19의 종류.
  2. 일회용 1 mL 주사기로 세균 inoculum (단계 1.5)를 발음 하 고 23 게이지 바늘을 부착된 일회용 폴 리 카 테 터 (6-8 cm, 길이, 내부 직경, 0.58 m m)는 제공 된 바늘을 바꿉니다. 플라스틱의 작은 스트립의 적용으로 바늘을 카 테 터를 고정 ( 재료의 표참조) 영화. 또는 살 균 플라스틱 튜브 먹이 사용 하 여 바늘/카 테 터를 교체 (20 게이지 x 38 m m).
  3. 물리적으로 제 목과 꼬리의 아저씨에 확고 한 그립을 쥐 지.
    참고: 마 취, 없이 또는 양자 택일로, methoxyflurane 또는 isoflurane15같은 흡입된 마 취를 사용 하 여가이 절차를 수행할 수 있습니다.
  4. 오픈 턱과 식도 쪽으로 꼬리 방향으로 가이드의 중심에 카 테 터를 삽입 합니다. 대부분까지 (그리고 기도에서) 식도 통해 위장에 대 한 액세스의 용이성 수 있도록 마우스의 목을 확장 또는 카 테 터의 모든는 더 이상 볼 수 하 고 저항 느낌, 복 부의 베이스에 해당. 특정 약 수, 일반적으로 100 μ 접종 (그림 1) 당을 제공 합니다.
    참고: 마우스 ≥ 10 gavaged 해야5 CFU 최적의 식민과 질병 병 리를 보장 하기 위해.
  5. 집 쥐에 실험의 기간에 대 한 SPF 동물 시설.
    참고: 약 24 개월 감염 된 후20에 심각한 병 리와 WT C57BL/6 쥐 선 암 관찰만 됩니다. 그러나,이 효과 일부 유전자 변형된 동물, 또는 다른 유전 배경 가진 생쥐에서 가속 될 수 있습니다.
  6. Gavage 절차의 완료 되 면 수행 가능한 헬리코박터 의 숫자를 결정 하기 위해 마일과 Misra 기술의 수정 박테리아 마우스를 관리. 이 위해,는 inoculum 직렬로 희석 (10− 1 10−5를)에서 BHI 설명 하는 방법을 사용 하 여에서 이전 세부에15.
    참고: 단일 식민지의 격리 수 있도록, HBA 접시 해야 예 열 되며 사용 하기 전에 10-15 분에 대 한 생물 안전 캐비닛 또는 37 ° C 배양 기에서 건조.

3. 수확 후 실험 쥐에서 조직

  1. 이산화탄소 흡입 또는 동물 실험에 대 한 관련 윤리 위원회에 따르면 자 궁 경부 전위 쥐 안락사
  2. 복 부 구멍을 열고 위 괜 찮 아 요, 곡선가 위를 사용 하 여 삭제할.
    참고: 세라 또한 헬리코박터 감염에 조직 응답의 조사에 도움이 심장 찔린 하 여 수집할 수 있습니다. 또한, spleens 및 paragastric 림프절의 컬렉션 적응 면역 응답을 공부에 유용 하다.
  3. 큰 곡률을 따라 위 잘라내어 50 mL 튜브에 잔여 음식 부드러운 버퍼링 멸 균 인산 염 분 세척 (PBS)에 의해 제거.
  4. 살 균 PBS에 다시 위를 세척 하 고 젖은 무게 tared 6 cm 플라스틱 접시를 사용 하 여 기록 합니다.
  5. 복 부를 평평 하 고 각 구성 된 2 개의 동등한 조직 파편으로 sagittally 해 부: 동굴, 몸과 비 선 forestomach 지역 (그림 2). 비-선 영역을 제거 하 고 하나 무게 각의 절반 (가능한 계산)에 대 한 살 균 BHI의 어느 1 mL를 추가 하기 전에 위장 또는 (DNA/RNA 추출)에 대 한 액체 질소 동결 스냅.
    참고: 튜브 포함 된 BHI에 조직 처리할 준비가 될 때까지 얼음에 저장 되어야 합니다. 즉석 냉동된 위 조직 또한 RNA 또는 단백질 정량 (정량 PCR) 또는 서쪽 더 럽 히 분석을 각각 추출 하 사용할 수 있습니다.
  6. 다른 위 10% 포 르 말린을 포함 하는 15 mL 튜브에 절반을 추가 합니다. 조직 10 10% 포 르 말린에 담가 s 다음 튜브의 상단 측면에 평평 하 게 하다. 다시 24 h의 최소 10% 포 르 말린 솔루션에 immersing 전에 해결 하기 위해 조직 수 있습니다.
    참고: 조직 조직학에 대 한 처리 이전에 많은 주 동안 10% 포 르 말린에 남아 수 있습니다. 그러나 조직의 장기간된 보관 수 있습니다,, 그것의 건축 및 antigenicity 다운스트림 분석에 최적의 결과에 결과 영향을.

4. 위 후 감염 세균성 식민지의 확인

  1. 위장에 헬리코박터 의 가능한 계산
    1. 보충 감염된 마우스 위장16에서 식민지 조사를 수행 하기 전에 추가적인 항생제 (200 μ g/mL bacitracin 및 10 μ g/mL naladixic 산)로 살 균 HBA 접시.
    2. 위 섹션 균질 하거나 수동으로 멸 폴 리 프로필 렌 micropestles를 사용 하 여 또는 기계적 분리 악기를 사용 하 여 ( 재료의 표참조).
    3. 살 균 BHI에 결과 위 homogenates의 중복 직렬 희석 (10 10−2를− 1 )를 준비 합니다.
      참고: 희석 결정 되어야 한다 주어진된 헬리코박터 에 대 한 얻은 일반 세균 부하에 따라 변형 사용 감염, 감염의 기간에 대. Undiluted 샘플도 사용할 수 있습니다.
    4. (위의 참고 참조) 미리 말린된 HBA 접시 3 개 또는 4 개의 세그먼트로 나눕니다. 마일즈와 Misra 기술에의 적응을 사용 하 여, 10-100 mL의 각 희석 한 천 격판덮개의 세그먼트에 추가 하 고 메 마른 플라스틱 루프15를 사용 하 여 확산.
    5. 접시 건조 하 고 혐 기성 가스 항아리에 거꾸로 위치 (아래 뚜껑 쪽)에 그들을 배치 수 있습니다. 항아리에 습도 유지 하려면 물을 포함 하는 페 트리 접시를 포함 합니다.
    6. 식민지 형성 (일반적으로 4-7 일) 때까지 37 ° C에서 항아리를 품 어.
    7. 고립 된 식민지 10와 100 사이 포함 하는 부합을 열거 합니다.
      참고: 헬리코박터 식민지와 H. felis 성장 판에는 표준 urease, 카 탈 라 제 및 산화 효소 테스트를 사용 하 여 murine 위 microbiota의 다른 구성원의 구분할 수 있습니다. 헬리코박터 와 H. felis 는 모든 3 개의 시험에 대 한 긍정적 이다입니다.
    8. 박테리아 로드 (CFU/g의 조직)로 계산 다음 수식을 사용 하 여:
      [(계산 하는 식민지의 평균 수) × (희석 비율) (볼륨 도금) x] / (위 무게).
  2. 위 조직에 의해 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에서 H. felis 감염의 탐지
    1. 표준 DNA 격리 프로토콜, 또는 상업적으로 사용할 수 있는 키트를 사용 하 여 마우스 위장에서 DNA를 추출 합니다.
    2. Fluorometric 정량 기법을 사용 하 여 샘플의 DNA 농도 결정 ( 재료의 표참조).
    3. PCR 반응 H. felis urease B 유전자 (ureB)21의 325 기본적인 쌍 (bp) 단편을 대상으로 설정 합니다. 각 반응 포함 해야 합니다: 100 ng의 genomic DNA; 앞으로의 각 1 밀리미터 (5'-AAA ATC CAC GAA GAC TGG GG-3')와 역 (5'-CTT TTA TCC 아 그 TGG TGG CAC ACC-3') 뇌관; 200mm dNTPs; Taq 중 합 효소 및 버퍼 및 물 nuclease 무료의 적절 한 금액의 0.5 단위.
      참고:이 oligonucleotide 쌍 인식 하 고 헬리코박터 와 H. felis ureB 유전자 PCR 조건 아래, 그는 ureB 에 복종 하지만 동종 시퀀스에 바인딩할 설계 되었습니다. 장 헬리코박터 종의 유전자
    4. 다음 온도 프로 파일을 사용 하 여 PCR 증폭을 수행: 30 94 ° C의 35 주기 다음 5 분 동안 94 ° C에서 난방, s, 61 ° C 30 s 및 1 분에 72 ° C, 20 ° c.에서 개최 전에
    5. 100 V에서 30 분 동안 2 %agarose 젤에 PCR 제품을 실행 합니다.

5. 조직학 분석 헬리코박터의감염 마우스 위 섹션

  1. 위 조직의 처리
    1. 포 르 말린 및 깨끗 한 접시에 장소에서 위장 조직을 제거 합니다.
    2. 여러 동등한 크기의 경도 스트립 (각 2-3 m m 두께)으로 메스와 위 조직을 잘라내어 거품 패딩 포함 이라는 포함 카세트에.
    3. 위 조직을 포함 카세트 80% 에탄올으로 가득 항아리에 배치 하 여 수정.
      참고: 위장 즉시 처리 또는 다음 단계로 진행 하기 전에 최대 1-2 일 동안 저장 될 수 있습니다.
    4. 다음 설정을 사용 하 여 프로그래밍 하는 자동화 된 조직 프로세서에 프로세스 위장.
      탈수: 70% 에탄올-1 사이클, 20 분; 90% 에탄올-1 사이클, 20 분; 100% 에탄올-2 사이클, 20 분 + 40 분 + 1 주기 1 주기 1 h.
      지우기: 자일 렌-2 사이클, 각 30 분 + 1 주기, 45 분
      임신: 파라핀 왁 스 60 ° c-1 주기, 45 분 + 1 사이클, 1 h + 1 주기, 1.25 h.
    5. 기계에서 가공된 샘플을 제거 하 고 파라핀 포함을 위한 실내 온도에 저장.
  2. 파라핀 처리 위 조직 포함
    1. 스테인리스 기본 금형 금형의 기초를 따뜻하게 포함 단위의 단계에 놓습니다.
      참고: 컴퓨터를 포함 효율적인 파라핀 포함을 위한 60 ° C에서 설정 해야 합니다.
    2. 장소에는 왁 스를 완전히 녹이 고 때까지 포함 단위의 따뜻한 왁 스 목욕/핫 플레이트 영역으로 샘플을 포함 하는 카세트 왁 스 칠.
      참고: 잠시 후 왁 스를 녹이 고 샘플 포함 될 것이 좋습니다. 이렇게 하면 조직의 경화 발생 하지 않습니다.
    3. 파라핀 왁 스로 스테인리스 스틸 금형의 절반을 채우십시오. 따뜻한 집게를 사용 하 여 카세트와 부드럽게 밀어 복 부는 금형 베이스에 파라핀을 통해 스트립에서 위장 조직 스트립을 제거 합니다. 신중 하 게 그들의 슬라이스 끝 위쪽으로 직면 하는 금형의 기지에 직각에 직물 스트립을 찾으시는.
      참고: 다음 단계에 따라 수행 되어야 한다 경화 및 임베디드 블록 내의 파라핀 층의 분리를 피하기 위해 가능한 한 빨리. 위 조직의 적절 한 방향을 다운스트림 분석에 대 한 중요 하다.
    4. 장소에는 표본을 수정 하 고 필요한 경우 다시 조직 찾으시는 포함 단위의 차가운 접시에 금형을 놓습니다.
      참고: 조직 제거 되는 파라핀 강화 하기 시작 하는 경우에, 다시 왁 스를 녹여 다시 금형에 조직을 포함 하는 뜨거운 접시에 금형 장소.
    5. 절반 이라는 포함 카세트 (조직 처리를 위해 사용 되었다)는 금형의 상단에 배치 하 고 부드럽게 따뜻한 왁 스로 채우십시오. Overflow에 파라핀을 허용 하지 않습니다.
    6. 부드럽게 금형 차가운 접시에 놓고 시원한 수 있습니다.
    7. 파라핀 완전히 설정 했습니다, 일단 금형에서 포함 된 블록을 구분 합니다. 핫 플레이트 (80 ° C 이상 설정) 또는 스 크레이 퍼를 사용 하 여 카세트 가장자리에 깨끗 한 초과 파라핀 왁 블록 단면 수행 됩니다 때까지 실내 온도에 저장할 수 있습니다.
  3. 조직의 단면
    1. 얼음에 파라핀 끼워 넣어진 조직 구획을 진정 하 고 열 40-45 ° c 초순 가득 물 목욕
    2. 블레이드는 톰의 소유자에서를 보호 하 고 클리어런스 각도 사이 1-5 ° 파라핀 블록을 삽입 하기 전에 블록 얼굴과 칼 면 사이 접촉을 방지 하기 위해 설정 합니다.
      참고: 확인 하십시오 블록 초과 파라핀 포함에서 취득의 취소로이 블록의 적합을 방해할 수 있습니다.
    3. 블록에 걸쳐 직선 컷에 대 한 블레이드를 찾으시는. 부드럽게 2-3 블록의 정확한 위치를 보장 하기 위해 얇은 섹션을 잘라.
    4. 약 10-30 m m의 두께 의해 블록을 잘라. 이 단계는 각 조직 스트립의 최대 면적 삭감 될 것 이다 보장 합니다.
    5. 10 µ m 및 트리밍에 의해 발생 하는 구멍을 포함 하는 삭제 컷.
    6. 신중 하 게 핀셋을 사용 하 여 섹션을 선택 하 고 병합에 대 한 물 욕조에 떠. 족집게를 사용 하 여 각 섹션을 구분 하.
    7. 물 목욕 및 충전된 유리 슬라이드 ( 재료의 표참조)에 장소에서 섹션을 수집 합니다.
    8. 수직 슬라이드 랙에서 슬라이드를 저장 하 고 37 ° c.에는 인큐베이터에 배치 하룻밤 건조 섹션입니다.
    9. 섹션 무기한 후속 분석을 위해 실내 온도에 저장 합니다.
  4. Haematoxylin와 오신 (H & E) 위 조직의 얼룩이 지기
    1. 100% 에탄올, 3 분 동안에 3 세척 뒤 5 분 각, 크 실 렌의 3 세척을 사용 하 여 슬라이드에 dewax. 신선한 솔루션 각 단계에서 사용 되는 확인 하십시오.
    2. 슬라이드 30-60 s에 대 한 수돗물에 씻어.
    3. 부드럽게 종이 타월에 슬라이드의 하단을 활용 하 여 초과 물을 제거 합니다. 3 분 확인 섹션에 대 한 필터링 된 Haematoxylin와 얼룩 충분히 솔루션으로 덮여 있다.
    4. 린스 수돗물 물 실행 취소 될 때까지 실행 슬라이드.
    5. 슬라이드 8-10에 대 한 스콧의 수도 물에 담근 다. 슬라이드 10 보다 더 많은 솔루션을 제공 하지 않습니다이 s 어둡고 강렬한 얼룩 귀 착될 것 이다. 섹션의 얼룩은 현미경으로 볼 수 있습니다. 이 단계에서 효율적인 착 색 하는 것은 ' 아기 파란색 ' 색 귀 착될 것 이다.
      참고: 2 g의 나트륨 수소 탄산염 (NaHCO3) 및 증류수 1 L에 황산 마그네슘 (MgSO4)의 20 g을 용 해 하 여 스콧의 수돗물을 준비 합니다.
    6. 슬라이드 30-60 s에 대 한 수돗물에 씻어.
    7. 3 단계에서 설명한 대로 과잉의 물을 제거 하 고 필터링 된 1%와 함께 다음 얼룩이 수성 오신 3 분.
    8. 린스 수돗물 물 실행 취소 될 때까지 실행 슬라이드.
      참고: 얼룩 수 부과 가벼운 현미경을 사용 하 여. 얼룩이 너무 어두운 경우, 슬라이드에 지정된 된 시간 보다 더 오랫동안 100% 에탄올 탈수 수 있습니다. 어두운 착 색 하는 것이 필요한 경우 슬라이드 수 있습니다 얼룩이 질 오신으로 1-2 분 이상, 다음 단계로 진행 하기 전에.
    9. 30에 대 한 100% 에탄올의 3 세척을 사용 하 여 슬라이드를 탈수 s 각, 뒤에 2 분 동안 크 실 렌의 3 세척. 신선한 솔루션 각 단계에서 사용 되는 확인 하십시오.
    10. 설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 합니다. 부드럽게 아래쪽으로 직면 하는 섹션 상단에 슬라이드를 배치 하기 전에 깨끗 한 coverslip의 센터에서 장착 매체의 한 방울을 추가 합니다.
      참고: 슬라이드 덮개 미 끄 러 전에 건조 하지 마십시오.
    11. 슬라이드를 평평한 표면에 놓고 건조 공기를 허용 합니다. 슬라이드 또한 건조 시를 가속화 하는 증기 두건에서 건조 수 있습니다.
  5. 위 조직의 Giemsa 얼룩
    1. 100% 에탄올 3 분의 2 세척 및 최종 세척 3 분 확인 각 세척에 사용 되는 신선한 솔루션에 대 한 70% 에탄올에 5 분 각, histolene의 2 세척을 사용 하 여 슬라이드에 dewax.
    2. 슬라이드 30-60 s에 대 한 수돗물에 씻어.
    3. 20 %Giemsa 얼룩 소 주 80% 물으로 혼합 하 여 Giemsa 솔루션을 준비 합니다. 슬라이드 1 h Giemsa 솔루션 얼룩.
    4. 2-3 s 대 한 초 산의 3-4 방울을 포함 하는 증류수 100 mL에 슬라이드를 배치 합니다.
      참고: 솔루션 사용 하기 잘 전에 혼합 해야 합니다. 이 단계에서 슬라이드 하늘색 컬러로 표시 됩니다.
    5. 30 96% 에탄올에 슬라이드를 씻어 s.
    6. Histolene 2 분의 3 목욕 뒤 소 프로 파 놀, 각 2 분의 3 목욕에서 슬라이드에 씻어. 각 세척에 대 한 신선한 소 프로 파 놀과 histolene를 사용 합니다.
    7. 앞에서 설명한 대로 Coverslip 장착 매체와 슬라이드.

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결과

이 프로토콜 murine 마우스 모델 (그림 1) 헬리코박터 와 H. felis intragastric 감염을 달성 하는 구강 기법을 설명 합니다. 안락사, 다음 위장은 제거, 무게와 동굴, 몸과 위 조직 (그림 2)의 선 비 영역을 구성 하는 2 동등한 반으로 나누어. 선 비 지역 어떤 분석을 수행 하기 전에 제거 됩니다.

동물의 성공적인 식민지는 일반적으로 헬리코박터에 가능한 계산을 수행 하 여 확인-위 homogenates, 감염 하 고 이후에 HBA 접시 (그림 3)에 개별 식민지를 열거. 또는, PCR H. felis H. felis 와 H. pylori ureB 유전자 (그림 4...

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토론

이 프로토콜에서는 헬리코박터 감염에 대 한 vivo에서 마우스 모델의 사용을 설명합니다. 절차의 중요 한 단계는: 1) 포함 하는 실용적이 고 운동 박테리아; Helicobacter inocula의 준비 2) intragastric gavage;를 통해 마우스를 박테리아의 적절 한 숫자의 배달 3) 식민지 계산 및/또는 PCR; 세균 감염의 탐지 그리고 4) 위 조직의 활성화에 histopathology 평가 처리 위장 감염. 수정, 문제 해결 및 기술 고려 사항에 대 한 추가 제안 아래 설명 되어 있습니다.

혈액 한 천 자료 2 말 혈액 보충을 사용 하 여 헬리코박터 종 성장의 방법은 우리의 실험실에서 잘 설립 되었습니다. 그러나, 대체 한 기지와 같은 세라 한과 컬럼비아 혈액 한 천 사용된22에 영향을 수도 있습니다. 만 메 마른 유리 세제 무료 성장 매체를 준비 하는 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자 양 A. 드 바울은 양 조지 레이-맥 캔 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 저자는 시설의 사용 및 기술 지원의 모나 쉬 조직학 플랫폼, 부의 해부학과 발달 생물학, 모나 쉬 대학 인정합니다. 실험실은 RLF (APP1079930, APP1107930)는 국민 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC)에서 자금에 의해 지원 됩니다. RLF는 NHMRC (APP1079904)에서 수석 연구 장학금에 의해 지원 됩니다. KD와 MC 둘 다 모나 쉬 대학원 장학금에 의해 지원 됩니다. KD는 또한 지원 센터에 의해 타고 난 면제 및 전염 성 질병, 허드슨 연구소, 의료 연구의 MC는의 학부, 간호 및 건강 과학, 모나 쉬 대학에서 국제 대학원 장학금. 연구에는 허드슨 연구소의 의학 연구는 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램에 의해 지원 됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Bacteriological reagents
Oxoid Blood Agar Base No.2Thermo Fischer ScientificCM0271B살균 전에 탈이온화된 물에 용해
프리미엄 제세마 혈액Australian Ethical BiologicalsPDHB100
Bacto Brain Heart Infusion BrothBD Bioscience237500살균 전에 탈이온화된 물에 용해
CampyGen 가스 팩Thermo Fischer ScientificCN0035A/CN0025A
Histological reagents
Formalin, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128
Absolute alcohol, 100% DenaturedChemSupplyAL048-20L-P
이소프로판올(2-프로판올)Merck100995
Xylene(무황)ChemSupplyXT003-20L
Mayer's HaematoxylinAmber ScientificMH-1L필터 사용 전
Eosin, 수성 염색Amber ScientificEOCA-1L필터 사용 전
Wright-Giemsa Stain, modifiedSigma AldrichWG80-2.5L사용 전 희석(Giemsa 20%, 탈이온수 80%)
HistoleneGrale Scientific11031/5
DPX 마운팅 매체VWR1.00579.0500
Molecular biology reagents
Qubit dsDNA BR Assay KitThermo Fischer ScientificQ32850
올리고뉴클레오티드Sigma Aldrich이 연구에서 사용된 ureB 프라이머의 어닐링 온도는 61°C입니다. C
GoTaq Flexi DNA PolymerasePromegaM8291키트에는 10x PCR 완충액 및 염화마그네슘
dNTP가 포함되어 있습니다.BiolineBIO-39028사용 전 멸균 뉴클레아제가 없는 물에서 10mM로 희석
분자 등급 AgaroseBiolineBIO-41025
탄산수소Univar (Ajax Fine Chemicals)A475-500G
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트Chem-SupplyMA048-500G
Antibiotics
VancomycinSigma AldrichV2002-1G탈이온수에 용해
Polymyxin BSigma AldrichP4932-5MU탈이온수에 용해
Trimethoprim (≥ 98% HPLC)Sigma AldrichT7883100%(절대) 에탄올
암포테리신Amresco (Astral Scientific)E437-100MG탈이온수에 용해
Bacillus licheniformisSigma AldrichB0125탈이온수에 용해
Naladixic acidSigma AldrichN8878탈이온수에 용해
기타 시약
Methoxyflurane (Pentrhox)Medical Developments International해당
파라핀 왁스Paraplast Plus, Leica Biosystems39601006
장비 및 플라스틱 제품
Oxoid 혐기성 항아리Thermo Fischer ScientificHP0011/HP0031
COPAN 파스퇴르 피펫Interpath Services200CS01
Eppendorf 5810R 원심분리기2,200 rpm에서 4°F에서 10분 동안 원심분리로 세균 펠릿 수집; C
23 g 정밀 글라이드 바늘BD Bioscience301805
Parafilm MBemis, VWRPM996
Portex 세밀 보어 폴리에틸렌 튜빙Smiths Medical800/100/200
플라스틱 급식 카테터Instech  LaboratoriesFTP20-30
1 mL tuberculin luer slip 일회용 주사기BD Bioscience302100
1.2 - 2 mL 튜브용 Eppendorf micropestleSigma AldrichZ317314위 균질화에 사용되는 오토클레이브 폴리프로필렌 유봉
GentleMACs DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235마우스 위 조직에 사전 설정된 gentleMACS 프로그램 사용
M 튜브 (주황색 캡)Miltenyi Biotec30-093-236
Qubit 형광계Thermo Fischer ScientificQ33216
멸균 플라스틱 루프LabServLBSLP7202
냉각판, Leica EG1160 임베딩 시스템Leica Biosystems해당
Tissue-Tek Base Mold System, Base Mold 38 x 25 x 6Sakura, Alphen aan den Rijn4124
Tissue-Tek III Uni-Casette 시스템사쿠라, Alphen aan den Rijn4170
Microtome, Leica RM2235Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus 유리 슬라이드Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific4951PLUS4
은 합니다. 나트륨 없음없음

참고문헌

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