단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

요약

이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.

초록

Circadian 맥 박 조정기 회로 리듬 행동과 생리 적인 출력 일 또는 밤 주기 등 환경 신호 조정 총괄. 각 맥 박 조정기 뉴런 내에서 분자 시계 유전자 발현, 기초 회로의 작동에 필수적인 리듬 신경 기능에에서 circadian 리듬을 생성 합니다. 맥 박 조정기의 다른 서브 클래스에서 개별 분자 발진기와 신경 신호와 상호 작용의 속성의 조사 circadian 맥 박 조정기 회로의 더 나은 이해를 생성 합니다. 여기, 우리 제시 시간 경과 형광 현미경 접근 시계 교양된 초파리 애벌레 두뇌의 신경에 있는 분자 시계를 모니터링 하기 위해 개발. 이 메서드는 단일 셀 해상도 유전자 인코딩된 형광 circadian 기자의 리듬의 여러 날 녹음을 수 있습니다. 이 설치 밀접 하 게 다양 한 화합물의 분자 시계 실시간 응답을 분석 하는 약리 조작 결합 될 수 있다. Circadian 리듬, 넘어 강력한 초파리 유전자 기술 함께에서이 다목적 방법 라이브 뇌 조직에서 다양 한 신경 분자 과정을 공부 하는 가능성을 제공 합니다.

서론

Circadian 시계 도움이 지구의 24 시간 회전에 의해 생성 된 주기적인 환경 변화에 적응 하는 생물. 연동된 transcriptional 변환 피드백 루프는 일반적으로 종¹에 걸쳐 circadian clock의 분자 기계를 기반이 됩니다. Circadian 심장 박 동기 회로 구성 포함 하는 클록의 명암 (LD) 등 통합 하는 매일의 과다의 리듬을 온도 사이클 환경 단서에 의해 전달 하는 일의 시간 정보를 통합 하는 신경 생리와 행동 프로세스^2,3. 신경 입력 / 출력을 갖는 분자 리듬의 조정 circadian 회로 하지만 부분적 으로만 이해 하는 남아의 작업에 대 한 비판적으로 중요 하다.

초파리, 분자 시계의 코어에 클록/사이클 (CLK/CYC) heterodimer 활성화 기간 (당)의 전사와 영원한 (팀). 당 및 팀 복합물을 형성 하 고 그들은 CLK/CYC 그리고 결과적으로 그들의 자신의 전사의 transcriptional 활동을 억제 핵를 입력 합니다. Post-transcriptional 및 포스....

프로토콜

1. 문화 후드 재고 솔루션의 준비

1. 400 mL 슈나이더 활성 매체 (SAM) x 1 (참조^24,25수정) 애벌레 머리의 비보 전 문화에 대 한 최적화의 준비 (표 1). 5 mL 및 플래시 약 수-80 ° c.에 저장, 액체 질소 (선₂) 고정
2. 재고 솔루션 (참조²⁶수정) x 10 희석 Dissecting 염 (DSS) x 1을 준비 (표 2).
3. Aliquot fibrinogen 10mg을 4 ° c 단일 사용에 대 한 저장소.
   주의: 층 류, 장갑, 그것은 유해한 입고 아래 fibrinogen 무게.
4. SAM에서 트 롬 빈 재고 솔루션을 준비 (1500 NIH 단위/밀리 그램) 및 10 µ L aliquot, 플래시 LN₂ 에 고정 시키고-80 ° c.에
   주의: 그것은 유해한 트 롬 빈을 처리할 때 장갑을 착용 한다.
5. 100의 aliquot 재고 솔루션 페니실린 스 x. -20 ° c.에 계속
6. 소계 (PTFE) 멤....

결과

여기, 우리가 애벌레 뇌 문화 비보 전 기자 식에 PDF 목욕 응용 프로그램의 라이브 이미징 결과에 circadian 형광 기자의 장기 기록의 대표적인 결과 보여줍니다.

비 방황 L3 유 충 분자 시계 기자 당 TDT와 UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4 (그림 1C) LD. 두뇌에서 개입 했다 시계 신경 드라이버에 의해 구동 해 부 되었고 마지막 동안 장기 문화에 대 한 설정 그냥 사전 LD 주기의 단계 빛 어두운 단계 (그림 1A 와 2B). 시간 경과 영상 DD에서 수행 하 고 뇌 explants 64 h에 대 한 모든 2 h 몇 군데 있었다. 관심의 뉴런을 포함 하는 합계 .......

토론

여기 우리 교양된 애벌레 머리의 장기 형광 시간 경과 현미경에 대 한 방법을 설명합니다. 이 유형의 실험의 성공에 따라 달라 집니다 문화, 건강 등의 여러 요소 두뇌 explant, 형광 강도 및 기자, 시간적 및 공간적 해상도의 신호 대 잡음 비율의 동원 정지를 위한 방법 및 explant에 대 한 접근 이러한 요소는 상호 배타적 될 수 있습니다. 예, 문화, 건강에 영향을 미치는 시간 경과 주파수를 증가 하 고 뇌 explant의 동원 정지 가스 교환을 방해 수도. 따라서, 연구에서 현상에 대 한 (말 장난 의도) 중 찾는 성공적인 프로토콜 열쇠입니다. 여기 설명 하는 방법은 일 시간 규모에서 형광 circadian 기자의 식 모니터링 최적화 됩니다. 그것은 또한 중요 한 프로세스는 불변 하 고 주의 실행 초파리 신경 생물학에 다른 과목 공부에 적용 됩니다.

이 프로토콜에서 뇌 explants는 3D 매트릭스를 생성 하는 섬유 소 응고에 움직일 수 있습니다. .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	실험실에 있는 것과 정확히 같은지 확신할 수 없습니다. 가능한 한 "곤충 세포 배양에 적합"을 선택했습니다
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
D-(+) 포도	시그마-알드리치	G7021
효모 추출물	시그마-알드리치	Y1000
인슐린	시그마-알드리치	I0516-5ML
페니실린-스트렙토마이신	시그마-알드리치	P4333
BIS-트리스	시그마-알드리치	B4429
L-(&마이너스;)-사과산	시그마-알드리치	M7397
D-(+)-트레할로스 이수화물	시그마-알드리치	T0167
숙신산	시그마-알드리치	S9512
푸마르산	시그마-알드리치	F8509
&알파;-케토글루타르산	시그마-알드리치	K1128
비열 불활성화, 태아 송아지 혈청(FCS) 마이코플라스마 및 바이러스 스크리닝	BioConcept Ltd. Amimed	2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7.4	E& K Scientific Products	EK-654011
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S5011
설탕	Sigma-Aldrich	S7903
소 혈장에서 추출한 피브리노겐	Calbiochem (Merck)	341573-1GM	주의: 흡입, 피부 접촉 및 삼키면 유해합니다.
소 플라즈마의	Sigma-Aldrich	T9549	주의: 건강 위험, 장갑
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH	Chi Scientific	맞춤형
진공 그리스	Sigma-Aldrich	18405
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