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방법 논문

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

7.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57015

⸱

2018년 1월 19일

 , 
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.

초록

Circadian 맥 박 조정기 회로 리듬 행동과 생리 적인 출력 일 또는 밤 주기 등 환경 신호 조정 총괄. 각 맥 박 조정기 뉴런 내에서 분자 시계 유전자 발현, 기초 회로의 작동에 필수적인 리듬 신경 기능에에서 circadian 리듬을 생성 합니다. 맥 박 조정기의 다른 서브 클래스에서 개별 분자 발진기와 신경 신호와 상호 작용의 속성의 조사 circadian 맥 박 조정기 회로의 더 나은 이해를 생성 합니다. 여기, 우리 제시 시간 경과 형광 현미경 접근 시계 교양된 초파리 애벌레 두뇌의 신경에 있는 분자 시계를 모니터링 하기 위해 개발. 이 메서드는 단일 셀 해상도 유전자 인코딩된 형광 circadian 기자의 리듬의 여러 날 녹음을 수 있습니다. 이 설치 밀접 하 게 다양 한 화합물의 분자 시계 실시간 응답을 분석 하는 약리 조작 결합 될 수 있다. Circadian 리듬, 넘어 강력한 초파리 유전자 기술 함께에서이 다목적 방법 라이브 뇌 조직에서 다양 한 신경 분자 과정을 공부 하는 가능성을 제공 합니다.

서론

Circadian 시계 도움이 지구의 24 시간 회전에 의해 생성 된 주기적인 환경 변화에 적응 하는 생물. 연동된 transcriptional 변환 피드백 루프는 일반적으로 종1에 걸쳐 circadian clock의 분자 기계를 기반이 됩니다. Circadian 심장 박 동기 회로 구성 포함 하는 클록의 명암 (LD) 등 통합 하는 매일의 과다의 리듬을 온도 사이클 환경 단서에 의해 전달 하는 일의 시간 정보를 통합 하는 신경 생리와 행동 프로세스2,3. 신경 입력 / 출력을 갖는 분자 리듬의 조정 circadian 회로 하지만 부분적 으로만 이해 하는 남아의 작업에 대 한 비판적으로 중요 하다.

초파리, 분자 시계의 코어에 클록/사이클 (CLK/CYC) heterodimer 활성화 기간 (당)의 전사와 영원한 (팀). 당 및 팀 복합물을 형성 하 고 그들은 CLK/CYC 그리고 결과적으로 그들의 자신의 전사의 transcriptional 활동을 억제 핵를 입력 합니다. Post-transcriptional 및 포스트 번역 상 규정 CLK/CYC-중재 전사와 당에 의해 억압 사이 지연이 발생할 / 팀, 24 h 분자 진동1,,34 년경의 세대를 보장 . 이러한 분자 시계 폼을 포함 하는 약 150 신경 성인 circadian 동작을 제어 하는 회로5를이동 합니다. 훨씬 더 간단한 아직 완전 하 게 작동 circadian 회로-5 복 부 측면 뉴런 (LNvs; 4 PDF 확실성 LNvs 및 하나의 PDF 음수가 LNv, 아래 참조), 2 등 쪽 신경 1 (DN1s)과 2 등 쪽 신경 2s (DN2s)-시계 뉴런의 3 그룹의 구성 된는 애벌레에 존재 하는 뇌6,7.

간단한 애벌레 circadian 회로 간 신경 통신 및 분자 시계 사이의 상호 작용을 공부 하는 우수한 모델을 제공 합니다. 우리의 새로 개발된 된 형광 기자 당-TDT를 단백질의 subcellular 위치 당의 수준, 모방을 사용 하 여 우리 하고자 했다 애벌레 circadian 회로 에 다른 시계 신경 하위 그룹에 분자 시계의 역학 특성 8. 또한, 4 LNvs 신경 레벨9,,1011circadian 리듬을 조절에 의해 생산 하는 neuropeptide 안료 분산 요소 (PDF)의 핵심적인 역할을 알고, 우리가 하 고 싶 었 직접 검사 분자 시계에 PDF의 효과입니다. 이 위해, 우리는 애벌레 뇌에서 리듬 시간 경과 confocal 현미경 검사 법에 의해 여러 일 동안 explant circadian 유전자 발현을 모니터링 하는 방법을 개발 했다. 프로토콜 당 TDT의 수준에 PDF 또는 다른 화합물의 효과 테스트 하는 약리 분석 실험에 대 한 적응도 했다. 따라서, 적응 뇌 explant 문화 약물 응용 프로그램에 액세스할 수 만들기, 시간적 해상도 증가 하 고 짧은 기간에 대 한 이미징 구성 되어 있습니다.

다른 발달 단계에의 초파리 두뇌의 비보 전 문화 이전 설립된12,13,,1415,16,17 되었습니다. ,18. 반면 이러한 프로토콜 이미징 다양 한 생물학 현상에 대 한 사용 되었습니다, 그들 중 일부는 단일 셀 해상도 이미지와 호환 되지 않는 또는 몇 시간에 대 한 문화를 지원 하지 않습니다. 초파리 에서 circadian 뉴런의 장기 라이브 영상을 수행 하는 대체 방법을 분자 리듬19,,2021 의 생물 발광 영상 등의 형광 이미징 칼슘 표시기 빛 시트 현미경22,23. 생물 발광 영상 더 높은 시간 해상도 얻을 수 있지만 가벼운 시트 현미경 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 적응 하실 수 있습니다 그들은 공간 해상도에 제한 되 고 특수 현미경 시스템 필요.

여기 설명 하는 방법은 여러 일 동안 단일 셀 해상도에서 전체 뇌 문화에 형광 신호를 시각화 하기 위해 지어진 다. 이 손쉬운 방법과 다양 한 교양 이미지 성인 비행 두뇌와 초파리 신경 생물학에 있는 많은 다른 문제를 연구 하는 약리 실험에 대 한 적응 될 수 있습니다.

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프로토콜

1. 문화 후드 재고 솔루션의 준비

  1. 400 mL 슈나이더 활성 매체 (SAM) x 1 (참조24,25수정) 애벌레 머리의 비보 전 문화에 대 한 최적화의 준비 (표 1). 5 mL 및 플래시 약 수-80 ° c.에 저장, 액체 질소 (선2) 고정
  2. 재고 솔루션 (참조26수정) x 10 희석 Dissecting 염 (DSS) x 1을 준비 (표 2).
  3. Aliquot fibrinogen 10mg을 4 ° c 단일 사용에 대 한 저장소.
    주의: 층 류, 장갑, 그것은 유해한 입고 아래 fibrinogen 무게.
  4. SAM에서 트 롬 빈 재고 솔루션을 준비 (1500 NIH 단위/밀리 그램) 및 10 µ L aliquot, 플래시 LN2 에 고정 시키고-80 ° c.에
    주의: 그것은 유해한 트 롬 빈을 처리할 때 장갑을 착용 한다.
  5. 100의 aliquot 재고 솔루션 페니실린 스 x. -20 ° c.에 계속
  6. 소계 (PTFE) 멤브레인의 동그라미를 잘라 (자료 표 참조) 유리 하단 접시의 안쪽에 맞는 크기를. 70%에 그들을 씻어 EtOH와 다음에 압력가 dH2O. Sterilize UV와 층 류에서 건조. 멸 균 페 트리 접시에 계속. 단일 사용 합니다.
    참고: PTFE 가스 교환을 허용 하 고 장기적인 기록 중 증발에서 매체를 방지 하는 다공성 유연한 멤브레인입니다.

2. 시간 경과 현미경 설치

참고: 다음 설치 연동 스캐너 거꾸로 confocal 현미경에 대 한 (자료 표 참조) 갖추고 있다 공명 스캐너 (8000 Hz). 시스템 공명 스캐너 함께 phototoxicity 및 photobleaching를 방지 하는 매우 중요 한 사진 배율 검출기를 포함 되어 있습니다. 온도 및 습도 제어 됩니다 현미경 환경 챔버 내에서 하는 현미경의 대부분을 커버 ( 자료 표참조).

  1. 무대-가기 습기 장소입니다.
  2. 25 ° C와 80% 습도에 현미경 챔버 equilibrate를 온도 및 습도 컨트롤러를 켭니다.
  3. 지속적인 암흑 (DD)에서 실험을 수행, (현미경 챔버는 불투명 재료의 만든) 않으면 불투명 천으로 현미경 환경 챔버를 커버.
  4. 물 침수 목표를 사용 하 여 목표 위에 물 침수 마이크로 디스펜서 놓고 하는 동안 시간 경과 영상 일정 한 속도로 물 걸 Autoimmersion 목표 컨트롤러 소프트웨어 프로토콜 프로그램.
    참고: 물 디스펜서 또는 건조 렌즈 물 침수 목표는 권장 장기 라이브 이미징, 침수 매체의 다른 유형을 건조 것입니다.
  5. 무대, 습도 챔버 내부에 페 트리 접시 홀더를 배치 합니다.
  6. 현미경 소프트웨어를 실행 하 고 첫 번째 대화 상자에서 스캐너를 공 진 모드를 선택 합니다. 메시지가 표시 되 면 단계를 초기화 하는 확인을 선택 합니다. 구성 탭에 하드웨어 구성 관련 레이저 라인에 스위치를 이동 합니다.
  7. XY 패널 양방향 모드를 선택 하 고 이미지 수집 매개 변수를 설정 하 고 취득 탭 이동 합니다.
    참고: 설명된 영상 설치 여기에 제시 된 (그림 2, 그림 3 과 영화 1) 관찰 circadian 표현의 특정 형광 기자 최적화 됩니다. 다음 매개 변수는 가장 우리의 사양에 맞게 선정 됐다: 40 X 물 침수 목표, 8 X 선 평균 512 × 512 이미지 해상도. 멀티 컬러 이미징에 대 한 순차적 이미지 수집이 필요한 때 한 fluorophore와 다른 중복 (여기, 노란 형광 성 단백질 (YFP) 방출 및 토마토 여기 오버랩의 파장)의 여기 파장의 방출 파장. 그것은 빠른 고 Z 스택의 인수 중 시계 뉴런의 이동은 무시할 수 "스택" 사이 순차 모드를 선택 합니다. 현미경 설정을 각 실험의 목표에 맞게 적응 해야 합니다.

3입니다. 애벌레 두뇌 Explant 문화의 설치

참고: 뇌 explants의 포함 해 부에서 전체 절차 ~ 30 분 걸립니다.

  1. 문화 후드 시 약의 준비입니다.
    1. 트 롬 빈의 약 수를 해 동 하 고 (3.3 단계) 포함 단계까지 실내 온도에 유지. 단일 사용 합니다.
    2. 37 ° C에서 샘의 약 수를 빠르게 해 동 하 고 단일 사용에 대 한 얼음에 계속.
    3. 10 mg/ml fibrinogen의 약 10 밀리 그램 수로 샘을 추가 하 고 부드럽게 터치 포함 단계 (단계 3.3) 및 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 단일 사용 합니다.
      참고: 않습니다 하지 품 어 2 h 이상 fibrinogen 솔루션 유해를 시작으로.
    4. 100 x 재고 페니실린 스의 약 수 동 1 샘의 2.5 mL 준비 페니실린-스 (샘/항생제) x. 실내 온도에서 보관.
      참고: 저장소 나머지 100 x 재고 페니실린 스 4 ° C에서 1 달까지.
    5. 나머지 샘에서 500 µ L의 약 수를 준비 합니다. 얼음에 계속.
    6. 장기적인 이미징에 대 한 유리 하단 접시 (그림 1A)의 바닥의 플라스틱 부분에 압력가 진공 그리스를 적용 하 고 UV 층 류에서 소독.
  2. 중앙 신 경계와 복 부 신경 코드 절 개가 고
    1. 청소는 집게와 2 x 3-잘 유리 해 부 요리 70 %EtOH. 4 우물에 DSS의 400 µ L와 한 우물에서 샘의 400 µ L를 붓는 다. 얼음에 계속.
    2. 애벌레를 포함 하는 비행 중간에 밖으로 푸 고 집게와 방황 아닌 3 탈피 애벌레 (L3)를 선택. 2 DSS 가득 우물에 그들을 연속적으로 린스. 3 DSS 가득 잘 애벌레 anesthetizes 얼음에 그들을 유지.
      참고: L3 지속 25 ° c.에 약 2 일 순수 관련 기간에 뇌를 관찰 하 우리는 방황 아닌 L3 유 충을 사용 하기로 결정 했다. L-LNvs, DN3s, 등 시계 뉴런의 다른 하위 방황 L3 단계에서 형성 시작 하지만 그들은 반드시 자전거 아직 (데이터 표시 되지 않음). 따라서, 이미지 수 시계 뉴런 (데이터 표시 되지 않음),이 단계에서 사이클링 그것 이지만 신중 하 게 데이터 분석에 대 한 개발에서 이미 기능 애벌레 시계 신경 세포를 구별 하는 것이 중요 합니다. 비 방황 L3 25 ° c.에 누워 계란 후 약 4.5 4 일 표시 이 프로토콜을 사용 하 여 circadian 리듬을 공부, 하려면 동기화 (끌고가 다)에서 12 h/12 h LD 개발 애벌레 L3 애벌레를 수집 하기 전에 3 일 동안 25 ° C에서 주기.
    3. 4 DSS 가득 잘, 애벌레,27내부 메서드 사용 하 여 세 정을 위해 사용 되지 않은 어떤 좋은 집게와 애벌레 두뇌를 해 부.
      1. 간단히, 유 충 2에, 부드럽게 입 고리 집게의 쌍 꼬집어 잘라내어 집게, 따라서 뇌를 노출의 다른 쌍을 사용 하 여 몸 벽 내부를 롤. 모든 기도는 시체의 나머지 부분에 연결 된 신경을 절단 하 여 뇌를 무료.
      2. 20 µ L 피 펫 (DSS 미리 씻어 서)와 DSS의 약 3 µ L에서 뇌를 발음 하 고 샘 가득 잘에서 분배. 최대 7 두뇌에 대 한 절차를 반복 합니다.
        주: 해 부 취 애벌레 및 냉장 두뇌 차가운 표면에 수행 되어야 한다. 예를 들어 얼음 냉장 물 순환 펌프에 연결 된 냉각 블록에 해 부 접시를 놓습니다. 해 부 절차 소요 ~ 30의 뇌 당. 그것은 두뇌와 그대로 복 부 신경 코드에 연결 된 눈/더듬이 imaginal 디스크를 유지 하는 것이 중요입니다. 이러한 부분을 찢 어 두뇌를 손상 하 고 문화의 질을 줄일 것입니다. 또한, 공기에 머리를 노출 하지 마십시오. 첫 번째 뇌 해 부 애벌레의 부분을 포함 하는 DSS 위아래로 피 펫을 발음 하기 전에 그것으로 두뇌에서 방지 팁의 벽에 고정 합니다.
  3. 3 차원 매트릭스에 장착 (~ 20 분) 뇌 explants의 포함.
    1. 잠수함 fibrinogen 작업 솔루션 (fibrinogen 최종 농도 ~3.3 mg/mL, 뇌 당 10.5 µ L)에서 해 부 두뇌 다음과 같습니다.
    2. (동일한 팁 섹션 3.2.3에서에서 사용)와 샘/항생제의 3.5 µ L 발음. 동일한 피 펫 팁으로 잘 해 부 해 부 두뇌에 있는 샘/항생제 매체를 분배 하지 않고 발음.
    3. 분배는 두뇌와 멸 균 페 트리 접시의 뚜껑에 매체. 두뇌를 포함 하는 드롭에 샘/항생제의 또 다른 3.5 µ L와 따뜻한 fibrinogen/샘 10 mg/mL 해결책의 3.5 µ L를 추가 합니다. 20 µ L 피 펫 팁 pipetting으로 뇌 주변의 솔루션을 부드럽게 혼합.
      참고:이 단계에서 겸 자 보다는 피 펫을 사용 하 여 강조 하는 두뇌 피 한다.
    4. 2 µ L에서에서 fibrinogen 작업 솔루션의 고 작은 원으로 유리 하단 접시의 coverslip에 적용. 트 롬 빈의 0.8 µ L을 추가 하 고 피 펫 팁 매우 신속 하 게 혼합. fibrinogen 섬유 소에 변환 되 고 유해 하기 시작.
    5. 두뇌 fibrinogen 작업 솔루션 (단계 3.3.1) 집게의 쌍 사이에서 앉아 고 섬유 소의 흰색 매트릭스 표시 되는 행렬에 위치. (시계 신경 세포 이미징)에 대 한 뇌 앞쪽 측면 아래로 동양. 밀어 최대한 가까이 커버 유리에. 섬유 소 응고 섬유 소의 레이어의 구성 됩니다. 한 레이어를 선택 하 고 매트릭스를 분리 하지 않고 작고 부드러운 움직임을 뇌 위에 접어.
      1. 뇌를 안정 시키기 위해 응고의 다른 부분에서 2 ~ 3 회 반복 합니다.
        참고: 때 집게와 두뇌를 처리, 건조 또는 물리적 스트레스 부과 주의 해야 합니다.
    6. 트 롬 빈의 행동을 막으려고 포함된 뇌 위에 샘/항생제의 20 µ L를 추가 합니다.
    7. 나머지 머리를 탑재 하는 절차를 반복 합니다. 그것은 최대 5 유리 하단 접시에 6 두뇌를 포함 수 있습니다.
    8. 장기 라이브 이미징에 대 한 내부 잘 (유리 부분)에서 샘/항생제의 600 µ L를 추가 합니다. 매체 위에 미리 잘라 PTFE 멤브레인을 하단 (3.1.5) (그림 1A)의 플라스틱 부분에 적용 하는 진공 그리스에 그것을 막대기.
    9. 약리학 적인 분석에 대 한 샘/항생제 (그림 1B)의 2 개 mL로 접시를 채우십시오.
      매체의 osmolality은 신경 세포의 생존에 중요 한 참고: 그것을 매체의 증발을 피하기 위해 매우 중요 하다. 따라서, 장기 이미징 실험에 대 한 그것은 문화 접시 PTFE 막으로 밀봉 하는 데 필요한입니다. 반면 단기 실험, 멤브레인 씰링 필요 하지 않습니다 접시 중간의 2 개 mL 가득 고 습도 챔버에 모니터링.

4. 시간 경과 이미지 수집

  1. 페 트리 접시 홀더 무대 최고 습도 챔버 내부에 유리 바닥 접시를 놓습니다.
  2. 인식 탭에서 z-스택 패널에가 고 현미경 소프트웨어 (2 µ m × 40에서 그림 2 와 그림 3, 영화 1에 표시 된 실험)에서 z-섹션 단계를 설정. coverslip와는 coverslip 가까이 뇌 explant의 표면에 끝에서 멀리 비행기에서 z 스택의 시작 부분을 설정 합니다. 비록 뇌 움직임 무시할 수 있습니다, 그리고 시작 및 z 스택의 끝 부분에서 여분의 z-섹션 추가.
  3. 마크 & 패널 설정 다 위치 이미지 수집을 찾을로 이동 합니다. 40 X 목표 1 두뇌 반구 보기의 필드 내에서 캡처할 수 있습니다.
  4. 수집 모드 패널 및 선택 xyzt (z-스택 시간 경과)로 이동 합니다. 시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 주파수 매개 변수 설정.
    참고: 원하는 주파수와 시간 경과 이미지를 취득 합니다. Note 시간 경과 간격 2 시간 보다 짧은 장기 라이브 영상 (24-72 h) 적은 자전거 신경에 있는 결과 경향이 아마도 때문에 뉴런의 생존 능력을 감소 시킨다. 데이터 볼륨 확장 시키는 데이터 분석 및 저장 더 도전 이미지 수집 증가의 비율으로.

5. 약리 치료 단기 라이브 영상으로 뇌 Explants의

참고: 다음 절차는 본질적으로 동일 장기 이미징에 대 한 하지만 PTFE 멤브레인을 필요 하지 않습니다. 화학 물질 문화에 추가 될 때 빛을 파랑 머리 노출 피하려고 현미경 붉은 빛으로 어두운 방에 두어야 한다.

  1. 시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 약물 응용 프로그램 전에 초기 계획 데이터를 스캔 수 설정. 스캔을 시작 합니다.
  2. 베이스 후 검사가 완료 되 면, 현미경 시스템의 스캔 헤드를 리프트. 무대 최고 습도 컨트롤러의 뚜껑을 제거 하 고 매우 신중 하 게 그것을 이동 하지 않고 유리 하단 접시의 뚜껑을 제거 합니다.
  3. 필요한 경우 적절 한 양의 문화 매체를 제거 합니다. 매체에서 실험적인 솔루션을 추가 하 고, 신중 하 게, 아주 부드럽게 조화를 살 균 파스퇴르 피 펫 두뇌 explants 건드리지 않고.
    참고: PDF의 목욕 용, (10 %DMSO)에서 2 µ M PDF 재고 솔루션을 사용 합니다.
  4. 유리 바닥 접시와 습 한 챔버 스캔 머리 뚜껑을 교체 합니다. 사용 하 여, 현미경 챔버 주위 검은 불투명 천으로 재조 정할.
  5. 라이브 스캔 모드에서 그들의 원래 위치에서 두뇌 인지 확인 하십시오. 필요한 경우 조정 합니다.
  6. 시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 스캔 수 설정. 스캔을 시작 합니다.
    참고: 여기 우리가 테스트 시간 경과 이미지 최대 10 h에 대 한 모든 시간을 획득.

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결과

여기, 우리가 애벌레 뇌 문화 비보 전 기자 식에 PDF 목욕 응용 프로그램의 라이브 이미징 결과에 circadian 형광 기자의 장기 기록의 대표적인 결과 보여줍니다.

비 방황 L3 유 충 분자 시계 기자 당 TDT와 UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4 (그림 1C) LD. 두뇌에서 개입 했다 시계 신경 드라이버에 의해 구동 해 부 되었고 마지막 동안 장기 문화에 대 한 설정 그냥 사전 LD 주기의 단계 빛 어두운 단계 (그림 1A 와 2B). 시간 경과 영상 DD에서 수행 하 고 뇌 explants 64 h에 대 한 모든 2 h 몇 군데 있었다. 관심의 뉴런을 포함 하는 합계 ...

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토론

여기 우리 교양된 애벌레 머리의 장기 형광 시간 경과 현미경에 대 한 방법을 설명합니다. 이 유형의 실험의 성공에 따라 달라 집니다 문화, 건강 등의 여러 요소 두뇌 explant, 형광 강도 및 기자, 시간적 및 공간적 해상도의 신호 대 잡음 비율의 동원 정지를 위한 방법 및 explant에 대 한 접근 이러한 요소는 상호 배타적 될 수 있습니다. 예, 문화, 건강에 영향을 미치는 시간 경과 주파수를 증가 하 고 뇌 explant의 동원 정지 가스 교환을 방해 수도. 따라서, 연구에서 현상에 대 한 (말 장난 의도) 중 찾는 성공적인 프로토콜 열쇠입니다. 여기 설명 하는 방법은 일 시간 규모에서 형광 circadian 기자의 식 모니터링 최적화 됩니다. 그것은 또한 중요 한 프로세스는 불변 하 고 주의 실행 초파리 신경 생물학에 다른 과목 공부에 적용 됩니다.

이 프로토콜에서 뇌 explants는 3D 매트릭스를 생성 하는 섬유 소 응고에 움직일 수 있습니다. ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 그의 멘토링에 대 한 마이클 Rosbash를 감사 하 고이 방법의 개발의 초기 단계 지원. 이 작품은 JST 프레스 토 프로그램, 스위스 국립 과학 재단 (31003A_149893 및 31003A_169548), 유럽 연구 회의 (ERC-StG-311194), 노바 티 스 의료 생물 의학 연구 (13A39)에 대 한 재단과 제네바의 대학에 의해 투자 되었다 .

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
KH2PO4Sigma-AldrichP5655실험실에 있는 것과 정확히 같은지 확신할 수 없습니다. 가능한 한 "곤충 세포 배양에 적합"을 선택했습니다
CaCl2Sigma-AldrichC7902
MgSO4.7H2OSigma-Aldrich230391
NaClSigma-AldrichS5886
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
D-(+) 포도시그마-알드리치G7021
효모 추출물시그마-알드리치Y1000
인슐린시그마-알드리치I0516-5ML
페니실린-스트렙토마이신시그마-알드리치P4333
BIS-트리스시그마-알드리치B4429
L-(&마이너스;)-사과산시그마-알드리치M7397
D-(+)-트레할로스 이수화물시그마-알드리치T0167
숙신산시그마-알드리치S9512
푸마르산시그마-알드리치F8509
&알파;-케토글루타르산시그마-알드리치K1128
비열 불활성화, 태아 송아지 혈청(FCS) 마이코플라스마 및 바이러스 스크리닝BioConcept Ltd. Amimed2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7.4E& K Scientific ProductsEK-654011
KClSigma-AldrichP5405
NaH2PO4Sigma-AldrichS5011
설탕Sigma-AldrichS7903
소 혈장에서 추출한 피브리노겐Calbiochem (Merck)341573-1GM주의: 흡입, 피부 접촉 및 삼키면 유해합니다.
소 플라즈마의Sigma-AldrichT9549주의: 건강 위험, 장갑
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OHChi Scientific맞춤형
진공 그리스Sigma-Aldrich18405
35mm 접시, No. 1.5 커버슬립, 20mm 유리 직경, 코팅되지 않은MatTekP35G-1.5-20-C
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishesfisherscientific08-772A
멸균 500 mL Steritop-GP 33 mm 나사형 병 상단 필터, 0.22 μ mMilliporeSCGPS05RE
폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 필름Dupont200A 테플론 FEP 필름
Millex-HV 주사기 필터 유닛, 0.45  &마이크로; m, PVDF, 33  mm, 감마 멸균MilliporeSLHV033RS
Millex-GV 주사기 필터 유닛, 0.22  &마이크로; m, PVDF, 33  mm, 감마 멸균MilliporeSLGV033RS
3웰 유리 해부 접시Any company
Fine typs, size 5, DumontFine Science Tools11254-20
탠덤 스캐너 도립 TCS SP5 컨포칼 현미경, 공진 스캐너 및 HyD 광전자 증배관 검출기 포함Leica microsystem CMS GmbH
온도 제어 챔버라이프 이미징 서비스The CUBE & BOX 온도 제어 시스템, 맞춤형 설계
스테이지 상단 습도 컨트롤러라이프 이미징 서비스맞춤형
침수 마이크로 디스펜서: 디스펜서, 확장 마이크로 펌프 MP6 시리즈 및 자동 침수 목표 컨트롤러 소프트웨어Leica microsystem CMS GmbH
SUM-stack 생성 및 3D 보정 드리프트 플러그인ImageJ 소프트웨어
10x 반복 디콘볼루션AutoQuant 및 Imaris 소프트웨어
. 당 층류 트롬빈 조작

참고문헌

  1. Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
  2. Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
  3. Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , Elsevier. San Diego. 513-551 (2012).
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