간염 E 바이러스 나노 화학 활용 방법을 사용 하 여의 표면 기능화

Summary

우리 theranostic 나노 (HEVNP)으로 간염 E 바이러스 capsid 단백질을 설계 했습니다. HEVNP 자동으로 안정 된 icosahedral 점 막 배달에 조립. 여기, 시스테인, 특히 종양 세포를 묶는 합성 ligands 켤레를 표면 노출 잔류물을 변경 하 여 대상으로 하는 종양에 대 한 HEVNPs의 수정을 설명 합니다.

Abstract

바이러스 같은 입자 (VLPs) 외국 epitopes를 표시 및/또는 검색 및 다양 한 질병의 치료에 작은 분자를 제공 nanocarriers로 사용 되었습니다. 이 응용 프로그램 자기 조립, 유전 수정에 의존 하 고 재조합 VLPs. 종양을 대상으로 하는 응용 프로그램을 수행 하기 위해 시스테인 활용 유전자와 비교 제공 하는 VLPs에 외국 펩 티 드의 수정 혼자, 화학 활용 한 중요 한 다양 한 엔터티, 합성 펩 티 드 등 oligosaccharides, VLP 어셈블리의 변경 없이 변조 하 고 유연한 방식으로 VLPs의 표면에 활용 될 수 있기 때문에 이점.

여기, 다기능 배달 캐리어로 간염 E 바이러스 나노 (HEVNP), 모듈화 된 theranostic 캡슐을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. HEVNPs의 기능 조직 대상으로, 이미징, 및 치료 배달 포함 됩니다. HEVNP의 잘 설립 구조 연구에 따라, 구조적으로 독립적이 고 표면 노출 잔류물 thiol 선택적 연계를 통해 화학 그룹 maleimide 연결에 대 한 활용 사이트 시스테인 교체에 대 한 선정 됐다. 하나의 특정 시스테인 수정 HEVNP (573에 아스파라긴의 Cys 교체 aa (HEVNP-573 C)) 유 방 암 세포 특정 리간드, LXY30에 활용 되었고, 근처-적외선 (NIR) 형광 염료 (Cy5.5), 종양 대상 렌더링으로 표시 효과적인 진단 캡슐 (LXY30-HEVNP-Cy5.5)로 HEVNPs. 비슷한 엔지니어링 전략 theranostic 배달에 잠재적인 응용 프로그램을 탐험 잘 알려진 원자 구조와 다른 고분자 단지와 함께 사용할 수 있습니다.

Introduction

치료 및 진단 배달, nanotheranostics로 알려진에 나노 크기의 벡터의 개발 타겟된 배달¹쪽으로 일반적인된 치료에서 생명 의학 분야의 대부분을 이동 했다. 안정적으로 특정 병에 걸리는 직물 또는 생 화 확 적인 통로^{2,3,4 theranostic 분자를 직접 theranostic 분자와 나노 크기의 벡터 (나노)를 통합 하는 타겟된 nanotheranostic 납품} . 때문에 최적으로 크기의 나노 입자 theranostic 분자의 순환을 안정 한 선택적으로 세포 표면 분자 병 조직에 용량 Nanomedicine 타겟된 배달의 최전선에 왔다. 많은 nanotheranostic 플랫폼은 여전히 수동 셀 이해, 사전 성숙한 저하, 독성, 그리고 theranostic 분자와 부족 한 협회에서 고통. VLPs 많은 타겟된 배달에 이러한 장애물을 극복. 그들은 외국 epitopes를 표시 및/또는 작은 분자를 제공 nanocarriers로 사용 되었습니다: 처방 많은 질병¹전투 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 응용 프로그램의 속성에 주로 의....

Protocol

1. HEVNP 곤충 세포에서 생산

참고: 다음 단계를 모두 셀 문화 후드에서 수행 되어야 합니다. 더 자세한 HEVNP 생산 절차¹¹에 대 한 우리의 이전 게시를 참조 하십시오.

1. 곤충 세포 미디어 ( 재료의 표참조) 50-75% 합류 6 잘 플레이트에서 Sf9 셀 문화.
2. 곤충 세포 transfection 시 약 제조업체의 프로토콜에 따라 사용 하 여, transfect 재조합 잠재 생산 HEVNP-573 C ORF2 Sf99 셀에 포함 된 Bacmids. 세포의 생존 능력에 따라 3-6 일 동안 27 ° C에서 transfected 세포를 품 어.
3. P0 잠재 주식으로 감염 된 후 3-6 일에 상쾌한 (후 transfected 세포는 잠재 감염 lysed)를 수집 합니다.
4. 50-75% confluent Sf9 셀 25 cm² 단층 플라스 크에 P0 재고의 200 µ L를 적용 하기 전에 문화 매체를 제거 합니다. inoculum의 전체 범위를 보장 하기 위해 플라스 크 매 15 분을 바위. 60 분 총 4 회를 반복 한다.
5. 플라스 크에 곤충 세포 배양 매체의 2 ....

Results

HEV-VLPs, 유사 모든 Cys HEVNPs 형성 성 icosahedral capsids 수정 하 고 생산 또는 정화 하는 동안 솔루션에 집계 되지 않았다. 전과 Cys의 각 단일 단계 maleimide-biotin 활용 수정 후 HEVNPs 부정적인 얼룩 EM (그림 2)에서 HEV-VLPs에서 구별할 수 없었다. Cys 수정된 HEVNPs chemiluminescent streptavidin 바인딩을 통해 서 부 럽으로 처음 테스트에 Maleimide biotin 활용 효율성. Maleimide-비타민 b 복합체 활용, 다음 Cys 수정 표시 HEVNPs streptavidin 바인딩 신호 (그림 2).

효과적인 2 단계 시스테인 활용 활용 밖으로 실.......

Discussion

시간이 걸리는 유전 공학 절차는 일반적으로 주, 달리 여기 설명 간단한 2 단계 및 암 ligand를 대상으로 추가의 3 일 안에 완료 될 수 있는 한 단계 화학 활용 절차 및 HEVNPs의 Cys/리스 사이트의 형광 탐지 염료 기술을 사용할 수 있습니다 후보자, 수영장 그리고 따라서 합리적인 비용 및 배달 시 사용할 수 있는 펩 티 드/작은 분자 합성 서비스의 활용에서 최고의 ligand 대상에 대 한 화면으로.

관심사의 단백질에는 polypeptides를 삽입할 수 있습니다만, 전통적인 유전자 공학, 달리 화학 활용 polypeptides, 작은 화학 분자의 표면에 나노 입자 등 다양 한 자료를 연결할 수 있는 관심, Cys 또는 리스 잔류물 반응 사이트로 사용 하는 만큼의 단백질. 화학 활용 사이트에서 같은 잔류물 경우 간단한 Cys/리스 교체 이전 연구⁴에서 같이 화학적으로 활성화 있도록 관심사의 단백질에 유전으로 수정할 수 있습.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
미니 투석 유닛, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	미니 투석 유닛
High Five Cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	Tn5 셀
SF9 셀	Thermo Fisher Scientific		11496015 Sf9 세포
Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	바큘로바이러스 발현 시스템
Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템	Life Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 곤충 세포 배지	발현 시스템 LLC	96-001-01	곤충 세포 매체
Cy5.5 NHS 에스테르, 5mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS 에스테르
Zeba 스핀 탈염 컬럼, 40K MWCO, 0.5mL	Thermo Scientific	87766	스핀 탈염 컬럼
MES 수화물	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
울트라 클리어 원심분리기 Thinwall 초원심분리기 튜브	Beckman Coulter, Inc	는 로터	에 따라 다릅니다.초원심분리기 튜브
NuPage 4-12% Bis-Tris 단백질 겔	Thermo Fisher Scientific		NPO321BOX SDS 단백질 겔
Cellfectin II 시약	Thermo Fisher Scientific		10362100 트랜스펙션 시약
EMS 글로우 방전기	전자 현미경 과학		글로우 디스방전기