Coverslips B 세포 수용 체에 항 체, 초기 단계에 대 한 모델 코팅에 확산 하는 B 세포에서 동시에 이미지 걸 구조, microtubules, 및 microtubule 플러스-엔드 바인딩 단백질에 호텔 위치 현미경 검사 법을 사용 하기 위한 프로토콜 소개 면역 시 냅 스 형성.
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방법 논문
말라와 자극된 방출 소모 (호텔 위치) 현미경을 사용 하 여 B 세포 면역 냅에 Microtubule Cytoskeletons 시각화
이 논문에서
요약
초록
막 도약 항 원 (예, 항 원 제시 세포의 표면에)에 바인딩되는 B 세포 면역 시 냅 스, B 세포 수용 체 (BCR) 신호 최적화 전문된 세포 구조 및 BCR 중재 항 원 수집을 형성 한다. 모두 말라 골격 및 항 원 연락처 사이트 향해 microtubule 네트워크의 재교육의 개장 면역 시 냅 스 형성에 필수적입니다. F-말라의 조밀한 주변 반지로 걸 골격의 개장 면역 시 냅 스는 microtubule 조직 센터의 양극 화 현상이 동반 된다. 대뇌 피 질의 플러스-엔드 캡처 단백질 뿐만 아니라 microtubule 플러스-엔드 바인딩 단백질, 조정 방식으로 재구성 하는 말라와 microtubule cytoskeletons 간의 실제 상호 작용을 중재. 이러한 cytoskeletal 구조 이해 뿐만 아니라이 cytoskeletal 개편 모양 면역 시 냅 스 대형과 BCR 신호, 제어 B 세포 활성화에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다 메커니즘 elucidating 이것은 cytoskeletal 네트워크의 새로운 세부 공개 슈퍼 해상도 현미경 방식의 개발에 의해 주 었 되었습니다. 여기 B 셀에 동시에 이미지 걸 구조, microtubules, transfected GFP 태그 microtubule 플러스-엔드 바인딩 단백질을 자극된 방출 소모 (호텔 위치) 현미경을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 면역 시 냅 스 형성에서 초기 이벤트를, 우리는 반대로 면역 글로불린 (안티-Ig) 항 체, BCR 신호 및 골격 개장을 시작으로 coverslips에 B 세포 허용. 우리 A20 B-림프 종 세포에서 GFP 융해 단백질을 표현 하기 위한, 안티 Ig 유도 세포 확산 및 후속 셀 고정, Immunostaining, 이미지 수집 및 이미지 deconvolution 단계 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 이 절차를 사용 하 여 얻은 고해상도 이미지 하나 동시에 말라 구조, microtubules, 및 이러한 두 개의 cytoskeletal 네트워크를 연결할 수 있습니다 microtubule 플러스-엔드 바인딩 단백질을 시각화 수 있습니다.
서론
B 세포 바인딩할 때 편광 항의 배열 (예, 항 원 제시의 표면에 표시 세포 (Apc)), 결과 B 세포 수용 체 (BCR) 신호 드라이브에 설명 된 처음 고전 면역 시 냅 스 구조 형성 T 세포1,2,3,,45,6,7,8,9,10, 11,,1213. 처음에, B 세포: APC의 주변에서 항 원 바인딩 BCRs 폼의 microclusters 사이트 문의. 이 microclusters는 다음 항 ....
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프로토콜
모든 동물 절차는 브리티시 컬럼비아 동물 관리 위원회의 대학에 의해 승인 되었다.
1. A20 B-림프 종 세포에서 GFP 융해 단백질을 표현
- 문화 A20 셀 5 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 RPMI 매체 (RPMI-1640와 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 50 µ M 2-mercaptoethanol, 글루타민 2 mM, 1 mM pyruvate, 50 U/mL 페니실린, 50 µ g/mL 스 보충) 완료 % CO2.
- Transfection 시 약 준비 ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라.
참고:이 프로토콜 특정 시 약에 대 한 최적화 된 및 transfection 프로토콜에서 설명 자료 테이블. 우리는 시도 하는 다른 transfection 시 약 충분 한 transfection 효율 굴복 하지는. - hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 분리기 2.5 x 106 A20 셀 (각 transfection) 525 x g.에서 5 분 동안 Resuspend transfection 시 약 포함 하는 플라스 미드 DNA의 1-2.5....
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결과
B 셀 고정된 안티-Ig에 확산, deconvolution 소프트웨어와 함께 사용 하는 호텔 위치 현미경 confocal 현미경 검사 법 보다 cytoskeletal 구조의 높은 해상도 이미지를 제공 합니다. 이것은 그림 1에서 분명 하다 어디 F 말라 네트워크 위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 여 가시화 했다. 공초점 레이저의 비교 및 호텔 위치 슈퍼 해상도 같은 호텔 위치 이미지의 높은 해상도 보여주는 샘플 영상과 자세한 걸 골격 (그림 1)의 구조를 공개. 이 그림은 또한 그 deconvolution 고품질 호텔 위치 이미지는 걸 필 라 멘 트 더 명확 하 게 정의 얻기 위해 필수적입니다 보여줍니다. Deconvolution 공초점 이미지의 이미지의 해상도에 상당한 뛰어납니다, deconvolved 호텔 위치 이미지 deconvolved confocal 이미지.......
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토론
이론적으로 50의 해상도 달성할 수 있는 호텔 위치 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하 여 cytoskeletal 구조의 상세한 이미지를 얻을 수 있는 회절 제한 된 해상도 200 ~ 기존의 confocal 현미경 검사 법에 비해 nm nm 24. 미세한 구조를 해결 하는 능력 관찰된 "흐리게" 형광 신호에서 원래 광원의 가능성이 가장 높은 위치를 계산할 deconvolution 소프트웨어를 사용 하 여 더 강화 된다. 이 프로토콜에는 호텔 위치는 말라와 microtubule cytoskeletons로 골격 관련 단백질의 이미지를 사용 하 여 방법을 설명 합니다.
B 세포 활성화 면역 시 냅 스 형성17,42에 대 한 중요 한 두 개의 cytoskeletons의 조정 레 걸 골격 및 microtubule 네트워크의 리 모델링을 유도 합니다.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 UBC 생명과학 연구소 (LSI) 이미징 시설 지원 및 호텔 위치 현미경을 유지에 대 한 감사 합니다. 이 작품에서에서 권한을 부여 #68865 건강 연구의 캐나다 학회 (M.R.G.)에 의해 투자 되었다. 클립-170-GFP 플라스 미드에 감사 박사 고조 Kaibuchi (나고야 대학, 나고야, 일본) 하 고.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Cell culture | |||
| A20 마우스 B-림프종 세포 | ATCC | TIB-208 | 표면에 IgG-함유 BCR을 발현하는 Balb/c 기원의 쥐 B-세포 림프종 |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| 소 태아 혈청 | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | 56 oC에서 30분 동안 열 비활성화 |
| 2-메르캅토에탄올 | 밀리포어 시그마 | M3148 | |
| 글루타민 | 밀리포어 시그마 | G5763 | |
| 피루브산 나트륨 | 밀리포어 시그마 | P5280 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 써모 피셔 Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 단위 |
| primary B cells를 위한 추가 재료 | |||
| 70-µ m cell strainer | Corning | 352350 | |
| 마그네틱 비드 기반 B 세포 분리 키트 | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep 마우스 B 세포 분리 키트 |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R& D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid 인코딩 CLIP-170-GFP | Kozo Kaibuchi 박사의 선물(일본 나고야 대학, 나고야 대학); Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
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| Falcon 6웰 플레이트, TC 처리, 멸균 | Corning | 353046 | |
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| Goat-anti-mouse IgG 항체 | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | A20 세포용 |
| Goat-anti-mouse IgM 항체 | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | primary mouse B cells |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PBS로 작업 농도로 희석 |
| 글루타르알데히드(50% 원액) | Millipore Sigma | 340855 | PBS로 작업 농도로 희석 |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| 사포닌 | 밀리포어 시그마 | S2149 | |
| 소 혈청 알부민(BSA), 분획 V | 밀리포어 시그마 | 10735094001 | |
| 토끼 항튜불린 항체 | Abcam | ab52866 | 1:250 희석을 권장하지만 최적화해야 함 |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 희석이 권장되지만 최적화해야 함 |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 희석이 권장되지만 최적화해야 함 |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | DAPI 없음 |
| Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 이름 | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | 밀리포어 시그마 | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore 시그마 | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| 포도당 | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Microcopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
참고문헌
- Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360(2011).
- Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the ....
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