두 가지 방법은 여기 장 장벽 기능을 결정 하 되 게 됩니다. 상피 미터 (볼트/옴)의 조직 문화 우물에서 직접 경작된 epithelia의 transepithelial 전기 저항 측정에 사용 됩니다. 쥐, FITC dextran gavage 메서드는 vivo에서창 자 침투성 결정 하 사용 됩니다.
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방법 논문
생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
장 방 벽은 병원 성 미생물 및 미생물 독 소에 대 한 방어. 그것의 기능은 꽉 접합 침투성 및 상피 세포 무결성에 의해 규제 됩니다 그리고 위장과 전신 질환의 진행에 기여 하는 장의 장벽 기능 장애. 두 가지 간단한 방법 장 상피의 투과율을 측정 하 여기 설명 되어 있습니다. 생체 외에서Caco 2BBe 세포는 조직 문화 우물에는 단층으로 도금 및 transepithelial 전기 저항 (TER)는 상피 (볼트/옴) 미터에 의해 측정 될 수 있다. 이 메서드는 사용자 친화적인 작동과 반복성 때문에 설득력이 있다. Vivo에서, 마우스는 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)와 gavaged-dextran, 그리고 FITC dextran 농도 상피 침투성을 결정 하는 마우스에서 수집 된 혈 청 샘플으로 측정 된다. 구강 정확한 복용량을 제공 하 고 따라서 vivo에서창 자 침투성 측정을 선호 하는 방법 이다. 함께 찍은, 이러한 두 가지 방법을 장 상피 체 외 그리고 vivo에서의 침투성을 측정할 수 있다 하 고 따라서 질병 및 장벽 기능 사이의 연결을 공부 하는 데 사용 될.
서론
장 상피 세포는 영양분의 흡수에 대 한 책임 뿐만 아니라 그러나 또한 병원 성 미생물 및 미생물 독 소에 대 한 중요 한 방 벽을 형성. 이 장의 장벽 기능은 꽉 접합 침투성 및 상피 세포 무결성1,2,3, 통제 되 고 상피 장벽 기능 부전은 염증 성 창 자 연관 질병 (IBD)입니다. Perijunctional actomyosin 반지 (PAMR)는 단단한 접속점에 밀접 하 게 인접 셀 이내에 거짓말. Myosin 빛 사슬 (MLC)에 의해 규제 됩니다, PAMR의 수축은 꽉 접합 침투성4,5,6,7,8, 규제에 대 한 중요 한 9,10. 종양 괴 사 인자 (TNF) upregulating 장 상피 MLC 니 (....
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프로토콜
이 연구는 동물 관리 및 사용 프로토콜의 캠브리지 스 게놈 자원 센터 (캠-수), Soochow 대학에 의해 승인 되었다.
1. 도금 및 Caco-2bbe에 다공성 폴 리 카보 네이트 막의 유지 보수
- 미디어 T75 플라스 크에 세포를 성장 (10% 포함 된 DMEM FBS). 플라스 크는 셀 밀도 따라 정기적으로 먹여야 한다.
참고: 최적의 도금, 셀 해야 빠르게 분할 및 세포 성장 단계에가 평면 "튀김-계란" 모양. - 일단 세포가 80% 합칠, 인큐베이터에서 플라스 크를 걸릴 하 고 미디어를 제거 합니다. 1-2 mL (없이 캘리포니아2 +) 살 균 PBS의 모든 잔여 미디어 린스. 피펫으로 1.5 mL 트립 신-EDTA 플라스 크와 부드럽게 바위 플라스 크; 그런 다음, 락 없이 20 분 동안 37 ° C 배양 기에서 플라스 크를 놓습니다.
- 셀 trypsinizing는 하는 동안 장소 다공성 폴 리 카보 네이트 막 (0.4 µ m 기 공 크기, 표면적, 0.33 c m2; 재료의 표참조)를 포함 하는 24-잘 접시에 삽입 합니다. 기저 챔버 (막의 낮은 공간)에서 문화 미디어 1.0 mL를 추가 합니다. ....
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결과
문화, Caco 2BBe 세포를 단층으로 성장 하 고 천천히 테두리 브러시를가지고 성숙한 흡수 성 enterocytes로 분화. 이 프로토콜에서 Caco 2BBe 셀 폴 리 카보 네이트 막에 높은 밀도와 도금 했다 하 고 셀에 도달 100 %confluency 시드 후에 1 일. 그러나 세포는 차별화 된이 단계에서: 완전히 셀 구분, 미디어 3 주 동안 2-3 일 마다 변경 됩니다. 세포 핵으로 물 했다 고 F 걸 미 분화 및 분화 세포의 차이점을 보여 얼룩. 스트레스 섬유 undifferentiated 셀에 명확 하 게 볼 수 있습니다. 미 분화 세포와 비교, 차별화 된 셀 있고 작은 볼륨, 더 큰 핵, 적은 스트레스 섬유 (그림 1).
TNF는 MLCK 종속 단단한 접속점 규칙을 통해 장 배리어 손실에 중앙.......
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토론
프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. Caco-2BBe (브러쉬 국경-표현) 셀 테 측정, 브러쉬-테두리 단백질의 표현 위한 Caco-2 셀 라인에서 선택한 항상 사용 됩니다. Caco-2BBe 세포는 모 흡수 형 때 (문화 후 합류의 약 3 주) 후 완전히 분화17. 측정, 동안 오염 방지 하 고 전극 소독이 필요 하다. 절차는 비 살 균, 측정은 최대 8 h 대부분의 경우에만 수행할 수 있습니다. 측정, 동안 우리 두 포인트 삽입 내외의 저항 값을 결정합니다. 다양 한 사이트에서 저항 측정 셀 상태; 차이 때문에 때로는 크게 다를 수 있습니다. 이 방법의 주요 제한 사항입니다. 그러나,이 변화는 통계적 방법 및 다른 방법에 의해 크게 줄일 수 있습니다. TER 메서드는 폐 상피 세포와 혈관 내 피 세포의 장벽 무결성을 확인 하는 등, 다른 셀에 적용할 수 있습니다. 또한, 테 측정 약물 독성 연구에 사용할 수 있습니다.
확산을 .......
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공개 사항
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
감사의 글
이 연구를 완료에 그의 관대 한 도움에 감사 박사 제럴드 R. 터너, Brigham와 여자의 병원, 하버드의과 대학에서에서 하 고. 이 작품은 중국 (보조금 번호 81470804, 31401229, 및 81200620)의 국가 자연과학 기초는 자연 과학 재단의 장쑤 성 (보조금 번호 BK20180838, 및 BK20140319)에 의해 지원의 연구 혁신 프로그램 대학 졸업생의 장쑤 성 (보조금 번호 KYLX16-0116), 고급 연구 프로젝트의 Soochow 대학 (보조금 번호 SDY2015_06), 그리고 크 론 및 Colitis 재단 연구 펠로 십 수상 (310801 번호 부여).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 22G 개비지 바늘 | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| 형광용 블랙 96웰 플레이트 | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 마우스 | 난징 대학교 | ||
| ATCC | CRL-2102 | ||
| 덱스트란 황산염 나트륨 | MP Biomedicals | 2160110 | |
| 고포도당 및 피루브산 나트륨이 함유된 DMED | Hyclone | SH30243.01B | |
| 상피(볼트/옴) 측정기 | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| 에탄올 | Sinopharm Chemical시약 | 10009218 | |
| Falcon tube (15mL) | 코닝 | ||
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| 형광 현미경 | Olympus | FV1000 | |
| 형광계 | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM Hepes, 1.3 mM CaCl2, 25 mM 포도당 | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| 모듈식 조직 임베딩 센터 | 라이카 | EG1150H | |
| 혈청 수집 튜브 | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 플라스크 | 코닝 | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| 파라핀 | 시그마 | A6330-1CS | |
| 폴리카보네이트 멤브레인 (Transwell) | Costar | 3413 | |
| 압력 펌프 | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| 로터리 마이크로토미 | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
참고문헌
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target? Nature reviews. Gastroenterology & ....
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재인쇄 및 허가
