여기 자세한 위한 프로토콜 murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R 셀 라인 경작, 수행 하는 바이러스 성 감염, 확산 및 감 별 법 분석 실험 수행 되 게 됩니다. 이 셀 줄은 골수성 세포 개발, 골수성 세포 성장 및 neutrophilic 분화의 유전자의 역할을 공부 하 고 적합 합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
확산 및 Murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R의 셀
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
조 혈 줄기와 조상 세포 생물학의 이해 재생 의학 및 혈액 병 리 치료에 대 한 중요 한 의미를 갖는다. 가장 관련성이 높은 데이터를 취득 될 수 있다 vivo에서 모델 또는 기본 문화권을 사용 하 여에 불구 하 고 조 혈 줄기와 조상 세포의 낮은 풍부 상당히 그들의 조사에 대 한 적합 한 기술을 풀을 제한 합니다. 따라서, 세포의 사용 검사 또는 큰 휴대 번호를 필요로 하는 분석의 성능에 대 한 생물학 자료의 충분 한 생산을 수 있습니다. 여기 자세한 설명, 판독, 및 myelopoiesis 및 neutrophilic 분화에 관련 된 프로세스의 조사를 위해 사용 되는 확산 및 감 별 법 분석 실험의 해석 하는 것이 선물이. 이러한 실험 32D/G-CSF-R cytokine 종속 murine 골수성 세포 선, IL-3의 확산 및 G-CSF 차별화 능력을 보유 하 고 사용 합니다. 32D/G-CSF-R 셀을 처리 하기 위한 프로토콜 최적화 제공 하며 주요 함정 및 기술된 분석 및 예상된 결과 손상 시킬 수 있는 단점에 대해. 또한,이 문서 lentiviral retroviral 생산, 적정, 및 32D/G-CSF-R 셀의 변환에 대 한 프로토콜을 포함합니다. 이 세포의 유전자 조작 기본 조 혈 줄기와 조상 세포 또는 vivo에서 모델 결과 보완할 수 있는 기능과 분자 연구를 성공적으로 수행을 채택 될 수 있다 설명 합니다.
서론
조 혈 줄기 및 조상 인구 유기 체 세포 (호 중구, 호 산 구는, basophils, 및 monocytes) 골수성 계보에서를 포함 하 여 성숙한 셀의 큰 범위를 제공 합니다. Myelopoiesis, 조 혈 줄기 세포에서 골수성 세포의 생산을 구동 하는 과정 이라고 변화 하는 요구에 대 한 응답에서 골수성 세포로 성숙의 적절 한 생산 이며 스트레스와 유기 체의 적절 한 대처에 대 한 전제 조건 조건, 감염 등 혈액 손실입니다. 성숙한 골수성 세포의 부족 한 생산 병원 체, 감소 된 혈액 응고, 및 다른 생명을 위협 조건1,2를 발생할 수 있습니다. 또한, 골수성 혈통 개발에서 변경 관련 혈액 악성 종양, 급성 골수성 백혈병 (AML)3등 된 수도 있습니다. Myelopoiesis 변경 결함 세포 표면 수용 체4, 녹음 방송 요인5, 변경된 식에에서 장애 신호 경로6, 변이 형성의 결과로 같은 다양 한 이유로 인해 발생할 수 있습니다 / 7oncogenes 또는 종양 억제기 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
참고: 확장을 설명 하는 단계, 차별화, 및 32D/G-CSF-R 셀의 변환 되 게 됩니다 아래.
1입니다. 준비
- 미디어 준비
- 문화 매체의 250 mL 준비: 10% 열 보충 (로스웰 파크 기념 연구소) RPMI 1640 매체 비활성화 FBS (태아 둔감 한 혈 청) 및 murine IL-3 (10 ng/mL).
- 또는 집에서 만든 IL-3를 사용 하 여. 집에서 만든 IL 3 생산, IL-3 표현 벡터와 HEK293 세포 transduce 하 고 IL-3 표면에 뜨는22를 포함 하를 수집 합니다.
참고: 항생제, 페니실린 G 등 (100 IU/mL), 스 (100 µ g/mL), 및 gentamicin (40 µ g/mL), 달리 명시 하지 않는 한 프로토콜의 어떤 단계에서 세포 배양에 사용할 수 있습니다.
- 또는 집에서 만든 IL-3를 사용 하 여. 집에서 만든 IL 3 생산, IL-3 표현 벡터와 HEK293 세포 transduce 하 고 IL-3 표면에 뜨는22를 포함 하를 수집 합니다.
- 차별 매체의 50 mL를 준비: RPMI 1640 매체 보충 10 %FBS, 그리고 인간의 G-CSF (100 ng/mL).
참고: 모든 혈 청 일괄 지원 32D/G-CSF-R 세포의 분화 (중요). 실험 시작 전에 혈 청의 다른 배치를 테스트 합니다. 4 다른 ....
- 문화 매체의 250 mL 준비: 10% 열 보충 (로스웰 파크 기념 연구소) RPMI 1640 매체 비활성화 FBS (태아 둔감 한 혈 청) 및 murine IL-3 (10 ng/mL).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
확산 및 32D/G-CSF-R 세포의 분화
32D/G-CSF-R 프로 증식 및 프로 차별화 조건 하에서 세포의 확산을 평가, 32D/G-CSF-R 셀 IL 3, G-CSF, 각각 포함 된 미디어에서 경작 했다. IL-3 포함 매체 (10 ng/mL)에 경작 하는 세포 (그림 2A) 약 24 시간 모든 분할 관찰 되었다. G-CSF (100 ng/mL) 확산 점차적으로 감속 하 고 4 일 (그림 2A) 후 중지와 IL-3의 교체 시. 또한, G-CSF cytospun 5 월-그 룬 발트 Giemsa 얼룩 세포를 사용 하 여 존재 배양 세포의 분화 상태 평가 했다. 그것은 하루 0 (G-CSF 치료의 시작) 전에,에 셀 미 숙 myeloblast 같은 형태학, 큰 핵.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
실험적인 모델의 연구의 주요 문제 중 하나입니다. 기본 인간과 동물 세포 가장 생물학적으로 관련 데이터를 생산으로, 이러한 모델 윤리적 우려를 포함할 수 있습니다 고은 종종 비싼 및 정교한 분리/배양 절차와 관련 된. 1 차 셀 숫자에 제한 됩니다 그리고 유전자 조작 하기 어렵다. 또한, 1 차 셀 데이터 해석29을 복잡 하 게 수 있습니다 다양 한 세포 유형의 구성 유형이 다른 인구를 대표 한다. 대조적으로, 셀 라인 생물학 물자의 거의 무제한 소스 제공, 비용 효과, 고을 윤리적인 문제를 무시할. 그러나, 그것은 라인 유전자 수는 근원의 그들의 조직에서 다 phenotypically 인공 실험 시스템 간주 됩니다 해당 셀을 고려 하는 것이 중요. 그럼에도 불구 하 고, 셀 라인 다른 실험적인 접근법과 결합 될 때, 재현할 수 및 생물학 관련 데이터의 생성에 대 한 유용한 모델을 제공 합니다.
32D cl-3 셀 뿐 아니라 32D/G-.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자는 교수 뤼트 Delwel 및 32D/G-CSF-R 셀 라인, 우리를 제공 하기 위한 교수가 보 Touw 및 Bosc23 셀 선 제공에 대 한 교수 다니엘 G. 되어 감사 합니다. 이 작품 MA j 체코 공화국 (GACR 15-03796S 및 GACR 17-02177S)의 그랜트의 교부 금에 의해 지원 되었다, MA-j, GA 영국 원정대 (프로젝트 번호 341015) 체코 과학 아카데미 (RVO 68378050)의 분자 유전학 연구소에서 지원 PD 프라하 찰스 대학교에서 MK, 하가 영국 원정대 (프로젝트 번호 1278217) 프라하에 있는 찰리 대학.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 분말 배지 | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | , NaHCO3 없음, L-글루타민 |
| DMEM | 포함 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I 환원 혈청 배지 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-글루타민, 페놀 레드 |
| 태아 소 혈청(FBS) | PAA Laboratories(GE Healthcare, Chicago, IL, USA) | MT35011CV | 32D/G-CSF-R 세포 |
| 태아 혈청(FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | HEK293T, NIH3T3, BOSC23 세포 배양에 사용 |
| 페니실린 | 시그마-알드리치(미국 뉴저지주 케닐워스 머크) | P3032 | |
| 스트렙토마이신 | 시그마-알드리치(미국 뉴저지주 케닐워스 머크) | S9137 | 스트렙토마이신 황산염 분말 |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, 미국 뉴저지) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grü nwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, 이탈리아 | 10802 |
참고문헌
- Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
- Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
