Trichostatin A와 비타민 C의 조합 치료 체세포 핵 이식에 의해 생쥐 복제의 효율성 향상

요약

마우스 trichostatin A, 비타민 C, 그리고 이온된 소 혈 청 알 부 민을 사용 하 여 복제 하는 극적으로 향상 된 방법을 설명 합니다. 우리는 복제 된 배아의 효율적인 개발을 지 원하는 단순화, 재현 가능한 프로토콜을 보여줍니다. 따라서,이 메서드는 마우스 복제에 대 한 표준화 된 절차 될 수 있다.

초록

체세포 핵 이식 (SCNT) 직접 기증자 세포에서 복제 동물을 생산 하는 독특한 기회를 제공 하 고 숙련 기술의 사용을 요구 한다. 또한, 복제의 효율성 복제 동물, 특히 쥐의 성공적인 생산 이후 낮은 남아 있다. 복제 효율성을 개선 하기 위해 많은 시도 되었습니다 그리고 trichostatin A (TSA), 히스톤 deacetylase 억제 물 복제의 효율성을 향상 시키기 위해 널리 사용 되었습니다. 여기, 우리는 생쥐에서 극적으로 향상 된 복제 방법 보고. 이 체세포 핵 이식 방법은 일본 봉투 (HVJ-E), 쉽게 조작 가능 하 게의 Hemagglutinating 바이러스의 사용 포함. 또한, 두 개의 작은 분자, TSA와 이온된 소 혈 청 알 부 민 (dBSA), 비타민 C (VC)를 사용 하 여 치료 배아 발달에 대 한 매우 효과적입니다. 이 방법은 추가 주입도 유전자 조작, 요구 하 고 따라서 실제 사용에 대 한 간단 하 고, 적합 한 메서드를 제공. 이 메서드는 연구자 배양된 세포에서 유전자 변형된 동물 생산에 대 한 기술적으로 가능한 접근 될 수 있다. 또한, 복제를 통해 멸종 위기 동물의 구조에 대 한 유용한 방법을 수 있습니다.

서론

SCNT 기술 enucleated oocyte 전송에 하나의 체세포 또는 핵을 사용 하 여 복제 동물의 생산을 수 있습니다. SCNT 기술의 목적 중 하나는 복제 된 배아에서 핵 이식 배아 줄기 세포 (NT-ESCs) 라인의 유래입니다. 1998 년에 와카야마 외 알., 보고 된 첫 번째 시간¹Cumulina 라는 성공적으로 복제 된 마우스를 생산. 그 이후, 쥐의 복제 널리 연구 되었습니다, 그리고 체세포 핵의 핵 프로그래밍에 많은 중요 한 통찰력을 얻은. 다른 한편으로,이 기술은 꽤 어려운 수많은 micromanipulation 단계를 동반 된다 마스터, 3 개월²이상의 집중적인 훈련을 필요로.

SCNT를 사용 하 여 복제 된 쥐의 생산 일본 (HVJ)⁴의 Hemagglutinating 바이러스에 의해 셀 퓨전 메서드는 원래 호놀룰루 방법¹, electrofusion 방법³에서 진화 했다. 그러나,는 있던 통해 세포 핵의 직접 분사는 해롭게 oocyte 생존에 영향을 미칠 경향이 있다. electrofusion은 각 세포 막에는 다른 경도, 최적의 상태를 결정 하 고 어려운 있기 때문에 효율성, 낮은. HVJ 처리 연구자 및 실험 동물의 안전에 대 한 특정 장비를 필요로 하기 때문에 힘 드는입니다. 최근, 기증자 세포와 oocyte 세포질 융합 HVJ-E 사용된⁵되었습니다. 만 HVJ-E는 바이러스의 증식 또는 감염 능력 없이 세포 막 융합 기능이 있다. Genomic RNAs HVJ HVJ e에서 완전히 활성화 되지 않습니다. HVJ-E의 사용은 따라서 SCNT 동안 세포 융합의 쉬운 취급을 지원합니다.

여러 보고서 TSA, 히스톤 deacetylase 억제 물와 SCNT 배아의 치료 1% ~ 6.5^6,7미만에서 라이브 새끼의 생산 효율을 크게 향상 됩니다 나타났습니다. TSA 치료 SCNT 배아⁸에서 히스톤 부호 수정 통해 프로그래밍을 가속 한다. 최근, 특정 mRNAs, 히스톤 lysine demethylase 인도의 히스톤 H3 lysin 9 (H3K9)을 제거 하는 (KDM4), 4의 주입 SCNT 배아, reprograming-내성 지역에서 특히에 trimethylation의 개발을 증가 표시 되었습니다 복제 마우스 배아⁹. 한편, 히스톤 한정자 역할도, VC H3K9¹⁰trimethylation를 감소 했다. 또한, VC 돼지 SCNT¹⁰배아 발달을 향상 시킵니다. 그것은 SCNT 배아 dBSA 주입 배아 개발¹¹의 개선에 지도 보고 되었습니다.

우리는 이전 작은 분자의, 즉 TSA 및 VC, dBSA, 함께 조합 SCNT 배아¹²의 개발을 극적으로 향상 된 것을 발견. 여기, 우리는 매우 효율적이 고 간단한 복제 절차¹²를 나타내는 마우스, 이전에 보고 된 SCNT 방법 선발. 우리는 또한 HVJ. 처리 설명 이들은이 SCNT 방법을 통해 유전자 변형된 동물 유전 자원 보존 하거나 발달 및 생식 생물학의 분야에서 많은 연구를 도울 수 있었다.

프로토콜

모든 동물 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 긴 대학교의 지침을 준수.

1입니다. 배양 기의 준비

1. 95 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 0.35 m m KH₂포₄, 0.2 m m MgSO₄ · 구성 된 배아 문화에 대 한 수정된 KSOM (mKSOM) 매체 준비 7 H₂O, 1.71 m m CaCl₂ · 2 H₂O, 0.2 m m D (+)-포도 당, 0.2 m m 나트륨 Pyruvate, 1.0 m L-글루타민, 1.0 g/L Polyvinylpyrrolidone (PVP), 25.07 m m NaHCO₃, 10 mM 나트륨 DL-젖 산, 페니실린, 0.05 g/L 및 0.05 g/L 살 균 물에 스.
2. Hepes 버퍼 CZB (HCZB) 매체 81.5 m m NaCl, 4.8 m m KCl, 1.7 mM CaCl₂ · 구성 된 배아 조작에 대 한 준비 2 H₂O, 1.18 m m MgSO₄ · 7 H₂O, 1.18 m m KH₂포₄, 0.11 m m EDTA · 2Na, 36.1 m m 나트륨 DL-젖 산, 5.55 m D m (+)-포도 당, 0.025 g/mL 페니실린, 0.035 g/L 스, 0.014 m m 페 놀 레드, 1.0 g/L 폴 리 비닐 알코올, 5.0 m m NaHCO₃및 20.0 mM Hepes 나트륨 소금 살 균 물에.
3. Oocyte 활성화에 대 한 정품 인증 매체를 준비: mKSOM 매체와 50 nM TSA, 2mm EGTA, 5 µ g/mL cytochalasin B (CB), 5 mM SrCl₂보충.

2. 준비의 이온 소 혈 청 알 부 민 (dBSA)

1. 상 온 (12%의 최종 농도)에서 살 균 물 10 mL에 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 1.2 g을 용 해.
2. 부드러운 교 반으로 실내 온도에서 살 균 물에 BSA의 12%를 준비 위의 혼합된 이온 교환 수 지 구슬의 약 0.12 g을 추가 합니다.
3. 구슬 파란색-녹색에서 색을 변경 하는 때 금, 복구는 피 펫을 사용 하 여 표면에 뜨는 솔루션. 다음 대체 구슬 신선한 것 들 (그림 1).
   참고: 구슬의 교체 일반적으로 한 번만 수행 됩니다. 아마도 완전 이온화를 몇 가지 교체를 필요합니다. 가이드, 구슬의 색상에서 그대로 하는 경우로 골드에 파란 녹색, 그것은 이온 교환이 완료 되 나타냅니다.
4. 구슬 색상 변경 확인 솔루션을 복구 합니다.
   참고: 복구 솔루션 흐린 경우, 원심 (175 x g, 5 분) 필터 막힘을 방지 하기 위해.
5. 복구 된 보충 10.5% NaHCO₃의 250 µ L로 솔루션.
   참고:이 프로세스 dBSA 솔루션 중화 pH 조건에 대 한 것입니다. 그러나, NaHCO₃ 피할 수 있습니다.
6. 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 상쾌한 소독 고 dBSA 재고 솔루션으로-20 ° C에서 저장 합니다.

3. oocyte 컬렉션

참고: 모든 마우스 빛 제어 및 에어컨을 갖춘 객실에서 유지 되었다.

1. 슈퍼-배 란 각 여성 B6D2F1 마우스 (세 8-10 주) 임신 암 말 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG)의 7.5 IU의 복 주입 및 인간 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG) 48 h PMSG 주사 후의 7.5 IU.
2. 자 궁 경부 전위 14-16 h 여 안락사를 수행 hCG 주사 후. 복 부 생식로 표준 해 부 기법¹³를 사용 하 여 액세스를 incise합니다 간단히, 피부를 꼬 집 고 작은 측면 절 개는 중간에가 위. 단단히 위에 피부 절 개 아래 고 머리와 꼬리 쪽으로 피부를 당겨. 잘라가 위를 사용 하 여 복 막 하 고 밀어 용기의 코일 방식의 oviducts, 자 궁, 난소의 두 뿔의 존재를 확인 합니다.
3. 작은 똑 바른가 위와 핀셋 oviducts extirpate, 표면 떨어져 피를 닦아 필터 종이. 미네랄 오일에는 oviducts를 설정 합니다. 그런 다음 절 개 바늘을 사용 하 여 수 란 관의 ampulla 잘라 고 적 운 oocyte 단지 0.1 %hyaluronidase HCZB 매체의 200 µ L 상품에는 수 란 관의 ampulla에서 오는 이동 합니다. 지구 온난화 접시에 5 분 동안 품 어.
   주의: 0.1 %hyaluronidase HCZB 매체에 10 분 이상 노출 된 oocytes에 대 한 해로운 것입니다.
4. 적 운 세포 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA 일부 남은 적 운 세포 전송 두 번째 meiotic 분열 (MII) 무대 oocytes에는 stereomicroscope에서 적 운 oocyte의 단지에서 해제 됩니다 확인 하십시오. 그런 다음, 아래로 pipetting으로 MII 무대 oocytes 4 번 세척 (의 피 펫을 사용 하 여 < 100 µ m 내부 직경) mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA 나머지 적 운 세포 분리에.
   참고: 작은 피 펫의 사용 적 운 세포의 분리를 촉진 한다.
5. 37 ° C에서 5%에서 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA Mll 무대 oocytes를 품 어 enucleation까지 CO₂ 배양 기.
   참고:는 oocyte의 그것 보다 약간 큰 직경을 가진 작은 피 펫 것이 좋습니다.

4. 핵 이식 기증자 세포의 준비

1. 단계 3.3-3.5, 후 denuded oocytes 적 운 oocyte 단지에서 격리 됩니다. 나머지 적 운 세포는 stereomicroscope 아래 피 펫을 사용 하 여 HCZB 보통 6 %dBSA 0.1 %hyaluronidase HCZB 매체에 적 운 oocyte 단지에서 분산의 소량 (약 2 µ L)를 전송 합니다.
2. SCNT에 필요한 때까지 37 ° C에서 지구 온난화에 6 %dBSA HCZB 매체에 적 운 세포를 놓습니다.
   참고: 때 fibroblast 세포 (예., murine 태아 섬유 아 세포 세포)는 조직 배양 접시에서 세포를 분리 하 고 펠 릿으로 원심 기증자 세포로 사용. HCZB 매체 6 %dBSA 포함 된 셀의 펠 릿 resuspend

5입니다. Oocytes enucleation

1. 0.9 g PVP 10 mL HCZB 매체를 추가 하 여 9 %PVP 매체를 준비, 하룻밤 냉장고 (4 ° C), 및 다음 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 소독.
2. 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 5 mL에 CB의 5 mg을 추가 하 여 CB 재고 솔루션 (1 mg/mL의 농도)를 준비 합니다. HCZB 매체 (5 µ g/mL의 최종 농도)와 CB 재고 솔루션을 희석 하 고 enucleation 솔루션으로 사용 합니다.
3. 흡입 및 멸 균된 피 펫을 통해 좀처럼 5 µ g/mL CB (enucleation 솔루션)를 포함 하는 HCZB 매체의 20 µ L에서 Mll 무대 oocytes를 세척 (안쪽 직경: 150 µ m 200 µ m에). 5 번 세척 절차를 반복 합니다. Enucleation 프로세스를 시작 하기 전에 enucleation 솔루션에서 지구 온난화에 약 10 분을 기다립니다.
4. 그림 2A와 같이 enucleation 챔버를 준비 합니다. Mll oocytes enucleation 챔버 흡입 하 고 길게는 피 펫을 사용 하 여 전송 (안쪽 직경: 150 µ m 200 µ m에); enucleation 솔루션의 4 µ L를 배치 하 고 미네랄 오일 챔버 커버.
   참고: 챔버, 대신 60 mm 페 트리 접시의 커버를 사용할 수 있습니다.
5. 스핀 들 및 현미경 (400 X) 실 온에서 MII 무대 oocyte의 염색체를 식별 합니다. 동양 발음 첫 극 지 몸, Mll 무대 oocyte는 스핀 들 및 염색체의 위치는 3 또는 9 시 micropipette를 들고 피 펫을 사용 하 여 (그림 2B) 위치.
   참고: 사용 하는 현미경 총에서 400 배 확대의 렌즈는. 또한, 목표 렌즈 한다 5 배 / 0.12과 40 X / 0.55 이다. Piezo 펄스 모는 피 펫의 zona pellucida의 빠른 드릴링 허용 합니다. 또한, 레이저 시스템 (예, XYClone) 압 전 구동 시스템 대신 zona pellucida 드릴링에 대 한 사용할 수 이기도 합니다.
6. 3-6, 압 맥 박 강도 설정 하 고 운전 피 펄스 micromanipulation 피 펫 (7-8 µ m 내부 직경 평면 종단 팁)를 사용 하 여 zona pellucida 드릴. Zona pellucida에 구멍을 연 후 완전히 스핀 들 및 세포질 (그림 2C)의 최소한의 금액으로 염색체 enucleate.
   참고:이 프로세스 동안 oocytes 경향이 단단히 접시 바닥에 붙이거나 BSA¹⁴없이 매체 때문에 플라스틱. 10 분 이내 enucleation 프로세스를 완료 해야 합니다, 그리고 enucleated oocytes 인큐베이터에 반환. 적절 한 수 한 enucleation에서 조작할 수 있습니다 oocytes의 10와 20 사이입니다. Oocytes의 큰 배치 enucleation 절차 반복 됩니다.
7. 가시광선 (그림 2C, 중간), 아래는 세포질에서 염색체의 부재를 확인 한 다음 0.3% dBSA CB 부족을 포함 하는 mKSOM 매체에 enucleated oocytes를 철저 하 게 세척 합니다. 37 ° C에서 5%에서 인큐베이터에 접시 소개 셀 퓨전까지 CO₂ .
   참고: 후 enucleation, ooplasm에서 제거 하는 세포질 포함 스핀 들 및 염색체.

6. 기증자 세포와 Enucleated Oocyte의 융합

1. HVJ-E의 준비
   1. 동결 건조 된 HVJ-E에 차가운 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션의 260 µ L를 추가 (키트, 참조 테이블의 재료) 및 플라스틱 아래로 완전히 중단 될 때까지.
      참고: 동결 건조 된 HVJ-E의 적절 한 금액은 한 병에 준비 하 고 260 µ L HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션 키트에 포함 된다.
   2. 5 µ L aliquots HVJ E 솔루션을 준비 하 고 셀 퓨전까지-80 ° C에서 저장.
      주의: 그것 이기 때문에 온도 민감한 얼음, HVJ E를 신중 하 게 취급 합니다. 실험, 적절 하 게 압력솥 HVJ 전자 재료 및 컨테이너 바이러스 구성 요소를 완전히 비활성화를 완료 후
2. 세포 융합
   1. 즉시 사용 하기 전에 셀 퓨전 버퍼의 20 µ L로 HVJ 전자 솔루션의 5 µ L를 희석. 장소 사용까지 얼음에 희석된 HVJ E 솔루션.
      참고: 셀 퓨전 버퍼 HVJ 전자 키트에 포함 되어 있습니다.
   2. 그림 3A와 같이 셀 퓨전 챔버를 준비 합니다. HCZB 매체는 피 펫을 사용 하 여 셀 퓨전 챔버 enucleated oocytes 전송 (안쪽 직경: 150 µ m 200 µ m에); 각 솔루션의 장소 4 µ L (9% 6%-BSA 기증자 세포, HVJ E 솔루션, HCZB 매체를 포함 하는 HCZB 매체 HCZB 매체에 PVP) 약 1 mL의 미네랄 오일와 챔버 커버.
      참고: 적절 한 수 한 셀 퓨전 절차 동안 조작에 대 한 상공 회의소에 전송 되는 enucleated oocytes의 5에서 30입니다. Oocytes의 큰 배치, 셀 퓨전 절차 반복 됩니다. 챔버, 대신 60 mm 페 트리 접시 커버를 사용할 수 있습니다, 사용할 수 있는 경우.
   3. HCZB 매체 400 X magnificationat 실 온에서 현미경 아래에 enucleated oocytes를 놓습니다. 기증자 세포 (6-7 µ m 내부 직경 평면 종단 팁), micromanipulation 피 펫을 사용 하 여 발음 하 고 셀 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션으로 추방.
   4. 다음에 분리 될 것 동등 하 게 서로 다른 직렬 세포 융합을 활성화 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션 적 운 세포 하나 하나 발음. HCZB 중간 지주 피 펫을 사용 하 여 enucleated oocytes를 하십시오. Micromanipulation 피 펫 piezo 펄스 (2-3의 3-6, 속도의 강도)와 zona pellucida 드릴.
   5. Zona pellucida에 구멍을 연 후 oocyte 멤브레인을 거치지 않고 볼륨 5 번 적 운 세포의 볼륨 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션 함께 oocyte 막에 단단히 적 운 세포를 놓습니다.
      참고: 적 운 세포에 대 한 6-7 µ m 내부 직경은 평면 종단 팁 micromanipulation 펫의 준비. 펫 부드러운 셀 출시를 유지 하기 위한 9 %PVP 매체를 사용 하 여 정기적으로 세척 되어야 한다. 단계 6.2.3-6.2.5 10 분 안에 완성 해야 합니다 또는 세포 융합의 효율 낮은 것 이다. HVJ-E의 막 융합 활동 압력가 마로 소독, 세제, 또는 70% 에탄올 치료에 의해 비활성화 됩니다. 실험 후 HVJ E 솔루션의 적절 하 게 삭제 수 해야 합니다.
   6. 세포 융합의 조작, 후 즉시 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA, oocytes는 전송 고 37 ° C에서 5%에서 인큐베이터로 이동 1 h의 CO₂ .

7. 재건축된 Oocytes 및 Trichostatin A 치료와 비타민 C의 활성화

1. TSA의 준비
   1. 5mm TSA 솔루션 3 µ L aliquots로 분배 하 고-20 ° c.에 솔루션 저장
   2. DMSO (12.5 µ M의 농도)의 1 mL에 5mm TSA 재고 솔루션의 2.5 µ L를 추가 합니다.
   3. 12.5 µ M TSA 재고 솔루션 활성화 매체 mKSOM 매체의 2 ml에서의 8 µ L를 희석 (50의 최종 농도 nM).
2. VC의 준비
   1. 메 마른 내 무료 물 1 mL로 VC의 1 밀리 그램을 추가 하 고-20 ° c.에 저장
   2. MKSOM 매체 (10 µ g/mL의 최종 농도) VC 재고 솔루션을 추가 합니다.
3. 재건축된 Oocytes의 활성화
   1. 셀 퓨전 후 1 시간 조기 염색체 응축 (PCC) 재건축된 oocytes (그림 3B)에서 현미경 (400 X)를 사용 하 여 확인 합니다.
   2. 정품 인증 매체를 재건축된 oocytes를 전송 (1.3 단계 참조) TSA를 포함 하 고 37 ° C에서 5%에서 6 h에 대 한 품 어 CO₂ 공기 (그림 3C). SCNT 배아에서 프로-핵의 형성을 관찰 후 2 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA (그림 2C)에 TSA 치료의 더 많은 시간을 적용.
4. MKSOM 보통 VC 보충 TSA 치료 배아를 전송 및 그림 3D와 같이 7 h에 대 한 품 어.
5. VC 치료의 7 h 후 mKSOM 중간 포함 0.3 %dBSA, VC 치료 배아를 전송 하 고 37 ° C에서 5%에서 4 일 동안 품 어 공기에 CO₂ .
   참고: 복제 된 생쥐를 생산, 형태학 상으로 정상적인 2 세포 단계 태아에 전송 oviducts 의사 임신 여성 쥐 (MCH(ICR)) 질 플러그 (pseudopregnancy의 하루 0.5)¹⁵를 발견 하는 날에. 19.5 일 후 이식 사이트 및 신생아의 수는 제왕 절 개 후 기록 됩니다.

결과

복제 마우스 배아를 생성 하려면 적 운 세포와 태아 섬유 아 세포 세포는 사용 되었다. 재건축된 oocytes oocyte 활성화 후 2 셀 단계에 개발의 수는 표 1에 표시 됩니다. Pronuclear (89 ~ 100%) 형성과 발전 2 세포 단계 (77 89%)의 아주 높은 속도 모든 조건 하에서 관찰 되었다. 적 운 세포에서 파생 되었고 2 셀 단계에 개발, 복제 된 배아의 일부 의사 임신 여성의 oviducts 전송 했다. 6 복제 된 자손 72 전송된 배아에서 TSA와 VC (그림 4)의 직렬 처리에 의해 세 임신 여성에서 생산 되었다. 복제 된 배아의 약 15%가 SCNT 절차¹²에 따라 용어를 개발 보고 되었습니다. 또한, 다른 기관에서 2 셀 배아 복제 전송 복제 배아에 단일 TSA 치료 보다 더 나은 개발을 대표 하는 9 ~ 15% 라이브 자손을 달성 했다. 또한, TSA와 VC 치료는 크게 blastocyst 단계에 체 외에서 배아 개발의 효율성을 개선 (표 2, P < 0.05, 스튜던트 t-검정). 이러한 생체 외에서 발달 데이터 TSA와 VC의 긍정적인 효과 마우스 종자도 셀 유형에 의해 제한 하는 방법을 보여 줍니다. 이 결과이 SCNT 메서드 복제 된 배아의 발달 능력을 용이 하 게 것이 좋습니다.

그림 1: dBSA 준비 합니다.
DBSA 솔루션을 준비 하기 위한 단계별 절차 묘사 된다. 이온 교환 범위 구슬의 색깔 변화에 의해 재판 될 수 있습니다. 위 왼쪽된 그림 쇼 BSA의 1.2 g 실내 온도에서 살 균 물 10 mL에 녹입니다. BSA, 해산 후 이온 교환 수 지 구슬 (오른쪽 상단) 추가 됩니다. 이온 교환 수 지 구슬 BSA 솔루션의 혼합물에서 파랑-녹색 색상을 변경 하는 때 골드 (오른쪽 아래), 신선한 것 들으로 구슬 바꿉니다. 왼쪽 아래 그림의 구슬의 색상이 블루-그린, 유지 및 이온 교환 완료 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: Enucleation 절차입니다.
(A) enucleation 챔버의 그림. Oocytes enucleation CB와 HCZB 매체에서 수행 됩니다. 압 전 구동 시스템에 대 한 9 %PVP 매체의 자리는 enucleation 위한 유리 피 펫을 준비 하는 데 사용 됩니다. 관광 명소는 미네랄 오일에 포함 됩니다. (B) 다이어그램 및 한 현미경 사진 스핀 들 및 enucleation 전에 염색체의 위치를 표시합니다. 화살촉을 블랙: 스핀 들 및 염색체. 붉은 화살표: 첫 번째 극 시체. (C) A 다이어그램 그리고 성공적인 enucleation 보여 현미경 사진. 화살촉을 블랙: 스핀 들 및 염색체. 붉은 화살표: 첫 번째 극 시체. 파란색 화살표: zona pellucida에 구멍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 셀 퓨전 절차 및 문화 SCNT 배아의 상태.
(A

토론

결론적으로, 이러한 결과 제시 SCNT 메서드 수 기술적인 어려움을 줄일 수 및 유전 수정 및 mRNA 보충 (표 1, 표 2), 필요 없이 SCNT의 효율성을 증가 하 고 좋습니다 보장 복제 된 배아의 안정적인 생산입니다. 이 방법을 통해 더 나은 생존 율 및 단순화 된 프로토콜 기존의 방법 보다 더 많은 SCNT 배아를 재구성 하 수 있습니다. 이 프로토콜에서 하나의 중요 한 단계는 세포 융합 이다. 복제 된 생쥐를 성공적으로 생성 하려면 HVJ-E 프로토콜에 설명 된 적절 한 양의 셀 퓨전 프로세스 동안 유지 되 고 oocytes 단계 6.2.3-6.2.5 동안 인큐베이터 10 분 이내에 반환 하는 데 필요한 생명 이다. 이후 20 ~ 30 기증자 세포 조작 피 펫에서 한 번에 HVJ-E 함께 발음 될 수 있다, 한 작업에서 얻은 oocytes 수는 기존 방법 보다 더 큰. 결국, 우리는 약 20 ~ 30 10 분 이내 다시 생성 된 oocytes를 생성할 수 있습니다. 한 시간 걸릴 한다 oocytes (100 이상)의 큰 배치와 셀 퓨전 절차를 작업 하는 경우에 또는 단계 6.2.3-6.2.5 반복 하 여 더 적은. 여기에 제시 된 기술과 방법 단순화 된 기술 요구 사항을 효율적인 프로토콜 사용할 수 있습니다.

현재, SCNT 배아의 개발 기본 분자 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 이 향상 된 SCNT 메서드는 또한 같은 재활 메커니즘 공부 하는이 방법은 하나의 실험에 많은 복제 배아를 생산할 수 있기 때문에 기여. 이 방법은 세포 융합에 대 한 손상 세포 막과 체세포를 사용. 따라서,와 같은 꼬리 팁¹⁶세포, sertoli 세포¹⁷, 미 발달 줄기 (ES) 세포¹⁸다른 셀에이 접근을 적용 하 수 있습니다. 꼬리 끝 셀, 등 비교적 큰 세포를 주입에 대 한 기존의 SCNT 방법을 사용 하는 경우 직접 oocyte 세포질에 그것은 된다도 라이브 배아를 더 기술적으로 까다로운. 또한, 상대적으로 하드 세포, sertoli 세포 등는 pipetting 주입 하 여 어렵다입니다. 이러한 다양 한 셀 형식으로 간주 됩니다 때 HVJ-E를 이용 하 여 세포 융합 방법 간단 하 고 효과적입니다. 비록 HVJ-E의 안전과 가치 설득 시연된^19,20왔다, 다시 농업 또는 생물 의학 목적을 위한 복제 동물 생산 HVJ-E를 사용 하 여의 타당성을 고려 하는 중요 한 수 있습니다.

또한, 최근 한 그룹은 성공적으로 복제 된 쥐 소변 세포²¹에서 파생 된 생산. 구조 포유류 멸종, 이제부터 SCNT 소변 셀 등 비-침략 적 방식으로 수집 된 셀을 사용 하 여 있을 것 이다 이상적인. 더 최근에, 다른 그룹은 직접 생성 된 항 원 특정 CD4를 사용 하 여 복제 마우스⁺ T²²세포. 그것은이 방법은 효율적으로 쥐 같은 세포에서 복제에 적용 됩니다 경우 검사 흥미로울 것입니다. 또한, Latrunculin A enucleation SCNT oocytes²³parthenogenetic 활성화 동안 말라 중 합 억제에 대 한 더 나은 대안으로 보고 되었습니다. 미래 연구는 Latrunculin A 치료 cytochalasin B, 대신 복제 된 자손의 세대를 더 향상 되는지 여부 공개 수 있습니다. 또한, TSA 치료는 성공적으로 사용 되었습니다 쥐, 돼지²⁴및 토끼²⁵ 치료 시간, 기간, 및 농도 변경 하 여. 또한, VC 돼지 SCNT¹⁰, 배아 개발 향상 뿐만 아니라 또한 인간 및 쥐²⁶iPS 셀 생산을 향상 시킵니다. 따라서, 그것은 다른 포유류 종에 TSA 및 VC 치료를 적용할 수 있습니다 그리고 우리가 각 종족에 대 한 TSA와 VC의 처리 시간을 최적화 할 수 있습니다 추측 하 듯.

결론적으로,이 방법은 간단한 절차와 효율성의 실용적인 수준으로 복제 된 쥐 생성 가능 하 게 것 이다. 따라서,이 연구의 결과 우리 SCNT 기술을 사용 하는 희귀 동물의 유전 자원 보존 및 핵 프로그래밍 및 초기 배아 발달의 분자 메커니즘을 이해를 발생할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NaCl	시그마-알드리치, Co., Lcc.	28-2270-5	중형
KCl	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	169-03542	중형
KH2PO4	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	165-04242	중간
MgSO4 · 7H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	137-00402	매체
CaCl2 · 2H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	039-00431	미디엄
D(+)-글루코스	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	041-00595	피
루브산 나트륨	중형 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	199-03062	매체
L-글루타민	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	G3126	중간
폴리비닐피롤리돈	용 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	168-17042	매체
NaHCO3	Nacalai tesque, Inc.	31213-15	중간
나트륨 DL- 젖산염	Nacalai tesque, Inc.	31605-72	매체
페니실린	Meiji Seika Pharma Co., Ltd.	4987222637671 (GTIN-13)	매체 용
스트렙토 마이신	Meiji Seika Pharma Co., Ltd.	4987222665643 (GTIN-13)	중간
멸균수, 내독소 무함유	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	196-15645	중간
EDTA 및 미드 도트; 2Na	Dojindo Lab.	345-01865	매체
페놀 레드	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	P0290	중간
HEPES 나트륨 염	용 Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	H3784	중간
폴리비닐 알코올	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	P8136	중간
소 혈청 알부민	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	A3311	매체
BT AG 501-X8 (D) Resin	Bio-Rad Lab., Inc.용	143-7425	dBSA
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich, Co., Lcc의 제조를	H3506	난모세포 및 적운 세포 수집용
Cytochalasin B	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	034-17554	적출 및 난모세포 활성화용
피에조 마이크로 매니퓰레이터	프라임 테크	PMM-150FU	마이크로 조작
HVJ 봉투 세포 융합 키트 GenomONE-CF	Ishihara 산업 kaisha, Ltd.	세포 융합을 위한 HVJ-E 현탁액 0.5mL와 세포 융합 완충액 10mL를 함유	CF001
SrCl2 · 6H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	193-09442	난모세포 활성화를 위해
EGTA	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	E8145	난모세포 활성화용
디메틸 설폭사이드	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	045-24511	용제
트리코스타틴 A	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	T1952	SCNT 배아로 배양
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	A5960	SCNT 배아로 배양하기 위해
미네랄 오일	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	M8410	매체 커버용