여기 우리는 마우스 뇌 혈관 침투성 분석 결과 형광 추적기 관류 뇌혈관 장애의 동물 모델에 적용 되는 다음의 복 주사를 사용 하 여 현재. 한 반의 두뇌 양적 침투성을 평가 하 고 추적 프로그램 시각화/immunostaining에 대 한 다른 사용 됩니다. 절차 10 쥐에 대 한 5-6 시간 걸립니다.
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이 논문에서
요약
초록
혈액-뇌 장벽 (BBB) 두뇌 microenvironment 독 소 및 순환에 있는 병원 체에서 보호 하 고 두뇌 항상성 유지 하는 특수 방 벽 이다. 방 벽의 주요 사이트는 그 장벽 기능 꽉 세포 접합 및 원형질 막에 경과 전송기에서 결과 뇌 모세 혈관의 내 피 세포. 이 함수는 pericytes와 함께 혈관 단위 (NVU)를 형성 하는 이다 통제 된다. Alzheimer의 질병 (광고), 등 여러 신경 질환 뇌종양 장애인된 BBB 기능으로 연결 됩니다. BBB 침투성의 평가 중요 한 신경 질환의 심각도 및 고용 치료 전략의 성공에 따라서.
우리는 현재 여기 간단한 아직 강력한 침투성 분석 결과 여러 가지 마우스에 성공적으로 적용 된 둘 다, 유전과 실험 모델. 방법은 매우 양적이 고 일반적으로 적용 되는 현미경에 의해 추적 형광 분석에 비해 객관적입니다. 이 방법에서는, 마우스는 쥐 마비 뒤 수성 불활성 형광 추적기의 믹스와 함께 intraperitoneally 주입 수 있습니다. 동물의 심장 관류 뇌, 신장 또는 다른 장기 수확 전에 수행 됩니다. 장기 무 균 및 centrifuged는 상쾌한에서 형광 측정에 의해 따라. 혈액 관류의 바로 전에 심장 펑크에서 그려진 혈관 칸막이를 정규화 목적을 위해 제공 합니다. 조직 형광은 양적를 젖은 무게와 혈 청 형광으로 정규화 추적 침투성 색인. 추가 확인, contralateral hemi 두뇌 immunohistochemistry 보존 추적 형광 시각화 용도로 활용할 수 있습니다.
서론
Microvascular 내 피 세포 (ECs)는 ensheathed 기저 lamina에, 밀접 하 게 관련 된 pericytes (Pc), 및 지하실 막의 끝 발1 봉투 이다 (ACs)에서 지 원하는 이루어져 혈액-뇌 장벽 (BBB) ,2. 여러 셀 형식을 지원 하 고 규제 장벽 기능을 주로 ACs 및 Pc, 상호 작용 하는 ECs 그리고 또한 신경 및 microglia, 모두는 함께 형성 neurovascular 단위 (NVU). NVU는 BBB는 혈액을 매개로 독 소 및 두뇌에 들어가기에서 병원 체의 전송 제한 기능에 대 한 중요 합니다. 이 함수는 ECs 사이 p-당단백질 (P-gp) 그 경과 분자 endothelium 입력으로 다시 같은 전송기의 작용으로 인해 claudin-5, occludin, zonula occludens-1, 꽉-접합 분자의 결과 선박 루멘1,2,3. 그러나 BBB는 영양분 (포도 당, 철, 아미노산) 등 필수 분자의 수송에 대 한 특정 전송기 EC 플라즈마 막
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프로토콜
모든 동물은 절차 동안 통증이 나 불편을 최소화 하는 최대 관심을가지고 처리 합니다. 이 절차 우리 기관의 동물 보호 지침을 다음과 같이 하 고 지역 위원회 (Regierungspraesidium 다름슈타트, 승인 번호 FK/1044)에 의해 승인 되었습니다.
침투성 시험 쥐에서 vivo에서 에 대 한 작업 단계의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 각 단계의 자세한 내용은 아래 설명 되어 있습니다.
1입니다. 동물 처리
-
준비 및 추적기 및 마 취약의 관리
- 침투성 시험 전날 이상 포함 하는 조직에 대 한 레이블된 튜브와 금형을 준비 합니다. 깨끗 한 증기 두건에서 작업 하 고 80% 에탄올으로 청소 하는 도구를 사용 하 여 프로토콜을 통해 무 균 상태를 유지 합니다. 현재 프로토콜에 대 한 3-6 개월의 성숙한 성인 연령 집단에 있는 남성 또는 여성 야생-타입 (WT) 또는 angiopoietin-2 (중앙-2) 함수 이득 (GOF) CD1 마우스를 사용 합니다. 앞에서 설명한 10쥐의 유전형을 수행 합니다.
참고....
- 침투성 시험 전날 이상 포함 하는 조직에 대 한 레이블된 튜브와 금형을 준비 합니다. 깨끗 한 증기 두건에서 작업 하 고 80% 에탄올으로 청소 하는 도구를 사용 하 여 프로토콜을 통해 무 균 상태를 유지 합니다. 현재 프로토콜에 대 한 3-6 개월의 성숙한 성인 연령 집단에 있는 남성 또는 여성 야생-타입 (WT) 또는 angiopoietin-2 (중앙-2) 함수 이득 (GOF) CD1 마우스를 사용 합니다. 앞에서 설명한 10쥐의 유전형을 수행 합니다.
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결과
우리는 최근에 angiopoietin-2 (중앙-2) 함수 이득 (GOF) 마우스 건강 조건10제어 마우스 보다 더 높은 두뇌 혈관 침투성을가지고 나타났습니다. 뇌졸중 유발 쥐에서 그것은 또한 쇼 프 쥐 했다 더 큰 경색 크기와 제어 littermates 보다 큰 침투성. 이러한 결과 BBB에 침투성에 중앙 2의 중요 한 역할을 보여 줍니다. 따라서 프로토콜 GOF 마우스를 활용 하 고 비보에 침투성 분석 결과 설명 하기 위해 littermates를 제어 하는 그들을 비교. 그러나,이 방법은 어떤 질병 모델, 유전자 변형 마우스 모델에 적용 될 수 있다 또는 우리가 했던 이전 10,11,,1213.......
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토론
혈액-뇌 장벽 부전 기본 및 보조 뇌종양 이나 뇌졸중 등 신경 성 질환의 숫자와 연결 됩니다. BBB 붕괴는 종종 CNS 부 종 생명이 연결 됩니다. 트리거 오프닝 분자 메커니즘의 해명 또는 BBB의 폐쇄는 그러므로 신경 장애 그리고 일반적으로 치료 의미의 조사 연구자에 의해 있다. 그러나, 조사 하는 방법을 문학에서 보고 된 BBB 침투성에서 vivo에서 수시로 연관 된다 형광 이미지17,18 의 지루하고 주관적인 정량화에 의존 하는 기술적인 어려움 , 19. 또한, 방법의 일부 포함 뇌 형광 이미징으로 더 단단한 방 벽을 형성 하지 않는다 표면 뇌 혈관의 침투성을 나타내는 그릇입니다. 동물은 종종 중요 한 피 분수 인해 잘못 된 해석으로 이어지는 끼얹는다는 객관적인 뇌 조직 흡 광도 (예: 에반스 블루 침투성 평가)에 따라도 때 정량화 수행 되.......
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
저자는 Sphingonet 컨소시엄이이 작업을 지원 하기 위한 Leduq 기초에 의해 투자를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품 또한 "혈관 차별화 및 리 모델링" 공동 연구 센터에 의해 지원 되었다 (CRC / Transregio23, 프로젝트 C1)와 7. FP, COFUND, 괴테 국제 Postdoc 프로그램 이동-IN, No. 291776 자금. 우리 더 처리 및 유전형 캐슬 린 서머를 한 쥐와 그녀의 기술 지원에 대 한 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 테트라메틸 로다민(TMR) 덱스트란 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 덱스트란 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| 케타민(Ketavet) | 조에티스 | ||
| 자일라진(Rompun) | 바이엘 | ||
| 0.9% 식염수 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T 화합물 | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% 포름알데히드 용액 | Sigma | 252549-1L | 4% 용액 준비 |
| 소 혈청 알부민, 분획 V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 항체, 클론 MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| 염소 안티 랫 alexa 568 | 분자 프로브 | A-11077 | |
| 염소 안티 랫 alexa 488 | 분자 프로브 | A-11006 | |
| DAPI | 분자 프로브 | D1306 | |
| 아쿠아 폴리 마운트 | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21 게이지 버터 플라이 바늘 | BD | 387455 | |
| 세럼 수집 튜브 | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL 에펜도르프 튜브 | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech 정밀 와이프 티슈 와이퍼 | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384웰 블랙 플레이트 | Greiner | 781086 | |
| 슬라이드 superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE 유봉 | Wheaton | 358029 | |
| 전기 오버헤드 교반기 | VWR | VWR VOS 14 | |
| 플레이트 리더 | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 분광 이미징 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 시스템 | Nikon | ||
| 연동 관류 시스템 | BVK Ismatec | ||
| 마이크로 원심분리기 | Eppendorf | 5415R |
참고문헌
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M.
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