이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
Langerhans의 섬이라고도 하는 췌장 섬은 포도당 조절 및 기타 중요한 생물학적 기능에 대한 호르몬을 생산하는 내분비 세포의 클러스터입니다. 이 섬은 주로 5가지 유형의 호르몬 분비 세포로 구성됩니다: α 세포는 글루카곤을 분비하고, β 세포는 인슐린을 분비하고, δ 세포는 소마토스타틴을 분비하며, δ 세포는 그렐린을 분비하고, PP 세포는 췌장 폴리펩티드를 분비합니다. 작은 섬에 있는 세포의 60-80%는 인슐린 분비를 공부하는 가장 중요한 세포 인구인 β 세포입니다. 췌도는 생체 내 인슐린 분비를 연구하는 중요한 모델 시스템입니다. 고품질 섬을 확보하는 것은 당뇨병 연구에 매우 중요합니다. 대부분의 아일렛 격리 절차는 콜라게나아제 주입, 가혹하고 복잡한 소화 절차 및 다중 밀도 구배 정제 단계의 부위에 기술적으로 접근하기 어렵습니다. 이 논문은 상세한 설명과 현실적인 데모와 간단한 고수율 마우스 섬 격리 방법을 갖추고 있습니다, 다음과 같은 특정 단계를 보여주는: 1) Vater의 암풀라에서 콜라게나제 P의 주입, 췌장 덕트를 결합하는 작은 영역과 일반적인 담관, 2) 효소 소화 및 외분비 췌장의 기계적 분리, 및 3) 단일 그라데이션 정제 단계. 이 방법의 장점은 Vater의 접근성이 좋은 암풀라를 사용하여 소화 효소를 주입하고 효소 및 기계적 접근법을 사용하여 보다 완전한 소화를 하고, 더 간단한 단일 그라데이션 정제 단계입니다. 이 프로토콜은 마우스당 약 250-350개의 섬을 생성합니다. 및 섬은 다양한 생체 내 연구에 적합하다. 이 절차의 가능한 주의 사항은 효소 소화 및 / 또는 장기간 그라데이션 배양으로 인해 잠재적으로 손상된 섬이며, 이 모든 것은 인큐베이션 시간의 신중한 광고 정당화에 의해 크게 피할 수 있습니다.
서론
췌도 격리에 대한 문헌에는 두 가지 일반적인 방법이 있습니다. 하나는 췌장을 절제하고 수술 가위를 사용하여 작은 조각으로 다이싱 한 다음 콜라게 나아제 용액1,2,3으로소화해야합니다. 또 다른 더 정확한 방법은 소화 효소를 소개하기 위하여 췌장에 존재하는 덕트의 네트워크를 이용하는 것입니다. 다음 사이트는 소화 효소 주입에 사용되었습니다 : 담즙 과 낭포 덕트의 접합, 일반적인 담관으로 담낭,또는 일반적인 담관 자체 1,4,5. 작은 섬이 췌장에 고르게 분포되지 않은 것으로 알려져 있습니다. 비장 영역은 가장 작은섬 6을 포함합니다. 소화 효소를 전달하기 위해 해부학 경로를 사용하는 두 번째 방법은 비장 영역을 포함하여 췌장의 보다 완전한 관류를 허용하지만,이 절차는 종종 기술적으로 Vater의 암풀라의 클램핑 또는 봉합이 필요합니다. 도전. 섬 정화의 관점에서, 다중 밀도 그라데이션뿐만 아니라 세포 스트레이너 및 자기....
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프로토콜
여기에 설명된 모든 방법은 텍사스 A&M 대학의 동물 관리 및 사용 위원회(ACUC)에 의해 승인되었습니다. 수술 도구 의 필요성은 도 1에 나타내고 절차의 회로도 도면은 그림2에 도시되어 있습니다.
1. 솔루션
- 1L HBSS(1X)를 만들기 위해 증류수 900mL에 100mL(재고)의 100mL를 추가하여 행크의 균형 잡힌 염분 용액(HBSS)을 준비합니다.
- 얼음 차가운 1X HBSS의 450 mL에 100X 태아 소 혈청 (FBS)의 50 mL을 추가하여 STOP 용액을 준비하십시오 (신선하게 만들어야하며 1 시간 이내에 사용해야합니다); 이것은 500 mL STOP 솔루션을 만듭니다. STOP 용액을 4°C로 유지합니다.
- 콜라게나제 P 용액을 얼음 차가운 1X HBSS에 1 mg/mL의 콜라게나아제 P를 첨가하여 (사용 후 1시간 이내에 신선하게 만들어야 함)을 준비하십시오. 6 mL/ 마우스를 사용합니다.
- 콜라주나제 P 용액에 0.05%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 첨가합니다(이것은 고립된 섬에 영양분을 제공합니다). 예를 들어, 6 mL 콜라게나제 P 용....
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결과
이 절차의 적절한 완료는 복강에서 마우스 해부학의 일부 이해가 필요합니다. 이것은 Vater의 암풀라의 적절한 식별과 일반적인 담관의 클램핑을 허용합니다. 전체 절차는 일반적으로 1-2 시간이 걸립니다. 4-6 마우스에서 동시에 작은 섬을 분리하는 것이 더 효율적이므로 여러 샘플을 함께 원심 분리 할 수 있습니다. 섬 따기의 시간은 작은 섬의 수와 소화의 효율성에 따라 다릅니다. 1개의 마우스에서 250-350개의 섬을 선택하는 데 약 1시간이 걸릴 수 있습니다.
이 백서에는 매우 사실적인 이미지가 다수 포함되어 있습니다: 그림 3은 일반적인 담관 및 간 동맥을 노출하는 마우스의 복강을 보여줍니다. 그림 4는 더 밝은 색상으로 보이는 일반적인 담관의 전체 길이뿐만 아니라 췌장과 십이지장 사이의 (바늘이 삽입 될 곳) 근처 더 크고 빛나는 Vater의 암풀을 보여줍니다. 클램.......
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토론
이 프로토콜에는 콜라게나아제 관류와 소화가 포함되며, 그 다음에는 섬의 정화가 뒤따릅니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 췌장 1,4,7의효과적인 주입 및 완전한 관류입니다. 이 프로토콜의 전달 방법은 효소가 아일렛 1을 둘러싼 외분비 조직을 더잘 소화하기 위해 해부학 적 경로를 통과하는 것을 허용합니다. 또한,이 기술은 섬4,6의가장 높은 농도를 가지는 비장 영역의 완전한 소화에 적합합니다. 이 프로토콜은 잘 제어 된 소화 시간과 신중하게 실행 된 정화 단계로 250-350 개의 건강한 섬을 생성 할 수 있습니다. 이 프로토콜로부터 분리된 섬은 포도당 자극된 인슐린 분비 ex vivo
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리는 회로도의 그녀의 예술적 그림에 대한 제니퍼 Munguia 씨에게 매우 감사드립니다. 휴스턴의 지역 공영 라디오 방송국 KPFT의 마이클 R. 호니그(Michael R. Honig) 씨에게 편집 지원을 부탁드립니다. 이 연구는 미국 당뇨병 협회 #1-15-BS-177 (YS) 및 NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS)에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 또한 USDA 국립 식량 농업 연구소, 해치 프로젝트 1010840 (YS) 및 R01 DK095118 (SG)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3 mL 주사기 | BD | 309657 | Hoding 콜라겐 분해 효소 P |
| 커버 유리 집게 | VWR | 82027-396 | 절개 절차를 돕기 위해 마우스의 피부를 잡고 |
| 곡선 집게 | Sigma-Aldrich | Z168696 | 췌장 제거 중 조직 잡기 |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | 수술 전 마우스를 마취하기 위해 |
| 100mm 페트리 접시 | VWR | 30-2041 | 섬 문화에 사용 |
| 30 G. ½ 인치 바늘 | BD | 305106 | 콜라겐 분해 효소 P를 전달하기 위해 vater의 Ampulla의 침투 -이 게이지는 대부분의 CBD에 잘 맞기 때문에 사용됩니다 |
| 50ml 튜브 | VWR | 89039-658 | 소화 된 췌장 조직, 콜라겐 분해 효소 P 및 정제 된 섬을 보유 |
| 방수 수분 장벽이있는 흡수 패드 | VWR | 82020-845 | |
| 스윙 버킷 및 감속 기능이 있는 원심분리기 5810R | Eppendorf | 5811FJ478114 | 조직 펠릿화에 사용, 펠릿은 원뿔형 튜브의 바닥에 형성됩니다 - 스윙 버킷 원심분리기가 필요합니다. 또한 decelaration 기능은 그라디언트 레이어를 형성하는 데 중요합니다. |
| 콜라겐 분해 효소 P- 1g | Roche 진단 | 11249002001 | 외분비 췌장 소화용 |
| 곡선형 수술용 가위 | Fisher-Scientific | 13-804-21 | 개방형 마우스 복부 |
| 절단 해부 현미경 | Olympus | SZX16 | 췌장에 콜라겐 분해 효소를 정확하게 전달하기 위한 주요 해부학적 구조 식별에 사용 |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | 세척 셀 |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | 그라디언트 형성용 |
| 광원 | Leeds | LR92240 | 현미경의 가시성 향상 |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | RNase |
| RPMI-1640 매체 제거용 L-글루타민 | 없음 Corning | 15-040-CV | 배양 섬 |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digesting of exocrine tissue |
| 작은 수술용 가위 | VWR | 82027-578 | 췌장에 닿은 Cuttitng tissue |
참고문헌
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancr....
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재인쇄 및 허가
