이 문서는 테트로도톡신와 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac 채용 하 여 뉴런 사이의 monosynaptic 연결을 테스트 하는 방법을 갖추고 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
여기, 새로운 기술은 불린다 Tetrotoxin (TTX) 설계 저항에 대 한 프로 빙 Synapses (TERPS) 대상 뉴런 간의 monosynaptic 연결에 대 한 테스트에 적용 됩니다. 메서드는 특정 연 접 신경에서 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac, 유전자 변형 활성기의 공동 식에 의존합니다. 상 상속 후 시 냅 스 파트너와 연결 TTX, NaChBac을 표현 하지 않는 뉴런의 전기 활동을 차단 존재 전체 세포 기록에 의해 결정 됩니다. 이 방법은 활성 또는 연결의 기자로 서 칼슘 이미징 작업을 수정할 수 있습니다. TERPS 성장 네트워크에서 연결을 결정 하는 데 사용할 수 있는 도구 집합을 추가 합니다. 그러나, TERPS는 독특한에 또한 안정적으로 대량 또는 볼륨 전송 및 전송 일 좀 보고.
서론
신경 과학의 주요 목표는 정보 회로 통해 흐르는 하는 방법을 이해 하는 뉴런 사이의 연결을 매핑합니다. 수많은 접근 및 자원 모델 시스템1,2의 범위에서 신경 사이의 기능적 연결을 위한 테스트를 사용할 수 있게 있다. 전기 생리학을 사용 하 여 가장 정확한 배선 다이어그램을 생성 하기 위해 두 셀 사이의 관찰된 연결 인지 직접 및 간접 및 polysynaptic monosynaptic를 해결 하기 위해 중요 하다. 포유류 뉴런에이 구별을 만들기 위한 황금 표준 연 접 세포에서 단일 action potentials와 두 번째 뉴런 흥분 성의 postsynaptic 전류 (EPSCs)의 발병 사이의 대기 시간을 측정 하는 것입니다. Monosynaptic 연결 몇 밀리초 및 낮은 다양성3의 짧은 대기 시간을 가져야 한다. 이 방법은 복잡할 수 있다 무척 추 동물 신경 세포에 시 냅 스 탐지 postsynaptic conductances와 녹음 사이 긴 electrotonic 거리 때문에 지연을 일으키는 체세포 녹음 사이트까지 그들의 dendrites에서 발생할 수 있기 때문에 전극입니다. 이러한 지연을 모호성에 관한 많은-monosynaptic 기여....
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프로토콜
1. 파리와 식별 GAL4 발기인 라인 준비
- GAL4 발기인 라인을 선택 하 고 파리 UAS-NaChBac transgene과 활성화를 위한 optogenetic transgene 크로스.
참고: UAS-CsChrimson11 는 그것의 높은 전도도 및 NaChBac 중재 활동 전위를 활성화는 쉽게 선택 됩니다. UAS-NaChBac 및 UAS-CsChrimson 블루밍턴 주식 저장소에서 사용할 수 있습니다. - 에탄올 (35mm)에서 재고 솔루션으로 모든 trans 망막을 준비 하 고-20 ° c.에 냉장고에서 솔루션을 저장
- Rehydrated 감자의 약 5 mL에이 주식의 믹스 28 µ L 음식 찌 질 하 고 기존의 초파리 매체의 유리병의 상단에이 혼합물을 추가.
- 1-3 일110.2 m m 모든-trans-망막을 포함 하는 음식에 csChrimson을 표현 하는 성인 파리를 올립니다.
2. 준비 TTX 주식
- 증류수 또는 이온을 제거 된 물에서 1mm TTX의 재고 솔루션을 만듭니다. 몇 달 동안 실험실 냉장고에이 솔루션을 저장 합니다. 많....
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결과
TERPS는 모노-및 뉴런 간의 시 냅 스 연결에 polysynaptic 기여 사이 구별 하는 데 사용 됩니다. 셀의 약한 자극 직접 연결을 테스트 하는 데 사용 될 수 있습니다, polysynaptic 연결 (그림 1A) 보충 자주 큰 연 접 활동을 운전 한다. TERPS 공동 TTX 구분 나트륨 채널 NaChBac와 optogenetic 활성기를 표현 하 고 polysynaptic 연결 (그림 1B)를 제거 하는 TTX의 연결을 테스트 하 여 작동 합니다. TTX는 TERPS (그림 2A)에 대 한 적절 한 준비 하기가 초파리 뇌의 활동 전위를 효과적으로 차단 합니다. NaChBac 나트륨 채널의 유전자 변형 식 구출 뉴런에 흥분 하며 큰 고원 잠재력 (그.......
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토론
TERPS 분석 회로 확인 된 신경 세포 사이의 시 냅 스의 검출 함으로써 크래킹에 사용 되는 현재 기술을 칭찬. 특히, 접근 선택 인구 TTX 구분 나트륨 채널 NaChBac 신경의 흥분을 복원 하는 동안 TTX와 활동 전위를 광범위 하 게 입을 여 monosynaptic 연결을 보여준다. 시 냅 스 릴리스 postsynaptic 이벤트는 전체 셀 녹음과 모니터링 하는 동안 optogenetic 자극에 의해 elicited입니다. TERPS 대량 민감한 되 고 또는 더 긴 거리 및 약리 조작을 수행할 수 있는 능력에 elicited 볼륨 전송에 의해 파악 등 다른 접근 방식에서 자체를 구별. 기술은 고용 비교적 간단 하 고 시 냅 스의 사전 및 사후 시 냅 스 부분에 듀얼 전체 셀 녹음을 얻기 보다 더 가능 optogenetic 자극에 대 한 하나만 기록 전극과 광원을 요구 한다. TERPS의 기본적인 요구가 이다 활동 전위 되 고 시스템에 TTX에 의해 쉽게 차단 됩니다. 하지만, TTX 분류학 문의의 광범위 한 범위에 걸쳐.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 의견에 대 한 사려깊은 검토 뿐만 아니라 여호수아가 수, 조나단 Schenk, 원고에 감사 하 고 싶습니다. 우리 또한 벤 화이트와 해 롤 드 Zakon는 기술에 대 한 토론에 감사 하 고 싶습니다. 조나단 Schenk 그림 3A에 대 한 데이터를 제공합니다. 이 작품은 Whitehall 재단 보조금과 QG NIH R21에 의해 지원 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | 신경 활성제로 사용됨 |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | TTX는 규제 물질이므로 TTX를 구입하려면 특별 허가가 필요할 수 있습니다. |
| 트랜스 망막 | Sigma-Aldrichall 트랜스-레티널 | R2500 | 채널로돕신 |
| 용접 가능한 321 스테인리스 스틸에 대한 보조 요인이 필요합니다 시트, 0.002" 두꺼운 10인치 Wide | McMaster Carr | 3254K7 | 맞춤형 플라이 홀더를 만드는 데 사용됩니다. 사용자 정의 호일은 제공된 PDF 파일에서 pololu.com 레이저 절단 할 수 있습니다 |
| 해부 현미경 | Zeiss | Stemi 2000-C | 준비 해부에 사용 |
| 왁 | Almore | Eectra Waxer 66000 | 호일에서 플라이를 확보하기 위해 해부 중에 사용 |
| 파라핀 왁스 | Joann | 4917217 | |
| 번호 5 집게 | Fine Science Tools | #5CO | 해부 및 해 |
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| M850F2 | |||
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참고문헌
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal con....
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재인쇄 및 허가
