방법 논문

Drosophila 테트로도톡신 저항 나트륨 채널을 사용 하 여 Monosynaptic 연결 검사

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⸱

DOI:

10.3791/57052

⸱

2018년 2월 14일

 , 
1Department of Biology, University of Maryland

이 논문에서

요약

이 문서는 테트로도톡신와 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac 채용 하 여 뉴런 사이의 monosynaptic 연결을 테스트 하는 방법을 갖추고 있습니다.

초록

여기, 새로운 기술은 불린다 Tetrotoxin (TTX) 설계 저항에 대 한 프로 빙 Synapses (TERPS) 대상 뉴런 간의 monosynaptic 연결에 대 한 테스트에 적용 됩니다. 메서드는 특정 연 접 신경에서 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac, 유전자 변형 활성기의 공동 식에 의존합니다. 상 상속 후 시 냅 스 파트너와 연결 TTX, NaChBac을 표현 하지 않는 뉴런의 전기 활동을 차단 존재 전체 세포 기록에 의해 결정 됩니다. 이 방법은 활성 또는 연결의 기자로 서 칼슘 이미징 작업을 수정할 수 있습니다. TERPS 성장 네트워크에서 연결을 결정 하는 데 사용할 수 있는 도구 집합을 추가 합니다. 그러나, TERPS는 독특한에 또한 안정적으로 대량 또는 볼륨 전송 및 전송 일 좀 보고.

서론

신경 과학의 주요 목표는 정보 회로 통해 흐르는 하는 방법을 이해 하는 뉴런 사이의 연결을 매핑합니다. 수많은 접근 및 자원 모델 시스템1,2의 범위에서 신경 사이의 기능적 연결을 위한 테스트를 사용할 수 있게 있다. 전기 생리학을 사용 하 여 가장 정확한 배선 다이어그램을 생성 하기 위해 두 셀 사이의 관찰된 연결 인지 직접 및 간접 및 polysynaptic monosynaptic를 해결 하기 위해 중요 하다. 포유류 뉴런에이 구별을 만들기 위한 황금 표준 연 접 세포에서 단일 action potentials와 두 번째 뉴런 흥분 성의 postsynaptic 전류 (EPSCs)의 발병 사이의 대기 시간을 측정 하는 것입니다. Monosynaptic 연결 몇 밀리초 및 낮은 다양성3의 짧은 대기 시간을 가져야 한다. 이 방법은 복잡할 수 있다 무척 추 동물 신경 세포에 시 냅 스 탐지 postsynaptic conductances와 녹음 사이 긴 electrotonic 거리 때문에 지연을 일으키는 체세포 녹음 사이트까지 그들의 dendrites에서 발생할 수 있기 때문에 전극입니다. 이러한 지연을 모호성에 관한 많은-monosynaptic 기여 대 발생할 수 있습니다. 또한, 작은 시 냅 스 이벤트 체세포 녹음 사이트에 도달 하기 전에 부패 수 있습니다 하 고 polysynaptic 이벤트를 모집 하는 강한 연 접 활동, 운전.

무척 추 동물에 monosynaptic 연결에 대 한 테스트를 다양 한 기법 개발 되었습니다. 한 가지 방법은 초과 ++ Mg 및 Ca+ +를 포함 하는 높은 divalent 양이온 솔루션 (안녕-디)를 사용 합니다. 이 솔루션 줄이는 릴리스 확률 및 monosynaptic 입력된4,5의 탐지를 증가 활동 전위 임계값에 의해 polysynaptic 연결을 차단 합니다. 하지만 필요한 ca ++ ++ Mg의 정확한 비율을 결정, 사소한 이며 polysynaptic 기부금도 겸손 자극6지속 될 수 있습니다. GFP 재구성에서 시 냅 스 파트너 (이해) 라는 다른 접근은 monosynaptic 연결 7을 유추 시 냅 스에서 발견 하는 사전 및 postsynaptic 막 간의 근접 합니다. 여기, 녹색 형광 단백질 (GFP)의 구성 요소는 하나의 신경에 표현 하 고 분자의 상호 보완적인 조각 putative postsynaptic 파트너에 표시 됩니다. 형광의 존재 두 개의 뉴런 충분히 가까이에 GFP 분자의 재구성을 허용 하는 한 시 냅 스의 존재를 의미 나타냅니다. 이해 수 보고 시 냅 스 거짓, 하지만, 두 세포 막, 신경 또는 잘라냅니다 apposed 밀접 하 게 해야 하는 경우. 이해의 변종 활성 시 냅 스8에 재구성 되므로 synaptobrevin 직접 GFP의 연 접 부분을 밧줄로 매 여 이러한 가양성을 제거 합니다. 이해 및 그 변종 초파리 CNS 기능 연결을 결정 하는 수단이 되어, 하는 동안 일부 연결 하지 만들 수 있습니다 보이는 파악 하 여 사전 및 postsynaptic 파트너 사이의 거리는 비교적 큰 경우. 이것은 neuromodulation9 또는 GABAergic 억제10와 관련 된 볼륨 전송의 평가에 특히 관련입니다.

여기, 보완 및 새로운 기술은 초파리 CNS에에서 직접 monosynaptic 연결 테스트에 대 한 시연입니다. 테트로도톡신 (TTX)의 공동 식으로 작동 하는이 메서드를 테트로도톡신 설계 저항에 대 한 프로 빙 Synapses (TERPS),-저항 나트륨 채널, NaChBac, 및 상 상속에서 녹음 하는 동안 연 접 세포에서 optogenetic 활성 postsynaptic 파트너9. TTX, 존재 모든 활동 전위 중재 활동 NaChBac 표현 된 셀에 표시 되지 않습니다. NaChBac 채널 선택적으로 허용 하는 시 냅 스 전송 빛 갖는 대상된 연 접 셀에 흥분을 복원 합니다. 이 메서드는 연결 postsynaptically polysynaptic 회로 채용의 가능성을 줄이면서 체세포 녹음 하 여 해결할 수 연 접 신경의 강한 활성화를 허용 합니다. 중요 한 것은,이 기술은 볼륨 전송의 연구를 허용 하 고 회로 통해 하나의 신경에서 발표 하는 송신기의 확산을 보여준다. 또한, TERPS 기존의 약리학 통해 연결의 화학 본질을 밝힐 수 있다. TERPS는 TTX 구분 나트륨 수로의 유전자 변형 식 수 있도록 어떤 모델 시스템에 사용 하기 위해 적합 이다.

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프로토콜

1. 파리와 식별 GAL4 발기인 라인 준비

  1. GAL4 발기인 라인을 선택 하 고 파리 UAS-NaChBac transgene과 활성화를 위한 optogenetic transgene 크로스.
    참고: UAS-CsChrimson11 는 그것의 높은 전도도 및 NaChBac 중재 활동 전위를 활성화는 쉽게 선택 됩니다. UAS-NaChBac 및 UAS-CsChrimson 블루밍턴 주식 저장소에서 사용할 수 있습니다.
  2. 에탄올 (35mm)에서 재고 솔루션으로 모든 trans 망막을 준비 하 고-20 ° c.에 냉장고에서 솔루션을 저장
  3. Rehydrated 감자의 약 5 mL에이 주식의 믹스 28 µ L 음식 찌 질 하 고 기존의 초파리 매체의 유리병의 상단에이 혼합물을 추가.
  4. 1-3 일110.2 m m 모든-trans-망막을 포함 하는 음식에 csChrimson을 표현 하는 성인 파리를 올립니다.

2. 준비 TTX 주식

  1. 증류수 또는 이온을 제거 된 물에서 1mm TTX의 재고 솔루션을 만듭니다. 몇 달 동안 실험실 냉장고에이 솔루션을 저장 합니다. 많은 기관 분류 유해 또는 제어 물질 TTX TTX의 저장에 관한 기관 정책 확인.

3. 전기 생리학에 대 한 파리 준비

  1. 1-3 일 오래 된 성인 파리 발생 하는 모든-trans-망막에와 함께 음식에 수집 합니다.
    참고: 패치 초파리 신경12,13클램핑에 대 한 자세한 설명에 대 한 2013 년에 목요일와 터너를 참조 하십시오.
  2. 유리 섬광 유리병에 파리를 넣어. 파리를 무력화를 1 분 동안 얼음에 유리병을 놓습니다.
  3. 굵은 집게를 사용 하 여 비행 주문 품 기록 챔버에 삽입. 3 ½"원형 레이저 1/16" 아크릴에서 잘라 챔버에 의하여 이루어져 있다. 사용자 지정 호 일 2 부분 에폭시를 장착 하는 센터에 컷 ¾"구멍 이다. 호 일 포함는 삼각형 모양의 비행에 삽입 되는 희망 합니다.
  4. 왁 스 또는 UV 경화 에폭시 단단히 챔버 내에 기록 그것을 확보 하 여 동물의 주위에 적용 됩니다.
  5. 시각화는 stereomicroscope 아래 목이 광섬유와 대비를 밝게. 간접 조명에 대 한 목이 섬유 그렇게 그들은 측면에서 직접 비행을 밝히는 그들을 조정 하 여 설정 합니다.
  6. 가장 낮은 가능한 설정의 명확한 시각화 수 있습니다 가벼운 수준을 조정 합니다. 이 빛의 강도 개별 실험에 걸쳐 달라 집니다.
    참고:이 프로토콜 적응 시킬 수 있다 방법14explant에서 원래의 뇌 를 사용 하 여.
  7. 외부 기록 식 염 수를 검색 합니다. M m에는 염 분 포함: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-트리 스 (hydroxymethyl) 메 틸-2-aminoethane-sulfonic 산, 8 트 레 할 로스, 포도 당 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2포4, 1.5 CaCl2및 4 MgCl2 (270-275 m ω를 조정). 염 분 95% O2/5% CO2 (carbogen) 버블링 됩니다 하 고 pH 7.315조정 했다.
  8. 장소 세포 외 기록 염 분의 4-6 방울 비행 준비. 이 시점에서, 더 나은 시정을 위한 해 부 현미경에서 가벼운 수준을 높입니다.
  9. 전기 분해를 사용 하 여 텅스텐 와이어에 선명 하 게. 통신을 하려면 알 것3 의 포화 솔루션을 준비 하 고 끝은 날카롭게 때까지 20 번 각 100 ms 대 한 솔루션으로 와이어의 끝을 찍기 동안 약 20 V의 교류 전류를 적용 합니다. 날카롭게 텅스텐 와이어를 사용 하 여 비행 하 고 따라서 뇌를 노출의 머리에 표 피를 제거 하.
  10. 더욱 기도 그것을 둘러싸고 있는 지방 시체를 제거 하 여 뇌를 노출 합니다. 더듬이 돌출부를 액세스 하는 경우 부드럽게 가시성을 높이기 위해 챔버를 기록 하는 호 일 아래 안테나 턱 구부러진된 텅스텐 와이어 또는 유사한 도구를 사용 합니다. 날카로운 집게를 사용 하 여 부드럽게 찢 어 떨어져 녹음 만들 수 관심의 영역을 다루는 glial 넣기.
  11. 전기 생리학 장비에 기록 챔버를 전송 합니다. 즉시 외부 기록 식 염 수와 시작 관류 carbogen 두뇌를 보존 하와 버블링. 염 저수지 현미경 무대 위에 배치 되 고 중력-먹이로 준비. 진공 라인과 2 L 삼각 플라스 크를 사용 하 여 폐기물 염 분을 수집.

4. 얻을 전체 세포 기록

  1. 상업적인 피펫은 끌어당기는 패치 펫을 당겨. 7 m ω 근처 팁 저항 적절 한 피 펫을 달성 하기 위해 설정에 대 한 설명서를 참조 하십시오.
  2. 패치 피 펫에 내부 기록 솔루션의 4 µ L를 추가 합니다. 내부 식 염 수로 구성 되어 140 칼륨 aspartate 10 HEPES, 4 MgATP, 0.5 나3GTP, 1 EGTA, 1 m m에서 KCl.
  3. 전체 세포 기록에 대 한 패치 클램프 앰프를 설정 합니다. 앰프의 오프셋 0 고 테스트 펄스를 제공 하는 앰프를 설정 합니다. 여기, 오전 시스템 패치 클램프 증폭기 2400 사용 됩니다.
  4. 피펫으로 통해 긍정적인 압력을 적용 하는 셀. 피펫으로와 셀 문의 micromanipulator를 사용 합니다. 긍정적인 압력을 릴리스 합니다. 설정-60 막의 지주 잠재력 mV. 피펫으로 낮은 하위 피코 현재 들고 알 수 있듯 셀의 막과 gigaohm 물개를 형성 한다.
    참고: 경우 GFP를 사용 하 여 셀을 대상으로 안내, ChR2 활성화 및 잠재적인 시냅틱 우울증을 방지 하기 위해 epifluorescent 빛의 사용을 최소화 하십시오. 또한 5 단계를 적용 하기 전에 몇 분 동안 기다립니다.
  5. -50에서 테스트 펄스를 제공 하는 앰프 설정 mV-60 ~ mV. 이 설정은 패치 클램프 앰프에 표준입니다. 테스트 펄스는 큰 capacitative 과도 대표 현재 필요한 패치 피펫으로 충전을 발표할 예정 이다. 2400 오전에 용량 보상 손잡이 조정 하 여 capacitative 과도 또는 유사한 앰프를 제거 합니다.
  6. 세포 막 파열 하 고 전체 셀 구성에 부정적인 압력의 짧은 펄스를 적용 합니다.
    참고: 모든 셀 구성 신경의 커패시턴스를 보여주는 capacitative 과도 있는 큰 증가 있을 때 관찰 됩니다. 현재 지주 (초기)에 작은 증가 또한 관찰 가능성이 됩니다. 전류 클램프 모드를 앰프를 설정 하 고 조정-60-50 하 셀의 잠재력 mV.

5. 시 냅 스 연결 테스트

  1. 광 펄스를 생성 하는 LED 드라이버를 방 아 쇠를 데이터 수집 (DAQ) 시스템을 구성 합니다. 여기, 내쇼날인스트루먼트 DAQ 시스템 Matlab와 LED 드라이버는 아날로그 신호를 제공 하는 데 사용 됩니다. LED 휘도 아날로그 신호는 드라이버를 통해 조정 됩니다. LED는 620-630 nm 파장 LED입니다.
  2. 고성능 적색 LED 직접 준비 아래 위치. 0.238 mW/m m2 에 도달 하면 즉시 빛의 강도 조정 합니다.
  3. 연 접 신경 postsynaptic 세포의 관심에서 녹음 하는 동안 활성화 됩니다. 셀 활성화 optogenetically, pharmacogentically, 달성 또는 신경 자극을 통해. 여기, csChrimson 및 빨간 빛의 짧은 펄스 적용 됩니다.
    참고: EPSPs로 전류 클램프 또는 EPSCs로 전압 클램프에 시 냅 스 연결을 모니터링할 수 있습니다. 시 냅 스 연결 40 ms 빛 펄스 응답에 TTX를 적용 하기 전에 표시 됩니다. 연결을 관찰 하는 경우에, 그것은 가능성이 그 뉴런 synaptically 연결 중 모노-또는 polysynaptically. 잠재적인 들고 따라 흥분 성의 또는 금지 연결을 강조 하 고 조정할 수 있다.
  4. 연결 1의 최종 농도 달성 하기 위해 관류 시스템에 TTX를 추가 정상적인 염 분에서 관찰 되는 경우 µ M. 사용 recirculating 펌프를 캡처하고 TTX를 보존 하기 위해 염 분을 다시 사용 합니다. 연동 펌프는 목욕에서 염 분 해결책을 그릴 하 고 염 분이 저수지에 반환.
  5. 상승 및 하강에 목욕에서 염 분 수준을 허용 하지 않는 강한 일정 한 진공을 제공 하는 펌프의 속도 조정 합니다.
    참고: TTX의 응용 프로그램 전체 셀에서 모니터링 되 고 신경에 활동 급상승의 발생 한다. 이 충분 한 TTX는 식 염 수에 추가 된 확인 합니다.
  6. 빨간 불 (40 ms 각 펄스에 대 한)의 짧은 펄스를 다시 적용 합니다. 이 시점에서 남아 있는 어떤 시 냅 스 연결 높습니다 monosynaptic. TTX에 남아 있는 시 냅 스 연결의 화학 본질을 테스트 하는 반복 식 염 수를 약리 길 항 제를 추가 합니다.
    참고: optogenetics 및 형광 타겟팅 뉴런의 결합 때 수 있습니다 지속적으로 활성화 녹음을 얻기 위해 노력 하는 동안 신경의 연 접 인구 수는 없습니다. 이 시 냅 스 우울증으로 이어질 수 있다 고 어려운 연결을 볼 수 있습니다. 빨간색 fluorophore 신경 및 channel2rhodopsin 시각화를 사용할 수 있는 csChrimson 긴 여기 밴드 녹색 형광 단백질의 범위를 광범위 하 게 확장 하는, 때문에 (Ch2R) 세포 인구를 흥분 시키기 위해 사용할 수 있습니다. 이렇게 특정 유전학 및 사용자 지정 필터 큐브 필요 합니다. 적당 한 파리를 생성 하려면 LexA 또는 Q 시스템 이진 식 시스템에서 빨간 fluorophore (RFP 또는 mCherry)를 표현 하는 파리를 확인 합니다. 이들은 파리 Gal4 발기인와 UAS-Ch2R 및 UAS-NaChBac 이펙터 유전자와 교차 해야 합니다. Epifluorescence에 대 한 최적의 필터 큐브 것입니다 빨간 fluorophore를 자극 하지만 하지 자극 Ch2R. 또한 좁은 여기 범위, 필터 세트 다량 방출된 빛을 수집 하는 긴 패스 방출 필터를 포함 해야 합니다. 우리 크로마 포함 부품 번호 et580/25 x와 (49306 세트)에서 t600lpxr에서에서 설정 사용자 지정 필터를 사용 하지만 et610lp 장벽/방출 필터.

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결과

TERPS는 모노-및 뉴런 간의 시 냅 스 연결에 polysynaptic 기여 사이 구별 하는 데 사용 됩니다. 셀의 약한 자극 직접 연결을 테스트 하는 데 사용 될 수 있습니다, polysynaptic 연결 (그림 1A) 보충 자주 큰 연 접 활동을 운전 한다. TERPS 공동 TTX 구분 나트륨 채널 NaChBac와 optogenetic 활성기를 표현 하 고 polysynaptic 연결 (그림 1B)를 제거 하는 TTX의 연결을 테스트 하 여 작동 합니다. TTX는 TERPS (그림 2A)에 대 한 적절 한 준비 하기가 초파리 뇌의 활동 전위를 효과적으로 차단 합니다. NaChBac 나트륨 채널의 유전자 변형 식 구출 뉴런에 흥분 하며 큰 고원 잠재력 (그...

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토론

TERPS 분석 회로 확인 된 신경 세포 사이의 시 냅 스의 검출 함으로써 크래킹에 사용 되는 현재 기술을 칭찬. 특히, 접근 선택 인구 TTX 구분 나트륨 채널 NaChBac 신경의 흥분을 복원 하는 동안 TTX와 활동 전위를 광범위 하 게 입을 여 monosynaptic 연결을 보여준다. 시 냅 스 릴리스 postsynaptic 이벤트는 전체 셀 녹음과 모니터링 하는 동안 optogenetic 자극에 의해 elicited입니다. TERPS 대량 민감한 되 고 또는 더 긴 거리 및 약리 조작을 수행할 수 있는 능력에 elicited 볼륨 전송에 의해 파악 등 다른 접근 방식에서 자체를 구별. 기술은 고용 비교적 간단 하 고 시 냅 스의 사전 및 사후 시 냅 스 부분에 듀얼 전체 셀 녹음을 얻기 보다 더 가능 optogenetic 자극에 대 한 하나만 기록 전극과 광원을 요구 한다. TERPS의 기본적인 요구가 이다 활동 전위 되 고 시스템에 TTX에 의해 쉽게 차단 됩니다. 하지만, TTX 분류학 문의의 광범위 한 범위에 걸쳐...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 의견에 대 한 사려깊은 검토 뿐만 아니라 여호수아가 수, 조나단 Schenk, 원고에 감사 하 고 싶습니다. 우리 또한 벤 화이트와 해 롤 드 Zakon는 기술에 대 한 토론에 감사 하 고 싶습니다. 조나단 Schenk 그림 3A에 대 한 데이터를 제공합니다. 이 작품은 Whitehall 재단 보조금과 QG NIH R21에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
UAS-csChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55135신경 활성제로 사용됨
UAS-NaChBacBloomington Drosophila Stock Center9466Resotores TTX
TetrodotoxinTochris1078TTX는 규제 물질이므로 TTX를 구입하려면 특별 허가가 필요할 수 있습니다.
트랜스 망막Sigma-Aldrichall 트랜스-레티널R2500채널로돕신
용접 가능한 321 스테인리스 스틸에 대한 보조 요인이 필요합니다  시트,  0.002"  두꺼운  10인치  WideMcMaster Carr3254K7맞춤형 플라이 홀더를 만드는 데 사용됩니다. 사용자 정의 호일은 제공된 PDF 파일에서 pololu.com 레이저 절단 할 수 있습니다
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왁AlmoreEectra Waxer 66000호일에서 플라이를 확보하기 위해 해부 중에 사용
파라핀 왁스Joann4917217
번호 5 집게Fine Science Tools#5CO해부 및 해
해부 가위Fine Science Tools15001-08해부 중 큐티클의 일부를 제거하는 데 사용
텅스텐 와이어A-M 시스템797500해부를 위한 날카로운 바늘을 만들기 위해 전기분해와 함께 사용
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속도 컨트롤러 연동 펌프Zitrades (Amazon)N/APWM 디밍 컨트롤러 LED 라이트 또는 리본, 12 볼트 8 암프, 조절 가능한 밝기 라이트 스위치 디머 컨트롤러 DC12V 8A 96W LED 스트립 라이트 B
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데이터 수집 시스템 내쇼날인스트루먼트NI PCIe-6321            781044-01앰프에서 컴퓨터로 데이터를 기록하는 데 사용됩니다
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모든 은 서 왁서 와 함께 사용됩니다부에 사용 대물 렌즈용 경사 조명 광섬유를 결합하려는 경우에만 사용

참고문헌

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