방법 논문

5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사

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DOI:

10.3791/57056

⸱

2018년 5월 3일

 ,  ,  ,  , 
1DANDRITE - Danish Research Institute of Translational Neuroscience, Dept. of Biomedicine, Aarhus University, 2Dept. of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University

이 논문에서

요약

RNA 합성을 측정 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 5-Bromouridine 셀에 추가 하 고 합성된 RNA에 통합 됩니다. RNA 합성은 반전 녹음 방송 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 이라는 분석과 RNA의 5-Bromouridine-타겟 immunoprecipitation 다음 라벨, 직후 RNA 추출에 의해 측정 됩니다.

초록

정상 상태 RNA 레벨 두 가지 조건 사이 비교는, 변화는 생산 또는 RNA의 변경으로 인해 발생 하는 여부를 구별 수는. 이 프로토콜의 RNA 생산, 5-Bromouridine immunoprecipitation, 짧은 기간 (예를 들어, 1 시간) 내에서 합성 하는 RNA의 조사를 가능 하 게 선행 하는 RNA의 라벨을 사용 하 여 측정 하는 방법을 설명 합니다. 5 Bromouridine 라벨 및 immunoprecipitation의 α-amanitin 악티노마이신 D 등 독성 transcriptional 억제제의 사용을 통해 장점은 없습니다 또는 단기 사용 중 세포 생존 능력에 매우 낮은 효과. 그러나, 5-Bromouridine-immunoprecipitation만 캡처 RNA 시간 내에 짧은 라벨 생산, 천천히 생산 뿐만 아니라 급속 하 게 저하 때문에 RNA이이 방법으로 측정 하기 어려운 수 있습니다. 5-Bromouridine-immunoprecipitation에 의해 체포 5 Bromouridine 이라는 RNA 반전 녹음 방송, 정량적 중 합 효소 연쇄 반응, 그리고 다음 세대 시퀀싱 하 여 분석할 수 있습니다. RNA의 모든 종류, 조사 하 고 메서드가이 예에서 제시 mRNA를 측정에 국한 되지 않습니다.

서론

5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) 없이 세포에서 RNA 생산의 연구 또는 매우 제한 된 효과에 짧은 기간1,2라벨 동안 생리학 세포. 메서드는 안티-BrU 항 체 (그림 1)를 사용 하 여 이라는 RNA의 IP에 의해 새로 합성된 RNA로 부 순 뒤 합성 uridine 파생의 기반으로 합니다.

수십 년간 그 단백질 합성은 transcriptionally 통제 될 수 있다, 그리고 녹음 방송 요인의 존재는 이상의 50 년 전 가설 되었다 알려져 있다3. 오늘, 그것은 여러 가지 질병은 전사 및 RNA 안정성의 dysregulation에 의해 발생 알려져 (참조4보충 그림 S1), RNA 생산에 변화를 측정 하는 능력은 이해 질병에 매우 중요 하 고 개발입니다.

다른 한편으로, RNA 생산 규제 도구 너무 적은 또는 너무 많은 단백질 식 또는 파 킨 슨 병 (PD)에 같은 단백질 축적으로 인 한 질병 치료를 위한 새로운 가능성을 제공 합니다. 주된 단백질 축적으로 불용 성 집계 PD에서 α-synuclein 이며 α-synuclein 유전자의 유전자 곱셈 발생 가족 PD5α-synuclein의 수준, 질병에 직접 연결 합니다. 또한, α-synuclein 농도 의존 방식으로 집계합니다. Α-synuclein mRNA 수준의 Downregulation 그러므로 성공적으로 달성 하고있다 RNA 간섭 PD 설치류 모델6,7에 신경 세포 손실 감소를 사용 하 여 흥미로운 치료 전략 이다.

그것은 질병 또는 치료 내정간섭에 기인 하는 RNA 생산의 변화를 측정할 수 있을 해야 합니다. 첨단 방법 등 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량), 뒤 반전 녹음 방송 RNA의 측정 정상 상태 수준은 구별 또는 transcriptional 규칙에 의해 발생 하는 변경의 수 변경 RNA 안정성입니다. RNA 감소율의 조사를 위해 널리 사용 되는 방법은 transcriptional 기계 화합물 α-amanitin 악티노마이신 D 뒤에 부패 RNAs의 측정 등을 사용 하 여 차단 합니다. 그러나, 세포 apoptosis8,9의 유도 등에서 전사의 전반적인 방해와 관련 된 몇 가지 문제가 있다. 세포 독성 효과 옆에 transcriptional 억제제는 또한 느린 세포질 통풍 관에 α-amanitin 악티노마이신 D (참조10검토)의 특이성의 부족 등 여러 가지 기술적인 문제를 제시.

전사의 전반적인 막힘을 피하기 위해, 뉴클레오티드 아날로그 사용 되었습니다, 5-ethynyl uridine (5-EU), 4-thiouridine (4-TU), 부 순 등. 이들은 쉽게 포유류 세포에 의해 채택 고 새로 합성된 RNA, RNA의 특정 시간 프레임 내에서 펄스 라벨 사용에 통합. BrU 5-EU와 4-부 엉, 보다 적은 독성 그것은 선택11,12의 기본 아날로그.

BrU IP RNA 합성 속도, 안정성 모두를 조사 하 고 따라서 총 RNA에 변화의 근본 원인 사이 구별을 사용할 수 있습니다. 이 문서는 RNA 합성의 측정에 초점을 것입니다 고2 RNA 안정성의 조사에 대 한 자세한 내용은 참조를 참조. RNA 합성을 조사, 세포는 BrU 예 1 h BrU-IP1 (그림 1C) 다음으로 이라는 짧게. 이 시간 내에 짧은 라벨 합성 하는 RNA의 측정을 가능 하 게 하 고 관찰 된 변화 보다 RNA 합성에 실시간 정량 하 여 총 RNA에 변화를 측정 하 여 규정의 더 나은 견적을 줄 것 이다. 그러나 그것은,, 그 라벨에, 예를 들어 1 h만 하더라도 저하 아직도 있을 수 있다 관찰 RNA 수준에 영향을 미치는 언급 한다.

BrU IP 실험에서 RNA는 실시간 정량1 또는 다음 세대 시퀀싱2,13다운스트림 분석에 적합 합니다. 다른 표준 RNA 검출 방법, 북부에 게 더 럽 히기 등 ribonuclease 보호 분석 결과, 특정 RNAs에 적용할 수도 있습니다.

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프로토콜

참고: 달리 명시 되지 않은 실 온에서 모든 단계를 수행 하 고 얼음 이나 냉장고 (를 제외 하 고는 차입에서 SDS를 포함 하는 버퍼) 버퍼를 유지. 프로토콜 5 섹션으로 나뉘어져: 준비의 RNA 샘플; ip; 구슬의 준비 구슬;에 RNA BrU 표시의 바인딩 차입 및 3 단계 페 놀-페 놀/클로 프롬-클로 프롬 추출;에 의해 바운드 BrU 셔 서 RNA의 정화 (실시간 정량 Pcr를 사용 하 여이 예제)에서 RNA의 분석

1입니다. RNA 샘플의 준비

  1. 자동화 된 셀을 사용 하 여 카운트 HEK293T 셀 카운터와 10 mL 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 보충 10% 태아 종 아리 혈 청 및 50 µ g/mL 페니실린/스)에서 10 cm 배양 접시에서 3,500,000 셀의 합계를 씨앗 > 40 µ g RNA 따라 추출 48 h 후. 37 ° C, 5% CO2세포를 유지 합니다.
  2. 시드, 후 48 h 8 mL 성장 매체를 발음 하 고 셀 밖으로 건조를 피하기 위해 2 mL를 남겨두고. 2mm BrU를 추가 하 고 모든 치료 8 mL를 발음 하는 성장 매체, 그리고 8 mL BrU 포함 성장 매체를 다시 적용 하기 전에 셀에서 잔여 2 mL를 제거. 이 유전자 발현에 변화를 일으킬 수 있기 때문에, 세포는 BrU의 응용 프로그램에 따라 신선한 미디어 사용을 하지 않습니다.
  3. BrU와 치료 1 시간에 대 한 셀을 품 어. 5 mL 행 크의 버퍼에 셀을 세척 하 고 2 mL 0.05% 트립 신을 사용 하 여 셀을 trypsinize. 8 mL 성장 미디어 반응을 중지, 15 mL 튜브에 세포를 전송 1000 x g 2 분에 대 한 셀 아래로 회전을 추가 합니다.
  4. 제거는 상쾌한 고 RNA 격리를 사용 하 여 셀 펠 릿에서 총 RNA 추출 키트 ( 재료의 표참조) 또는 다른 메서드를 선호 하 고 진행 준비까지-80 ° C에서 RNA RNase 무료 H2o. 저장소에에서 elute.

2입니다. 준비 구슬의 IP에 대 한

  1. 조사를 더하기 하나 pipetting 동안 손실에 대 한 계정 및 혼합 소용돌이 추가 샘플 수에 대 한 배치에 비즈를 준비 합니다. 회전 혼합 하 여 철저 하 게 반대로 마우스 IgG 자석 구슬 resuspend 고 RNase 무료 1.5 mL 튜브에 샘플 당 20 µ L 구슬 꺼내. 장소는 마그네틱 스탠드에는 구슬을 두고 약 20 s 1.5 mL 튜브에 수집.
  2. 제거는 상쾌한, 마그네틱 스탠드에서 튜브를 꺼내와 pipetting으로 400 µ L 1 x BrU IP 버퍼에서 resuspend. 아주 짧게 2에 대 한 튜브를 회전 탁상 원심 분리기에 s 마그네틱 스탠드에 다시 배치 하 고는 상쾌한 제거. 한 번 세척 단계를 반복 합니다.
  3. 헤 파 린을 사용 하 여 구슬 블록 난다 바인딩입니다. 1 ml 1 구슬 resuspend x BrU-IP + 1 mg/mL 헤 파 린 버퍼, 그리고 회전 30 분 세척을 위한 구슬, 단계 2.2에서 두고.
    참고: 헤 파 린은 RNAs 바인딩을 위해 경쟁할 것 이다 마이너스로 충전 된 중합체 이다. tRNA 또는 다른 관련이 없는 RNAs 또한 사용할 수 있습니다 경우 다운스트림 응용 프로그램 시퀀싱 하지.
  4. BrU IP 버퍼 x 1 ml 1 구슬 resuspend 고 추가 1.25 µ g/샘플 안티-α-Bromodeoxyuridine 항 체, BrU 인식 합니다. 1 시간에 대 한 구슬 회전 하는 동안 품 어 또는 실 온에서 하룻밤.
  5. 세척 단계 2.2에서 세 번 비즈. 1mm BrU와 떠나 난다 바인딩 IP 중의 위험을 구슬 하 고 이로써 항 체의 감도 낮추는 30 분 회전 보충 50 µ L/샘플 1 x BrU IP 버퍼에 구슬 resuspend.
  6. 3 번 단계 2.2에서 구슬 세척 하 고 50 µ L/샘플 1xBrU-IP 버퍼에서 resuspend.

3. 구슬에 RNA BrU 표시 바인딩

  1. 1.3 단계에서 RNA 추출에서 RNA 농도 측정 자외선 보이는 분 광 광도 법, 사용 하 고 40 µ g RNA 각 샘플에서 RNase 무료 H2O 200 µ L의 총 볼륨을 희석.
  2. 열 변성 RNA와 짧게 탁상 원심 분리기에서에서 회전에 80 ° C에서 2 분 동안 RNA 샘플. BrU-IP + BSA/RNAse 억제제 x 200 µ L 2를 추가 합니다.
  3. 50 µ L resuspended과 구슬 단계 2.6에서에서 각 샘플을 준비 하 고 회전 1 h. 세척 4 번 단계 2.2에서 구슬을 두고 추가 합니다.

4. 차입 및 3 단계 페 놀-페 놀/클로 프롬-클로 프롬 추출에 의해 RNA의 정화

  1. RNA을 elute 및 페 놀 추출
    1. RNA, elute 200 µ L 차입 버퍼에 구슬 resuspend 그리고 그 후 신속 하 게 추가 200 µ L 페 놀, pH 6.6 (주의: 독성, 참조 단계 4.1.2 아래) 샘플에서 어떤 비 RNA 분자를 제거 하.
    2. 회전 혼합 샘플, 그리고 스핀 탁상 원심 분리기에 25000 x g에서 3 분.
      참고: 페 놀 독성 및 피부 보호를 착용 하는 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 약 산 성 pH RNA 및 DNA 하지 추출 됩니다 보장 합니다. RNA의 친수성 특성상 위 수성 단계에서 유지 됩니다. 단백질의 소수 성 코어 페 놀을 바인딩할 하 고 낮은 유기 페 놀-단계로 이동 합니다.
  2. 페 놀-클로 프롬 추출
    1. (처리에 경험에 따라 200 µ L의 약 190 µ L) 가능한 만큼 위 단계를 발음 하 고 200 µ L 페 놀/클로 프롬, pH 6.6 튜브로 이동 (주의: 독성, 참고). 샘플에 걸쳐 동일한 금액을 발음 해야 합니다.
    2. 소용돌이 샘플 스핀 25000 x g에서 3 분에 대 한 믹스.
      참고: 클로 프롬 독성 및 피부 보호를 착용 하는 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 클로 프롬 반전 녹음 방송14 및 중 합 효소 연쇄 반응을15를 억제 하 여 RNA의 다운스트림 분석에 영향을 미칠 수 있는 페 놀 제거에 추가 됩니다.
  3. (지금 약 180 µ L), 앞으로 수성 위 단계 발음 하 여 클로 프롬 적 출을 수행 하 고 200 µ L 클로 프롬을 포함 하는 관에 전송. 소용돌이 샘플을 혼합 하 고 스핀 25000 x g에서 3 분.
  4. (지금 약 170 µ L) 앞으로 수성 위 단계를 발음 하 고 17 µ L (1/10 볼륨) 3 M 채널3COONa, pH 6.0 포함 된 튜브에 그것을 전송. 중화 하 고 수성 해결책에서 RNA를 침전, RNA와 함께 침전 하 고 RNA 펠 릿을 더 보이는 게 2 µ L glycogen (20 mg/mL)을 추가 합니다.
  5. 몇 번 튜브를 거꾸로 하 여 RNA와 혼합 소금 이온 사이의 바인딩을 증가 500 µ L 96% 에탄올을 추가 합니다. 드라이 아이스에 하룻밤-20 ° C에서 15 분 튜브를 둡니다.
  6. 25000 x g, 4 ° C는 펠 렛을 방해 하지 않고 30 분 삭제 상쾌한에 샘플을 회전 하 고 모든 잔여 소금 제거 하려면 185 µ L 75% 에탄올에 펠 릿을 세척. 25000 x g, 5 분 동안 4 ° C에서 회전 합니다.
  7. 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한을 완전히 삭제 하 고 열린 뚜껑으로 5 ~ 10 분 건조 펠 릿을 둡니다. RNase 무료 H2O 튜브의 측면에 적용 되는 펠 렛을 방해 하지 않으려면 10 µ L resuspend.

5입니다. RNA의 분석

  1. CDNA cDNA 반전 녹음 방송을 사용 하 여 준비 ( 재료의 표참조) 장비 또는 선호 하는 다른 방법을 사용 하 여 2 µ L RNA 샘플 및 1 µ g 효 모 총 RNA RNA 매체로 cDNA 합성 반응 (사용 되지 않음 cDNA 다음 세대 시퀀싱에 사용 하는 경우)에 대 한. 효 모 RNA 없이 1 µ g RNA를 사용 하 여 해당 입력의 cDNA 준비에 대 한.
  2. 희석 cDNA 1시 25분와 혼합 희석 9 µ L cDNA 10 µ L 정량으로 마스터 믹스와 1 µ L fluorogenic 프로브, 두 재료의 테이블에에서 지정 된.
    참고: cDNA 희석 cDNA 준비 및 사용 되는 정량 Pcr 방법에 따라 달라 집니다.
  3. (예를 들어, 7500 빠른 실시간 PCR 시스템 또는 동등한) 다음 정량 프로그램 실행: 50 ° C, 20에서 2 분 95 ° C, 3의 40 주기에서 s s 95 ° C와 30에서 60 ° c.에 s

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결과

BrU 라벨 시간의 초기 테스트 AsPC-1 셀에서 수행 했다. 셀 0, 1, 2, 및 4.5 h, 총 RNA 추출 및 BrU IP BrU로 치료 했다. GAS5와 GAPDH는 충분 한 약 9-및 44 배 변경에 비해 배경 (0 h) GAPDH와 GAS5, 각각을 도달 하는 1 h 라벨 BrU IP RNA에서 측정 되었다.

BrU IP 및 위에서 설명한 분석 변경 사항을 발견 하는 경우를 조사 하는 데 사용 했다 (PLK-2) 폴로-같은 키 2에 α-synuclein mRNA의 정상 상태 수준에서 억제 mRNA 합성1에 변화에 의해 발생 했다. 1 h 라벨 시간이 배경 (그림 2)에 비해 충분 한 라벨을 제공 하 고 또한 영향을가지고 처리 시간을 허용 하기 때문에 선택...

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토론

이 프로토콜 RNA 생산 새로 라벨의 결정 BrU, 즉각적인 RNA 추출 및 BrU 셔 서 RNA의 immunoprecipitation와 1 시간에 대 한 RNA를 생산을 위한 BrU IP의 사용을 설명 합니다. 이 메서드는 참조16에서 설명한 하 고이 문서를 페 놀-클로 프롬 정화 단계 BrU의 낮은 농도와 미리 치료 구슬 IP 특이성 및 RNA 순도 증가 몇 가지 추가 단계를 포함 IP 다음 RNA 순도 증가. 또한, 우리는 또한 여기 BrU IP의 특이성 BrU와 비 BrU에서 캡처한 RNA를 비교 하 여 보여주는 데이터 제시 세포 치료. 페 놀-클로 프롬 정화 저렴 한, 하지만 부 순으로 표시 하는 RNA의 낮은 금액을 고려 하면 다운스트림 분석에서 증가 신호 대신 RNA 청소 키트를 사용 하 여 가져올 수 있습니다. 그러나 우리의 경험, 이다, 샘플에서 RNA의 가장 동등한 추출 페 놀-클로 프롬 정화를 사용 하 여 얻어진 다.

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

Lundbeck 재단 아후 스 대학, Dandrite와 Lundbeck a/S 지원이 작품.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Ribolock Rnase 억제제ThermoFisherEO0381
Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgGLife Technologies11202D
α-Bromodeoxyuridine mouse 항체BD Bioscience555627
Nanodrop 1000Thermo Fisher자외선 가시광선 분광광도법
수성 포화 페놀 pH 6.6ThermoFisherAM9712
페놀:클로로포름:IAA 25:24:1 pH 6.6ThermoFisherAM9732
고순도 RNA 분리 키트Roche11828665001
고용량 cDNA 역전사 키트ThermoFisher4368814
Taqman Fast Advanced Master MixThermoFisher4444557qPCR 마스터 믹스
Taqman RNA 프로브ThermoFisherSNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1Flurogenic probes
7500 Fast Real-Time PCR systemApplied Biosystems
HEK293T cell lineATCC
Dulbecco's Modified Eagle's MediumLonzaBE12-604F
태아 송아지 혈청BiochromS0115
페니실린/스트렙토마이신BiochromA2213
행크 버퍼5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 및 136.8 mM NaCl pH 6.77, 오토클레이브.
DEPC-H2O0.1% 디에틸피로카보네이트 처리된 H2O
2xBrU-IP 버퍼DEPC의 pH 7.5 및 500mM NaCl H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse 억제제2xBrU-IP 버퍼 1 μ 지/&무; L BSA 및 80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL 헤파린2xBrU-IP 완충액, 1:1 DEPC-H2O 희석 및 1mg/mL 헤파린
1xBrU-IP2xBrU-IP 완충액 보충, DEPC-H2O에서 1:1 희석 및 0.5 &mu 보충; 지/&무; L BSA 및 20 U/mL Ribolock
용리 완충액0.1% SDS in RNAse-free H2O

참고문헌

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