RNA 합성을 측정 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 5-Bromouridine 셀에 추가 하 고 합성된 RNA에 통합 됩니다. RNA 합성은 반전 녹음 방송 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 이라는 분석과 RNA의 5-Bromouridine-타겟 immunoprecipitation 다음 라벨, 직후 RNA 추출에 의해 측정 됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
정상 상태 RNA 레벨 두 가지 조건 사이 비교는, 변화는 생산 또는 RNA의 변경으로 인해 발생 하는 여부를 구별 수는. 이 프로토콜의 RNA 생산, 5-Bromouridine immunoprecipitation, 짧은 기간 (예를 들어, 1 시간) 내에서 합성 하는 RNA의 조사를 가능 하 게 선행 하는 RNA의 라벨을 사용 하 여 측정 하는 방법을 설명 합니다. 5 Bromouridine 라벨 및 immunoprecipitation의 α-amanitin 악티노마이신 D 등 독성 transcriptional 억제제의 사용을 통해 장점은 없습니다 또는 단기 사용 중 세포 생존 능력에 매우 낮은 효과. 그러나, 5-Bromouridine-immunoprecipitation만 캡처 RNA 시간 내에 짧은 라벨 생산, 천천히 생산 뿐만 아니라 급속 하 게 저하 때문에 RNA이이 방법으로 측정 하기 어려운 수 있습니다. 5-Bromouridine-immunoprecipitation에 의해 체포 5 Bromouridine 이라는 RNA 반전 녹음 방송, 정량적 중 합 효소 연쇄 반응, 그리고 다음 세대 시퀀싱 하 여 분석할 수 있습니다. RNA의 모든 종류, 조사 하 고 메서드가이 예에서 제시 mRNA를 측정에 국한 되지 않습니다.
서론
5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) 없이 세포에서 RNA 생산의 연구 또는 매우 제한 된 효과에 짧은 기간1,2라벨 동안 생리학 세포. 메서드는 안티-BrU 항 체 (그림 1)를 사용 하 여 이라는 RNA의 IP에 의해 새로 합성된 RNA로 부 순 뒤 합성 uridine 파생의 기반으로 합니다.
수십 년간 그 단백질 합성은 transcriptionally 통제 될 수 있다, 그리고 녹음 방송 요인의 존재는 이상의 50 년 전 가설 되었다 알려져 있다3. 오늘, 그것은 여러 가지 질병은 전사 및 RNA 안정성의 dysregulation에 의해 발생 알려져 (참조4보충 그림 S1), RNA 생산에 변화를 측정 하는 능력은 이해 질병에 매우 중요 하 고 개발입니다.
다른 한편으로, RNA 생산 규제 도구 너무 적은 또는 너무 많은 단백질 식 또는 파 킨 슨 병 (PD)에 같은 단백질 축적으로 인 한 질병 치료를 ....
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프로토콜
참고: 달리 명시 되지 않은 실 온에서 모든 단계를 수행 하 고 얼음 이나 냉장고 (를 제외 하 고는 차입에서 SDS를 포함 하는 버퍼) 버퍼를 유지. 프로토콜 5 섹션으로 나뉘어져: 준비의 RNA 샘플; ip; 구슬의 준비 구슬;에 RNA BrU 표시의 바인딩 차입 및 3 단계 페 놀-페 놀/클로 프롬-클로 프롬 추출;에 의해 바운드 BrU 셔 서 RNA의 정화 (실시간 정량 Pcr를 사용 하 여이 예제)에서 RNA의 분석
1입니다. RNA 샘플의 준비
- 자동화 된 셀을 사용 하 여 카운트 HEK293T 셀 카운터와 10 mL 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 보충 10% 태아 종 아리 혈 청 및 50 µ g/mL 페니실린/스)에서 10 cm 배양 접시에서 3,500,000 셀의 합계를 씨앗 > 40 µ g RNA 따라 추출 48 h 후. 37 ° C, 5% CO2세포를 유지 합니다.
- 시드, 후 48 h 8 mL 성장 매체를 발음 하 고 셀 밖으로 건조를 피하기 위해 2 mL를 남겨두고. 2mm BrU를 추가 하 고 모든 치료 8 mL를 발음 하는 성장 매체, 그리고 8 mL BrU 포함 성장 매체를 다시 적용 하기 전에 셀에서 잔여 2 mL를 제거. 이 유전자 발현에 변화....
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결과
BrU 라벨 시간의 초기 테스트 AsPC-1 셀에서 수행 했다. 셀 0, 1, 2, 및 4.5 h, 총 RNA 추출 및 BrU IP BrU로 치료 했다. GAS5와 GAPDH는 충분 한 약 9-및 44 배 변경에 비해 배경 (0 h) GAPDH와 GAS5, 각각을 도달 하는 1 h 라벨 BrU IP RNA에서 측정 되었다.
BrU IP 및 위에서 설명한 분석 변경 사항을 발견 하는 경우를 조사 하는 데 사용 했다 (PLK-2) 폴로-같은 키 2에 α-synuclein mRNA의 정상 상태 수준에서 억제 mRNA 합성1에 변화에 의해 발생 했다. 1 h 라벨 시간이 배경 (그림 2)에 비해 충분 한 라벨을 제공 하 고 또한 영향을가지고 처리 시간을 허용 하기 때문에 선택.......
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토론
이 프로토콜 RNA 생산 새로 라벨의 결정 BrU, 즉각적인 RNA 추출 및 BrU 셔 서 RNA의 immunoprecipitation와 1 시간에 대 한 RNA를 생산을 위한 BrU IP의 사용을 설명 합니다. 이 메서드는 참조16에서 설명한 하 고이 문서를 페 놀-클로 프롬 정화 단계 BrU의 낮은 농도와 미리 치료 구슬 IP 특이성 및 RNA 순도 증가 몇 가지 추가 단계를 포함 IP 다음 RNA 순도 증가. 또한, 우리는 또한 여기 BrU IP의 특이성 BrU와 비 BrU에서 캡처한 RNA를 비교 하 여 보여주는 데이터 제시 세포 치료. 페 놀-클로 프롬 정화 저렴 한, 하지만 부 순으로 표시 하는 RNA의 낮은 금액을 고려 하면 다운스트림 분석에서 증가 신호 대신 RNA 청소 키트를 사용 하 여 가져올 수 있습니다. 그러나 우리의 경험, 이다, 샘플에서 RNA의 가장 동등한 추출 페 놀-클로 프롬 정화를 사용 하 여 얻어진 다.
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
Lundbeck 재단 아후 스 대학, Dandrite와 Lundbeck a/S 지원이 작품.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Ribolock Rnase 억제제 | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse 항체 | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | 자외선 가시광선 분광광도법 | |
| 수성 포화 페놀 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| 페놀:클로로포름:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| 고순도 RNA 분리 키트 | Roche | 11828665001 | |
| 고용량 cDNA 역전사 키트 | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR 마스터 믹스 |
| Taqman RNA 프로브 | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| 태아 송아지 혈청 | Biochrom | S0115 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Biochrom | A2213 | |
| 행크 버퍼 | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 및 136.8 mM NaCl pH 6.77, 오토클레이브. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% 디에틸피로카보네이트 처리된 H2O | ||
| 2xBrU-IP 버퍼 | DEPC의 pH 7.5 및 500mM NaCl H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse 억제제 | 2xBrU-IP 버퍼 1 μ 지/&무; L BSA 및 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL 헤파린 | 2xBrU-IP 완충액, 1:1 DEPC-H2O 희석 및 1mg/mL 헤파린 | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP 완충액 보충, DEPC-H2O에서 1:1 희석 및 0.5 &mu 보충; 지/&무; L BSA 및 20 U/mL Ribolock | ||
| 용리 완충액 | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
참고문헌
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA sta....
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재인쇄 및 허가
