방법 논문

Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

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⸱

DOI:

10.3791/57061

⸱

2017년 12월 9일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

이 논문에서

요약

유전자 코드 확장 acetylation 단백질을 포함 한 생물 학적 과정의 넓은 범위를 공부 하는 강력한 도구 역할을 합니다. 여기 균질 생성 하기 위한이 기술을 악용 하는 손쉬운 프로토콜 acetylated 단백질 대장균 세포에 특정 사이트에 설명 합니다.

초록

포스트 번역 상 수정 단백질의 특정 위치에서 발생 하는 다양 한 세포질 프로세스에서에서 중요 한 역할을 보여왔다. 그 중, 가역 lysine acetylation 생활의 모든 영역에서 가장 넓게 분배 된 중 하나입니다. 수많은 acetylome 질량 분석 기반 연구를 수행 하는 있지만 더이 상 상속 acetylation 대상의 제한 되었습니다. 가능한 이유 하나 대부분 클래식 생 화 확 적인 방법에 의해 원하는 위치에 순전히 acetylated 단백질을 생성 하기 어렵습니다. 이 문제를 해결 하려면 유전자 코드 확장 기술 cotranslational 설립을 직접 설계 pyrrolysyl-tRNA 합성 변종, Methanosarcinaceae 종에서 그것의 동족 tRNA의 쌍을 사용 하 여 적용 된 관심사의 단백질에 특정 사이트에 acetyllysine의. Histone acetylation의 연구에서 첫 번째 응용 프로그램, 후이 이렇게 다양 한 단백질에 acetylation 연구 촉진 했다. 이 작품에서는, 우리는 호스트 모델 박테리아 대장균 을 사용 하 여 site-specifically acetylated 단백질을 생산 하는 손쉬운 프로토콜을 증명 하고있다. Malate 효소는이 작품에서 데모 예제로 사용 되었습니다.

서론

포스트 번역 상 수정 (PTMs) 단백질의 번역 과정 후 발생 하 고 공유 추가 기능 그룹에서 발생 하는 아미노산 잔류물, 유전자를 포함 하 여 거의 모든 생물 학적 과정에 중요 한 역할을 재생을 전사, 스트레스 반응, 세포 분화, 및 물질 대사1,2,3 날짜 하려면, 약 400 독특한 PTMs 확인된4되었습니다. 게놈과는 프로테옴의 intricacy는 단백질 PTMs로 대부분 증폭 단백질 활동 및 지역화, 고 단백질, 핵 산, 지질, 및 공동 인자5등 다른 분자와 상호 작용에 영향을 미칠.

단백질 acetylation 지난 2 년간6,7,,89,10,11,12PTMs 연구의 최전선에 왔다. Lysine acetylation 처음 발견 되었다 히스톤에 이상의 50 년 전13,14은 잘 조사 되어, 80 개 이상의 녹음 방송 요인, 레 귤 레이 터, 및 다양 한 단백질15에 알려져 있다 16,17. 단백질 acetylation에 대 한 연구 뿐만 아니라, 규제 메커니즘의 깊은 이해를 제공 하지만 다양 한 역 기능 acetylation18,19, 로 인 한 질병에 대 한 치료 가이드 20 , 21 , 22 , 23. lysine acetylation 진핵생물에서 발생 하지만 최근 연구는 단백질 acetylation 또한 세균 생리학, chemotaxis, 내 산 성, 활성화 및 안정화를 포함 하 여 주요 역할 재생 믿어 pathogenicity 섬과 다른 독성 단백질24,25,26,27,,2829관련.

Lysine acetylation 화학적 특성을 일반적으로 사용 되는 방법은 사이트 지시 된 mutagenesis 사용 하는. 글루타민은 비슷한 크기와 극성 때문에 acetyllysine의 모방으로 사용 됩니다. 아르기닌은 생리 적인 조건 하에서 그것의 긍정적인 요금을 유지 하지만 acetylated 수 없습니다 비 acetylated lysine 모방으로 활용 됩니다. 그러나, 두 모방 하지 진짜 isosteres 이며 항상 예상된 결과30를 생성 하지 않습니다. 가장 엄격한 접근은 어렵거나 lysine acetylation 자연7,11의 낮은 산출할 인해 가장 고전적인 방법에 대 한 특정 리 진 잔류물에 균질 acetylated 단백질을 생성 하는 것입니다. 이 문제는 설계 pyrrolysyl-tRNA 합성을 사용 하 여 유전자 코드 확장 전략에 의해 unraveled 되었습니다 tRNA 충전 Methanosarcinaceae 종에서 벗어나 acetyllysine와Pyl 활용 호스트 변환 기계는 UAG를 억제 하는 mRNA에 codon를 중지 하 고 대상 단백질31의 설계 위치에 acetyllysine의 지휘. 최근에, 우리는 향상 된 EF-부 엉-바인딩 tRNA32 와 업그레이드 된 acetyllysyl-tRNA 합성33이 시스템을 최적화 했습니다. 또한, 우리는 malate 효소34 와 tyrosyl-tRNA 합성35의 acetylation 연구에서이 향상 된 통합 시스템을 적용 했습니다. 여기, 우리가 우리가 광범위 하 게 실증 사례로 공부 malate 효소 (MDH)를 사용 하 여 생화학 식별 분자 클로닝에서 순전히 acetylated 단백질을 생성 하기 위한 프로토콜을 보여 줍니다.

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프로토콜

1. 사이트 감독 Mutagenesis 대상 유전자의

참고: MDH T7 발기인 CloDF13 원본 및 복사본 수가 20 ~ 4034 pCDF 1 벡터에서 아래 표시 됩니다.

  1. 뇌관에 의해 유전자에 140 위치에서 황색 정지 codon를 소개 (뇌관을 앞으로: GGTGTTTATGAC태그AACAAACTGTTCGGCG 및 뇌관을 역방향: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC)의 사이트 지시 된 mutagenesis 키트 명령 다음.
  2. 야생-타입 malate dehydratase의 유전자를 포함 하는 템플릿 플라스 미드를 증폭 하 고 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 반응에 의해 정지 codon 돌연변이 삽입 합니다. 반응 혼합물에서 포함 2 X DNA 중 합 효소 효소 혼합의 12.5 µ L, 10 µ M 앞으로 뇌관, 10 µ M 역 뇌관의 1.25 µ L, 템플릿 DNA의 1 µ L의 1.25 µ L (20 ng / µ L) (pCDF 1 플라스 미드의 야생-타입 MDH 유전자를 포함), 그리고 9 µ L nuclease 무료 물.
    1. PCR 반응 매개 변수를 사용 하 여 다음과 같습니다: 30 98 ° C에 변성을 초기 s; 10의 25 주기 98 ° C, 30에서 s s 55 ° C, 및 72 ° C에서 3 분에서 3 분 동안 72 ° C에서 최종 확장. PCR, 후 circularization 및 서식 파일 제거에 대 한 실 온에서 1 h 킷에서 증폭 된 자료 니 리가 DpnI 효소 혼합에 직접 추가 합니다.
      참고: 반응 혼합물의 PCR 제품, 반응 버퍼 X 2의 5 µ L, 10 X 키-리가-DpnI 효소 혼합, 1 µ L nuclease 무료 물 3 µ L 1 µ L를 포함합니다.
  3. 5 µ L 25 µ L의 튜브에 반응 혼합의 유능한 대장균 해 동 추가 키트에서 DH5α 셀. 신중 하 게 혼합, 튜브를 터치 하 고 30 분 열 충격 30 s, 및 추가 5 분 동안 얼음에 42 ° C에 혼합물에 대 한 얼음에 혼합물을 놓습니다.
    1. 혼합물으로 실내 온도 Catabolite 억압 (SOC) 미디어 키트에서와 함께 슈퍼 최적의 국물의 600 µ L를 플라스틱, 250rpm에서 떨고 함께 60 분 동안 37 ° C에서 품 어, 해당 항생제와 lysogeny (파운드)의 국물 한 접시에 100 µ L를 확산 그리고 250 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 밤새 품 어.
  4. 6 mL 신선한 파운드 미디어 해당 항생제로 4-6 한 식민지를 선택 하 고 250 rpm에서 떨고와 하룻밤 37 ° C에서 품 어. 다음 제조 업체의 설명서, 다음 올바른 위치에 정지 codon 돌연변이 확인 하는 서비스 공급자의 프로토콜에 따라 DNA 연속을 위한 송신 플라스 미드 플라스 미드 정화 키트에 의해 각 숙박 문화에서 플라스 미드를 추출 합니다.
  5. 1 mL 하룻밤 문화와 300 µ L 100 %DMSO 혼합 하 여 스트레인-80 ° C에서 올바른 시퀀스를 저장 합니다.

2입니다. 표현의 Acetylated 단백질

  1. 최적화 된 acetyllysyl-tRNA 합성33 의 유전자를 삽입 하 고 최적화 된 tRNAPyl 32 pTech 플라스 미드로. 제정 lpp 발기인에서 tRNA 합성 유전자를 놓습니다. 제정 proK 발기인34에서 tRNA 유전자를 놓습니다.
    1. 공동 변환 식 벡터34 malate 효소의 돌연변이 태그 포함 된 유전자를 포함 하 고 최적화 된 acetyllysine 설립 시스템을 은닉 하는 플라스 미드 25 µ L로 해 동된 유능한 대장균 BL21(DE3) 세포에 의해 10 s, 및 추가 5 분 동안 얼음에 42 ° C에서 열 충격.
    2. 혼합물으로 실내 온도 SOC 미디어의 600 µ L를 플라스틱, 275 rpm 동요와 함께 60 분 동안 37 ° C에서 품 어, 100 µ g/mL 스와 50 µ g/mL 페니, 한 접시에 100 µ L를 확산 그리고 275 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 밤새 품 어.
  2. 접시에서 단 하나 식민지를 선택 하 고 15 mL 신선한 파운드 미디어 100 µ g/mL 스와 250 rpm의 속도로 흔들어 하룻밤 37 ° C에서 50 mL 튜브에 50 µ g/mL 페니로 예방. 1 L 플라스 크에 항생제와 300 mL 신선한 파운드 미디어 15 mL 숙박 문화를 전송 하 고 250 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.
  3. Acetyllysine 100 m m 재고 솔루션, 4 ° c.에 저장 물으로 분해 흡 광도 600 0.5에 도달 하는 때 성장 매체를 5mm acetyllysine 및 20mm 니코틴 (deacetylases의 억제제)를 추가 nm.
    1. 37 ° c, 250 rpm에서 떨고 추가 1 시간에 대 한 세포 성장 다음 0.5 m m IPTG 단백질 표정, 추가 하 고 180 rpm에서 떨고, 25 ° C에서 세포 성장.
      참고: 식 조건이 다른 단백질에 대 한 최적화를 할 수 있습니다.
  4. 15 분 동안 4 ° C에서 3000 x g에서 centrifuging 여 세포를 수집 하 고 상쾌한, 삭제 셀 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 버퍼 (10 m m 나2HPO4, 1.8 m m KH2포4, 137 m m NaCl, 2.7 m m KCl)와 펠 릿을 세척. 5 분 동안 4 ° C에서 10000 x g에서 씻어 세포를 수집, 상쾌한, 삭제 및 셀 알 약-80 ° c.에 저장

3입니다. Acetylated 단백질의 정화

  1. 얼음, 냉동된 셀 펠 릿을 녹여 그리고 다시 (50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 7.8, 300 mM NaCl, 20mm 이미, 그리고 20mm 니코틴아미드), 세포의 용 해 버퍼의 15 mL와 β-mercaptoethanol와 1 µ L Benzonase nuclease (250 대)의 5 µ L 일시 중단.
  2. 40 kHz 쥡니다 70% 파워 10 사이클 간격 30 다음 10 s 짧은 파열의 출력에 의해 세포를 휴식 양식 원유 추출에 대 한 s. 4 ° c.에 25 분 20000 x g에서 원심 분리기 원유 추출 상쾌한 0.45 μ 막 필터를 필터링 하 고 니켈 nitrilotriacetic 산 (Ni-NTA) 수 지 물과 세포의 용 해 버퍼의 20 mL 20 mL와 equilibrated의 1 mL를 포함 하는 열에 로드 합니다.
    참고: 쥡니다 사용할 수 없는 경우에 셀 온화한 세제에 의해 깨진 수 있습니다.
  3. 20 mL (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM NaCl, 50mm 이미, 및 20 m m 니코틴아미드) 워시 버퍼의 열 세척 하 고의 차입 버퍼 (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM NaCl, 150mm 이미, 및 20 m m 니코틴아미드) 2 mL와 함께 elute.
  4. 제조업체의 설명서에 따라 PD-10 열 버퍼 (25mm Tris pH 7.8와 10 mM NaCl) 담와 차입 분수 desalt. Bradford 단백질 분석 실험 시 약의 지시에 따라 eluted 단백질의 농도 측정 합니다. Desalted 단백질은 추가 실험을 위한 준비 이다.
    참고: 단백질의 50% 글리세롤 재고 확인 하 고 저장을 위한-80 ° C에서 유지.

4. 생 화 확 적인 특성 Acetylated 단백질의

  1. SDS 페이지 및 질량 분석 분석입니다.
    1. 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 샘플 버퍼 (SDS 샘플 버퍼 X 2 µ L 4와 5 µ L 단백질 견본) 5 분 동안 105 ° C에서 2 mL 튜브와 단백질 변성, 2000 x g 10에서 혼합물을 원심 s, 4-20% 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 electroph에 로드 oresis (SDS-PAGE) 젤, 고 200 V 30 분 실행 합니다.
    2. 증류수와 젤을 세척 하 고 3 번 과정을 반복 5 분 동안 부드럽게 흔들어. 물, 삭제 하 고 젤 부드러운 동요와 1 h Coomassie 파란 얼룩과 얼룩. 증류수와 젤 드 얼룩, 30 분, 그리고 반복이 드 3 번 얼룩에 부드럽게 흔들어.
    3. Coomassie 파란 얼룩이 SDS 페이지 젤에 33 kDa에 밴드를 잘라내어 질량 분석 시설 또는 회사는 acetyllysine 디자인 된 위치에서 통합 되었다 확인 하.
      참고: 질량 분석 분석의 프로토콜은 이전 실험34을 따 랐 다.
  2. 서 부 럽
    1. 4.1 단계에서 동일한 프로토콜 SDS 페이지 젤을 실행 합니다. 실행 젤, 후 15 분에 대 한 전송 버퍼 (25mm Tris, 192 m m 글리신, pH 8.3 및 20% 메탄올) 젤을 담근 다.
    2. 0.2 µ m, 1 분에 대 한 메탄올을 가진 7 cm x 8.5 c m polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 활성화 되 고 전송 샌드위치를 준비 하기 전에 전송 버퍼와 린스.
      참고: 메탄올은 피부 접촉, 눈 접촉, 섭취, 또는 흡입 위험. 심한 노출은 죽음에 발생할 수 있습니다.
    3. 음극에서 양극 (스폰지 필터 종이, SDS 페이지 젤, PVDF 막, 필터 종이, 스폰지)에 전송 샌드위치를 확인 합니다. 스택의 350의 정 전류에서 실행 전송 탱크에 넣어 45 분 mA.
      참고: 전송 시간 최적화를 할 수 있습니다.
    4. 씻어 25 mL Tris 버퍼 식 염 수, 0.1 %PVDF 막 트윈 20 (TBST) (137 m m NaCl, 20 mM Tris, 0.1% 트윈 20, pH 7.6) 부드러운 떨고와 5 분에 대 한 버퍼. 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 실 온에서 1 h TBST 버퍼에서와 막을 차단 합니다.
    5. HRP 활용 된 acetyllysine-항 체로 부드러운 떨고와 하룻밤 4 ° C에서 5% BSA TBST에 희석 1 µ g/mL의 최종 농도와 막 품 어.
      참고: 빠른 결과 위해 1 시간 실 온에서이 단계를 수행 수 있습니다. 항 체의 희석 최적화를 할 수 있습니다.
    6. 부드러운 진동으로 5 분 동안 20 mL TBST 버퍼와 막 씻어 4 번 단계를 반복. 제조업체의 지침에 따라 화학 기질 막에 적용 합니다. 와 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라 기반 영상 신호를 캡처.

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결과

야생-타입 MDH 그건 1 L 문화 당 31 mg acetylated MDH 단백질의 수익률 1 L 문화, 당 15 밀리 그램 이었다. 그림 1에서 보듯이 순화 된 단백질 SDS-PAGE로 분석 되었다. 야생-타입 MDH 긍정적인 제어34로 사용 되었다. 성장 매체에서 acetyllysine (AcK) 설립 시스템 및 돌연변이 mdh 유전자를 은닉 하는 세포에서 하지만 AcK 없이 순화 하는 단백질은 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다. 순화 된 단백질의 lysine acetylation 서쪽 더 럽 히를 사용 하 여 그림 2와 같이 acetyllysine 항 검색 되었습니다. Malate 효소에서 리 진 잔류물 140의 acetylation 탠덤 질량 분석 분석 그림 3<...

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토론

비정규 아미노산 (ncAAs)의 유전 결합 ncAA 청구 tRNA에 의해 할당 된 codon, 주로는 황색 정지 codon UAG36,37,38,39의 억제에 기반 해당 anticodon 포함 하. UAG codon 릴리스 요소-1 (RF1) 박테리아에 의해 인식 된다로 알려져 있다 그리고 그것은 또한 억제할 수 있습니다 의해 정식 아미노산 (cAAs)로 청구 하는 호스트에서 동족 tRNAs 근처 lysine과 티로신40,41등. 그래서, UAG codon에 ncAA 관 효율 ncAA 관 순도 경쟁 ncAA 충전 tRNAs 사이 동족 tRNAs 근처 cAA 청구에 의존 하는 동안 ncAA 충전 tR...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 NIH (AI119813), 아칸소 대학에서에서 시작 및 아칸소 생명과학 연구소에서 수상에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Bradford 단백질 분석Bio-Rad5000006단백질 농도
4x Laemmli 시료 완충액Bio-Rad1610747SDS 시료 완충액
Coomassie G-250 StainBio-Rad1610786SDS-PAGE 겔 염색
4-20% SDS-PAGE 레디 젤Bio-Rad4561093단백질 측정
Ac-K-100 (HRP Conjugate)Cell 신호6952항체
IPTGCHEM-IMPEX194발현 유도제
Nε -Acetyl-L-lysineCHEM-IMPEX5364비표준 아미노산
PD-10 탈염 컬럼GE Healthcare17085101탈염
Q5 부위 지정 돌연변이 유발 키트NEBE0554stop codon
BL21 (DE3) 세포NEBC2527발현 균주
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27106소개플라스미드
추출 Ni-NTA 수지QIAGEN30210친화성 정제 수지
니코틴아미드Sigma-AldrichN3376탈아세틸화효소 억제제
&베타;-메르캅토에탄올Sigma-AldrichM6250환원제
BugBuster 단백질 추출 시약Sigma-Aldrich70584파괴 세포
벤조나아제 nucleaseSigma-AldrichE1014DNase
ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher32106Chemiluminescence
Premixed LB BrothVWR97064세포 성장 배지
소 혈청 알부민VWR97061-416western blots blocking

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