기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.
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방법 논문
특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Microglia, 두뇌에 있는 면역 세포 염증 또는 중앙 신경 조직에 상해에 초 동 조치입니다. 최근 연구는 동적, 프로-염증 성 및 안티-염증 고기 가정 수 microglia를 밝혔다. 둘 다 (프로-염증 성) M1 및 M2 (프로) 고기 플레이 perinatal 뇌 손상 등 전시 다른 neuroinflammatory 조건에서 중요 한 역할은 특정 환경 자극에 대 한 응답에서 기능. Microglial 활성화의 변조는 따라서 microglia 뇌 손상에 치료 잠재력을 할 수 있습니다 제안 하는 neuroprotection 부여 하는 것 주의 되었다. 그러나, 더 많은 연구가 더 나은 microglia 질병에서의 역할을 이해 하는 데 필요한 이며이 프로토콜을 용이 하 게 한다. 프로토콜 아래에 설명 된 결합 밀도 그라데이션 원심 분리 과정에서 시험관 실험 없이 사용할 수 있는 기본 microglial 세포의 매우 순수한 샘플 생산 자력 분리와 세포 파편을 줄이기 위해는 2-3 주 배양에 대 한 필요 합니다. 또한, 특성화 단계 microglia, 분극의 우리의 이해를 더 나은 연구를 방 조 하 고 이러한 세포의 못쓰게는 재생 의학 분야에서 강한 영향에 대 한 강력한 기능 데이터를 얻을.
서론
염증, hypoxic 뇌 출혈에서 perinatal 기간 동안 손상 장기 sequelae의 배열을 가질 수 있습니다. Perinatal 뇌 손상의 복잡 한 이상 염증 그리고 이어지는 신경 및 axonal 죽음1허 혈 이론 이다. 타고 난 면역 반응 부상2로 이어지는 이벤트의 캐스케이드에 중요 한 역할을 한다.
Microglia, 중앙 신경 시스템 (CNS) 내 거주 면역 세포는 부상3초 동 조치. Microglia 용량4환경 보호 또는 독성, 종속을 가진 플라스틱 셀 종류가 있습니다. 그들은 chemotaxis, 식 균 작용, 항 원 프레 젠 테이 션 및 cytokines 및 반응성 산소 종4,5의 생산에서 포함 된다. 노화 microglia 끊임없이 환경을 조사 하 고4외국 또는 유해한 물질 존재에 의해 활성화 됩니다. 활성화는 CNS 보호4중요 한 프로 염증 반응을 이끌어 낸다. 이....
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프로토콜
다음 절차는 모나 쉬 대학에서 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 건강 한 치료 신생아 C57Bl6/J P3-6 쥐 대표적인 결과 생성 하기 위해 사용 되었다.
1. 효소 소화
참고: 그것은 무 균 분리 하 고 1 차 셀을 경작 하는 경우를 고려 하는 것이 중요입니다. 확보 가능한 무 균입니다, 반면 초기 해 부와 murine 두뇌의 수확 완료할 수 있습니다 laminal 흐름 후드, 외부 층 류 후드 내에서 수행 하는 이후의 모든 단계.
- 불 임 악기를 사용 하 여, 자 궁 경부 전위에 의해 마우스를 안락사, 동물을 목을 벨 고 100% 에탄올으로 씻어. 메 마른 작은 위를 사용 하 여, 머리의 오른쪽과 왼쪽 측면을 따라 작은 절 개를 확인 합니다. 이 나이에 피부 껍질 떨어져 쉽게. Bregma 포함 두개골 노출 연단 쪽으로 조직을 밀어 부드럽게 곡선된 겸 자의 팁을 사용 하 여.
- 척추 운하의 개통에가 위 끝을 삽입 하 고 외가도에 측면 절 개를 만들기. 부드럽게 위쪽으로 손상을 방지 하기 위해 두뇌가 위 끝을 가리키는 Bregma에 화살 봉합을 따라 절 개를 확인 합니다. Bregma에가 위 팁을 삽입 하 고 코로나 봉합 따라 머리의 오른쪽과 왼쪽....
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결과
여기에 설명 된 방법을 사용 하 여, microglia의 순수한 인구 고립 될 수 있다 하 고 생체 외에서 및 FACS 분석을 사용 하 여 특성에 대 한 준비가 될 수 있습니다. 로 시작 되기 위하여는, 18 동물까지 사용할 수 있습니다 약 450000 600000 microglial 셀의 예상된 수확량을 가진 추려 당. 먼저 격리 된 세포의 순도 확인 하는 중요 한 및 FACS 분석 두 마커 CD45 및 CD11b. microglia 신분증에 대 한 얼룩에 의해 수행 됐다 할 수 증명 귀찮은, 많은 마커 microglia 표현으로 표현 됩니다. 대 식 세포, 그리고이 두 개의 마커를 사용 하 여 정확 하 고 신뢰할 수 있는 정량화를 허용 한다. 특히, microglia CD45, CNS와 주변 세포에서 높은 식에 비해 낮은 표현의 있으며 또한 CD11b에 대 한 긍정적인 (그림 1). 이 특정 격리에.......
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토론
Microglia 환경 자극에 의해 변경 둘 다 프로 및 안티-염증, 기능이 있다. 이전 연구 microglia 활성화의 변조 neuroprotection 부여 수 있습니다 나타났습니다. 뉴런을 보호 하 고 부상을 복구 하는 능력은 이러한 복잡 한 세포의 현재 이해를 심화 하기 위해 더 많은 연구를 필요로 합니다. 따라서, 절연 고 순도 기본 microglia의 중요 하 고 유용한 기술입니다. 이것은 높은 순수 기본 microglia 2 일 이내 생체 외에서 실험에 대 한 준비를 얻기에 상대적으로 빠른 방법입니다.
다양 한 기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 문학에 설명 된 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 주요 도전은 효율적으로 충분 한 샘플, 생존에 순도 높은 생산 이다. 이 프로토콜의 주요 이점은 문화에 시간에 대 한 필요 없이 매우 순수한 샘플의 수익률 이다. 따라서, 메서드는 2 주에서 2 일 단축, 빠른 결과 용이 하 게이. 특.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM, 저포도당, 피루브산 | Gibco | 11885084 | |
| 항생제-항진균제(100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI 등급 II, 파 | Sigma-Aldrich | ||
| Papain, 완충 용액 | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| 소 태아 혈청, 적격, 열 비활성화 | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep 자석 변형 |
| EasySep 자석 | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep 버퍼 | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL 라운드 바텀 하이 클리리티 PP 테스트 튜브, 스냅 캡 포함, 멸균 | 코닝 | 352063 | |
| 175cm² 벤트 캡이 있는 각진 목 세포 배양 플라스크 | Corning | 431080 | |
| 대장균의 지질다당류 O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96웰 TC 처리 마이크로플레이트 크기 96웰, 투명, 폴리스티렌, 둥근 바닥 | Corning | CLS3799 | |
| 파라포름알데히드(분말, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | 시그마-알드리치 | X100 | |
| 래빗 안티-IBA1 | 와코 | 01919741 | |
| 염소 안티 토끼 IgG H& | Abcam | ab150077 | |
| FACS 항체 | Company | 카탈로그 번호 | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
참고문헌
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110(2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K.
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