특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

Summary

기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.

Abstract

Microglia, 두뇌에 있는 면역 세포 염증 또는 중앙 신경 조직에 상해에 초 동 조치입니다. 최근 연구는 동적, 프로-염증 성 및 안티-염증 고기 가정 수 microglia를 밝혔다. 둘 다 (프로-염증 성) M1 및 M2 (프로) 고기 플레이 perinatal 뇌 손상 등 전시 다른 neuroinflammatory 조건에서 중요 한 역할은 특정 환경 자극에 대 한 응답에서 기능. Microglial 활성화의 변조는 따라서 microglia 뇌 손상에 치료 잠재력을 할 수 있습니다 제안 하는 neuroprotection 부여 하는 것 주의 되었다. 그러나, 더 많은 연구가 더 나은 microglia 질병에서의 역할을 이해 하는 데 필요한 이며이 프로토콜을 용이 하 게 한다. 프로토콜 아래에 설명 된 결합 밀도 그라데이션 원심 분리 과정에서 시험관 실험 없이 사용할 수 있는 기본 microglial 세포의 매우 순수한 샘플 생산 자력 분리와 세포 파편을 줄이기 위해는 2-3 주 배양에 대 한 필요 합니다. 또한, 특성화 단계 microglia, 분극의 우리의 이해를 더 나은 연구를 방 조 하 고 이러한 세포의 못쓰게는 재생 의학 분야에서 강한 영향에 대 한 강력한 기능 데이터를 얻을.

Introduction

염증, hypoxic 뇌 출혈에서 perinatal 기간 동안 손상 장기 sequelae의 배열을 가질 수 있습니다. Perinatal 뇌 손상의 복잡 한 이상 염증 그리고 이어지는 신경 및 axonal 죽음¹허 혈 이론 이다. 타고 난 면역 반응 부상²로 이어지는 이벤트의 캐스케이드에 중요 한 역할을 한다.

Microglia, 중앙 신경 시스템 (CNS) 내 거주 면역 세포는 부상³초 동 조치. Microglia 용량⁴환경 보호 또는 독성, 종속을 가진 플라스틱 셀 종류가 있습니다. 그들은 chemotaxis, 식 균 작용, 항 원 프레 젠 테이 션 및 cytokines 및 반응성 산소 종^4,5의 생산에서 포함 된다. 노화 microglia 끊임없이 환경을 조사 하 고⁴외국 또는 유해한 물질 존재에 의해 활성화 됩니다. 활성화는 CNS 보호⁴중요 한 프로 염증 반응을 이끌어 낸다. 이....

Protocol

다음 절차는 모나 쉬 대학에서 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 건강 한 치료 신생아 C57Bl6/J P3-6 쥐 대표적인 결과 생성 하기 위해 사용 되었다.

1. 효소 소화

참고: 그것은 무 균 분리 하 고 1 차 셀을 경작 하는 경우를 고려 하는 것이 중요입니다. 확보 가능한 무 균입니다, 반면 초기 해 부와 murine 두뇌의 수확 완료할 수 있습니다 laminal 흐름 후드, 외부 층 류 후드 내에서 수행 하는 이후의 모든 단계.

1. 불 임 악기를 사용 하 여, 자 궁 경부 전위에 의해 마우스를 안락사, 동물을 목을 벨 고 100% 에탄올으로 씻어. 메 마른 작은 위를 사용 하 여, 머리의 오른쪽과 왼쪽 측면을 따라 작은 절 개를 확인 합니다. 이 나이에 피부 껍질 떨어져 쉽게. Bregma 포함 두개골 노출 연단 쪽으로 조직을 밀어 부드럽게 곡선된 겸 자의 팁을 사용 하 여.
2. 척추 운하의 개통에가 위 끝을 삽입 하 고 외가도에 측면 절 개를 만들기. 부드럽게 위쪽으로 손상을 방지 하기 위해 두뇌가 위 끝을 가리키는 Bregma에 화살 봉합을 따라 절 개를 확인 합니다. Bregma에가 위 팁을 삽입 하 고 코로나 봉합 따라 머리의 오른쪽과 왼쪽....

Results

여기에 설명 된 방법을 사용 하 여, microglia의 순수한 인구 고립 될 수 있다 하 고 생체 외에서 및 FACS 분석을 사용 하 여 특성에 대 한 준비가 될 수 있습니다. 로 시작 되기 위하여는, 18 동물까지 사용할 수 있습니다 약 450000 600000 microglial 셀의 예상된 수확량을 가진 추려 당. 먼저 격리 된 세포의 순도 확인 하는 중요 한 및 FACS 분석 두 마커 CD45 및 CD11b. microglia 신분증에 대 한 얼룩에 의해 수행 됐다 할 수 증명 귀찮은, 많은 마커 microglia 표현으로 표현 됩니다. 대 식 세포, 그리고이 두 개의 마커를 사용 하 여 정확 하 고 신뢰할 수 있는 정량화를 허용 한다. 특히, microglia CD45, CNS와 주변 세포에서 높은 식에 비해 낮은 표현의 있으며 또한 CD11b에 대 한 긍정적인 (그림 1). 이 특정 격리에.......

Discussion

Microglia 환경 자극에 의해 변경 둘 다 프로 및 안티-염증, 기능이 있다. 이전 연구 microglia 활성화의 변조 neuroprotection 부여 수 있습니다 나타났습니다. 뉴런을 보호 하 고 부상을 복구 하는 능력은 이러한 복잡 한 세포의 현재 이해를 심화 하기 위해 더 많은 연구를 필요로 합니다. 따라서, 절연 고 순도 기본 microglia의 중요 하 고 유용한 기술입니다. 이것은 높은 순수 기본 microglia 2 일 이내 생체 외에서 실험에 대 한 준비를 얻기에 상대적으로 빠른 방법입니다.

다양 한 기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 문학에 설명 된 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 주요 도전은 효율적으로 충분 한 샘플, 생존에 순도 높은 생산 이다. 이 프로토콜의 주요 이점은 문화에 시간에 대 한 필요 없이 매우 순수한 샘플의 수익률 이다. 따라서, 메서드는 2 주에서 2 일 단축, 빠른 결과 용이 하 게이. 특.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, 저포도당, 피루브산	Gibco	11885084
항생제-항진균제(100X)	Gibco	15240062
DNaseI 등급 II, 파		Sigma-Aldrich
Papain, 완충 용액	Sigma-Aldrich	P3125-100mg
소 태아 혈청, 적격, 열 비활성화	Gibco	16140071
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Hank's Balanced Salt Solution (1X)	Gibco	14175-103
Hank's Balanced Salt Solution (10X)	Gibco	14185052
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit	StemCell Technologies	18770	EasySep 자석 변형
EasySep 자석	StemCell Technologies	18000
EasySep 버퍼	StemCell Technologies	20144
Dulbecco's Phosphate buffered saline	Gibco	14040182
Trypsin (2.5%) (10X)	Gibco	15090-046
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD Biosciences	553141
Falcon 5mL 라운드 바텀 하이 클리리티 PP 테스트 튜브, 스냅 캡 포함, 멸균	코닝	352063
175cm² 벤트 캡이 있는 각진 목 세포 배양 플라스크	Corning	431080
대장균의 지질다당류 O127:B8	Sigma-Aldrich	L5024
96웰 TC 처리 마이크로플레이트 크기 96웰, 투명, 폴리스티렌, 둥근 바닥	Corning	CLS3799
파라포름알데히드(분말, 95%)	Sigma-Aldrich	158127
Triton-X	시그마-알드리치	X100
래빗 안티-IBA1	와코	01919741
염소 안티 토끼 IgG H&	Abcam	ab150077
FACS 항체	Company	카탈로그 번호
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO	BD Biosciences	560501
PerCP-Cy5.5 CD11b	eBiosciences	45-0112-82
ZombieNIR	Biolegend	423105
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate	Thermo Fisher Scientific	P35361
Annexin.V_FITC	Miltenyi Biotech	130-093-060
Propodium Iodide solution	Miltenyi Biotech	130-093-233