Zygotic 형광 복구 사진 표백 후 전체 기간 개발을 허용 하는 Chromatin 풀림에 대 한 분석

요약

Chromatin 설사 blastomeres의 발달 잠재력에 관련 된 것 처럼 보인다. 그러나, 그것은 알 수 없습니다 여부 chromatin 설사 배아에 대 한 발달 잠재력에 대 한 신뢰할 수 있는 인덱스로 사용할 수 있습니다. 여기, chromatin 설사 평가 zygotes 만기를 개발할 수 있는 실험 시스템 설명 하고있다.

초록

라이브 영상 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 최근, chromatin 풀림 또는 개방 만능 배아 줄기 세포의 세포질 감 별 법 잠재력에 포함 될 표시 되었습니다. 그것은 이전에 비해 알려졌다 배아 줄기 세포와 zygotes 항구 그들의 totipotency와의 연결을 제안 하는 매우 느슨하게 chromatin 구조를. 그러나, 지금까지 그것은 되지 해결 되었습니다이 매우 느슨하게/오픈 chromatin 구조 배아 발달 잠재력에 대 한 중요 한 인지. 현재 연구에서이 가설을 시험 하는 실험 시스템 형광에 의해 분석 된 어떤 zygotes 사진 표백 후 복구 기간 어떤 뜻깊은 손상도 없이 개발할 수 있는 개발 되었다. 중요 한 것은,이 실험적인 시스템만 보온병 플레이트 히터 confocal 레이저 스캐닝 현미경 이외에 필요 합니다. 이 연구의 결과 분석 (FRAP) 분석 사진 표백 zygotic chromatin에서 분자 이벤트 전체 기간 개발에 대 한 중요 한 인지 조사를 사용할 수 있는 후 그 형광 복구를 좋습니다.

서론

수정, 후 염색 질 구조를 동적으로 변경 하 고 zygotic 염색 질 구조는 다음 결국 설립된^1,2. 아버지 pronuclei에이 기간 동안 지배적인 chromatin 단백질 히스톤으로 protamine에서 변경 됩니다. 결과 chromatin sperms와 몇 가지 포인트 (예, 히스톤 변형 구성, 히스톤 수정) 여성 oocytes에서 매우 다르다. 따라서, 형성된 zygotic chromatin 이후의 배아 발달에 대 한 중요 한 것으로 생각 된다. 그러나, 오랜 기간 동안 zygotic chromatin 구조의 세부 정보를 공개 하는 노력에 불구 하 고 방법을 zygotes의 품질을 평가 하거나 1 셀 단계에서 그들의 전체-용어 개발의 염색 질 구조를 분석 하 여 예측 하는 적 설립.

이전 연구에서 그것은 발견을 zygotes 매우 느슨하게 chromatin 구조³. 현재, chromatin 풀림 또는 개방 세포 분화 배아 줄기 (ES) 세포⁴잠재력에 대 한 중요 한 요소가 될 여겨진다. ES 세포 자연, 동질성을 전시 하지 않습니....

프로토콜

이 연구는 관심과 야마나시 대학의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에서 권장 사항을 따라에서 수행 되었다. 프로토콜 야마나시 대학의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (허가 번호: A24-50). 모든 수술 tribromoethanol 마 취하에 수행 했다 하 고 고통을 최소화 하기 위해 모든 노력 했다. 절차 및 타임 테이블의 그림된 개요는 각각 그림 1 및 표 1에 표시 됩니다.

1. 메신저 RNA (eGFP H2B mRNA의체 외에서 전사)의 준비

1. 하지 의 30 U 템플릿 DNA pTOPO eGFP H2B^3,7 의 5 µ g을 선형화 나 37 ° C에서 50 µ L에서 하룻밤.
2. 전기 이동 법에 의해 완전히 소화 여부 확인에 대 한 소화 DNA의 1.5 µ L를 수집 합니다.
   1. 1.5 µ L와 소화 되지 않은 DNA 전기 이동 법 및 2 %agarose 젤의 우물에 염료를 각각, 로드의 3-5 µ L를 적용 합니다.
      참고: 완전히 소화, 단일 ....

결과

eGFP H2B zFRAP 분석

제대로 생산 mRNA eGFP-H2B, 미행 (그림 2A) 폴 리로 인 한 이동된 밴드 볼, 인코딩 수정 (그림 2B) 후 1-3 h 2 극 시체 zygotes의 세포질으로 주입 했다. 8 12 수정 후 h, 2 pronuclei eGFP H2B의 식을 보여주는 함께 zygotes 수집 하 고 zFRAP 분석 (그림 2C)를 받게 했다. 표백 및 복구 단계 FRAP 분석에 의하여 이루어져 있다. 미리 표백 단계에서 eGFP H2B의 신호 (그림 2D-1), 관찰 될 수 있었다 그러나 표백, 일단 .......

토론

이 연구에서 밝혀, zFRAP 분석 전체 용어 개발,이 방법은 분자 이벤트와 배아 발달 잠재력 사이 협회를 공개 하는 매우 유용한 도구 제안에 중요 한 손상을 발생 하지 않습니다. 그 세포의 차동 잠재력 된다 2 셀 단계 배아의 높은 ES 세포의 상태 처럼 2 셀으로 프로그래밍 하는 동안 chromatin 설사 변경으로 2 세포 단계 태아⁵와 비교 합니다. 따라서, zygotic chromatin 설사 배아 발달 잠재력에 대 한 중요 하다는 것이 가능 하다. 체세포 핵 oocytes 보여준 아버지 pronuclei 뿐만 아니라 모성 pronuclei, 체세포 핵 이식 zygotes에서 인수 오픈 chromatin의 부족은 제안에 비해 낮은 chromatin 풀림의 세포질으로 전송 그들의 빈약한 발달 잠재력에 참여. ZFRAP 분석 elucidating 게놈 메커니즘을 프로그래밍 하는 데 유용할 것으로 보인다.

ZFRAP 시스템 높은 발달.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	Olympus	FV1200	FV1000은 FRAP 분석에도 사용할 수 있습니다(참조 #7)열
판	Tokai Hit	TP-110RH26
도립 현미경	올림푸스	IX71
마이크로 매뉴필러	Narishige	MMO-202ND
Pieze 마이크로 마이크로 매니퓰레이터	프라임 테크	PMAS-CT150
35mm 배양 접시	Falcom	351008	35 x 100mm 스타일, IVF
60mm 배양 접시	Falcom	351007	60 x 15mm 스타일, 배아 배양
50mm 배양 접시	Falcom	351006	50 x 9mm 스타일, 무대 조작
50mm 유리 바닥 접시	Matsunami	D910400	50mm 접시, 27mm &phi, 구멍 크기, FRAP 분석 용
미네랄 오일	유기 spceiality 화학 물질	625071	유리 바닥 접시의 FRAP 분석용
미네랄 오일	Sigma	M8410-1L	IVF 및 배아 배양
유리 모세관	Drummond	1-000-1000	마우스 접합자 처리용
붕규산 유리	Prime tech	B100-75-10-PT	mRNA
Micropipett 풀러의 미세 주입용	셔터 기기	P-97/IVF	주입 준비 또는 홀딩 니들(외측 직경: 80 & 마이크로; m, 내경 : 10 & 마이크로; m)
마이크로포지	Narishige	MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 전사 키트	Thermo Fisher scientific	AM1340
폴리(A) 테일링 키트	Thermo Fisher scientific	AM1350
PVP 솔루션 10% (PVP-HTF)	IrvineSceientific	99311	HEPES 완충 HTF 함유 10%
PVP 나트륨 HEPES	시그마	H3784
eGFP-H2B mRNA용 pTOPO eGFP-H2B			템플릿 플라스미드 (참조 #6)
NorthernMax Gly 샘플 로딩 염료	Thermo Fisher scientific	AM8551	체외에서 전사된 mRNA의 전기영동을 위해
페놀 클로로포름 이자밀 알코올	nacalai tesque	25970-14
클로로포름	nacalai tesque	08401-65
Not I	TOYOBO	NOT-111X
Ethachinmate	WAKO	318-01793
3664 Otical 파워 미터	Hioki	3664	레이저 파워
입체 현미경	올림푸스	SZX16

용 파워 미터