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방법 논문

만성 통증 치료에 재조합 단백질의 개발

9.4K 조회수

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DOI:

10.3791/57071

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2018년 4월 11일

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이 논문에서

요약

이 문서에서 우리는 생산 방법과 IL4-10 재조합 융합 단백질의 품질 관리에 대 한 세부 정보를 제공합니다. 우리는 또한 마우스 모델 염증 성 통증의 고통을 해결 하기 위해이 단백질의 효과 테스트 하는 방법을 보여줍니다.

초록

만성 통증은 치료 하기 어려운 고 지속적인 통증을 해결 하기 위해 새로운 접근은 급하다. 항 염증 성 cytokines 탈 신경-면역 상호 작용을 규제 하는 그들의 능력 때문에 쇠 약하게 고통을 조건 치료를 위한 유망한 후보자 이다. 그러나, 그들은 다양 한 cytokines의 네트워크에서 작동 하는 순수 하 고 따라서 그들의 치료 효과가 독립 실행형 약물으로 사용 될 때 최적의 않을 수 있습니다. 이 제한을 극복 하기 위해 우리 IL4와 IL10 항 염증 성 cytokines의 융해 단백질을 개발 했다. 여기, 우리는 생산 및 IL4-10 재조합 융합 단백질의 품질 관리에 대 한 방법을 설명 하 고 우리 마우스 모델 지속적인 염증 성 통증의 고통을 해결 하기 위해 IL4-10 융해 단백질의 효과 테스트.

서론

만성 통증 중 가장 쇠 약하게 하 고 아래 취급 의료 문제는 21 세기의 유지에 영향을 미치는 > 성인 인구1,2의 20%. 그러나, 만성 통증에서 구호를 제공 하는 치료는 종종 효과적인 또는 심각한 부작용3때문에 중단 해야 합니다. 중요 한 것은, 현재 사용 가능한 약물만 징후 기복을 제공 하지만 하지 크게 수정 하거나 만성 통증 치료. 비록 만성 통증 신경 장애로 나타납니다, 증거의 만성 통증 개발4,5의 면역 체계의 참여를 제안 합니다. 또한, 통증 치료에 면역-기반 접근 등장 하고있다. 예를 들어 항 염증 성 cytokines 만성 통증6,,78의 여러 모델에 통증 억제. 그러나, 항 염증 성 cytokines 짧은 반감기, 그들의 잠재적인 통증 억제 효과 줄이고 있다. 또한, 항 염증 성 cytokines 서로 콘서트에서 가장 최적으로 작동합니다. 이러한 한계를 극복 ....

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프로토콜

모든 동물 실험 국제 지침 및 로컬 실험 윤리 위원회의 사전 승인을 수행 했다. 전 혈에는 대학 의료 센터 위트레흐트 (UMCU)는 네덜란드에서 미니 기증자 서비스 (미니 기증자 Dienst, MDD)에서 얻은 했다. MDD는 프로토콜 번호 07-125/c.에 대 한 UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie)의 의료 윤리 위원회에서 긍정적인 승인을 받았습니다.

1. 단백질 생산 및 특성화

  1. 세포 배양
    주: 문화 매체 사용에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
    1. 때까지 얼음의 작은 덩어리는 37 ° C에서 F HEK293 세포를 녹여. 얼음 처럼 차가운 매체 (4 ° C)의 10 mL를 즉시 해 동된 세포를 전송 하 고 x 500g에 4 분 (분) 동안 실 온 (RT)에서 세포 현 탁 액을 원심.
    2. 매체를 제거 하 고 10 mL 신선한 매체 RT, 뒤에 4 분 동안 500 x g에서 원심에서의에서 셀 펠 릿 resuspend.
    3. 상쾌한을 제거 하 고 미리 예 열된 매체 (37 ° C)의 25 mL를 포함 하는 125 mL 플라스 크에 직접 실시간 추가 셀 서 스 펜 션에서 매체의 5 ....

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결과

친화성 크로마토그래피 정화 하는 동안 얻은 다른 분수를 포함 하는 SDS 페이지 젤의 대표 그림 그림 1에 표시 됩니다. 로드 (L) (FT) 분수를 통해 흐름에, 모든 단백질 HEK293 상쾌한에 관찰 된다. 아무 단백질 세척 (W) 분수에서 관찰 됩니다. 차입 (E) 분수에서 35와 37 kDa의 두 밴드 IL4-10 융합 단백질 (화살표)의 두 개의 서로 다른 glycoforms를 해당 관찰 된다. 그림 1B, 전체 혈액의 대표적인 효능 분석 결과에서 두 개의 다른 IL4-10 퓨전 단백질 배치의 분석 결과 표시 됩니다. LPS 유발 TNFα 릴리스의 복용량 의존 저해, 두 IL4-10 퓨전 단백질 일괄 처리에 대 한 비교 bioactivity를 보여주는 관찰 됩니다.

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토론

이 원고는 생산과 재조합 IL4-10 융해 단백질의 특성에 대 한 방법 및 지속적인 염증 성 통증의 마우스 모델에서 염증 성 통 억제에 효능을 테스트 하는 방법을 설명 합니다. 생산과 IL4-10 융해 단백질의 정화는 작은 규모에서 수행 됩니다. 그들은 통해 간결한 식 시스템에서 얻을 수 없는 포스트 번역 상 수정 때문 HEK293 세포 단백질 생산을 위한 식 시스템으로 선택 됩니다. 포스트 번역 상 수정 단백질 기능에 대 한 관련 되며 이러한 수정이 없을 경우 잠재적으로 영향을 미칠 수 IL4-10 융해 단백질의 치료 효능. 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 표면에 뜨는 문화에서 정화입니다. 우리 자체 만든 단일 클론 항 체 IL4에 대 한 친 화력 정화 하지 선호도 태그 시스템으로 정화 수 있도록 태그를 포함 하는 IL4-10 융해 단백질을 생성 하 고 사용 하기로. 이것을 위한 이유의 단백질 폴딩과 기능에 태그 관련 변화 가능성을 방지 했다. 그럼에도 불구 하 고, 매우 선택적 단일 클론 항 체 부족 하다 면 태그와 단.......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품의 일부는 위트레흐트 대학 생명 과학에 의해 자금 하고있다 부여

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
FreeStyle 293-F 세포InvitrogenR790-07인간 배아 신장 세포 
GIBCO FreeStyle 293 Expression MediumLife 기술12338018Culture medium
293fectin 시약Invitrogen12347019Transfection 시약
GIBCO Opti-MEM + GlutaMAXLife 기술51985026양이온 지질 transfections 동안 사용하기 위한 감소된 세럼 Medium
GIBCO RPMI Medium 1640 (1x)Life technologies52400-025
CNBr-Activated Sepharose 4BGE Healthcare17-0430-01항체 또는 기타 대형 단백질을 결합하기 위한 사전 활성화 매체
염산 연기 37% Merck1003171000
염화나트륨시그마S7653-1kg
중탄산나트륨 Sigma31437
Trizma 염산염SigmaT3253-500GTRIS 염산염 
아세트산 100%                                                         머크1.00063.1000 
글리신-HCl                                                                               시그마G2879                         
PBS                                                                                                     약국, UMCU인산염 완충 식염수
10X TGSBIO-RAD161-0772SDS 전기 영동 용 Tris / Glycine / SDS 버퍼
Mini-PROTEAN TGX 겔BIO-RAD456-104612 % SDS 프리 캐스트 겔
Trans-Blot Turbo Transfer PackBIO-RAD170-4157Western Blot Transfer Pack
Yarra 3u SEC-2000 columnPhenomenex
InstantBlue 단백질 염색ExpedeonISB1L폴리아크릴아미드 겔용 Coomassie 단백질 염색
준비 완료 Human IL-10 DuoSet ELISAR& DDY217B
인간 TNF&알파; ELISA 세트다이아클론851570020
BCA 피어스 단백질 분석 키트ThermoFisher Scientific23227
카라기난시그마-알드리치22049식물 점막다당
CFA시그마-알드리치F5881백신 보조제
해밀턴 주사기시그마-알드리치20779유리 주사기
동물 인클로저IITC 생명과학433동물 울타리
폰 프레이 메시 스탠드IITC 생명과학410메시 스탠드
폰 프레이 헤어 Stoelting58011터치 테스트 감각 프로브
플랜타 테스트 (Hargreaves 방법)IITC 생명 과학390G플란타 테스트 가열 유리
동적 중량 베어링 테스트BiosebBIO-DWB-AUTO-M자세 결손 테스트
유리 Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cmBIO-RAD7371532유리 크로마토그래피 Column   
SnakeSkin 투석 튜브 Thermo Scientific88242
Minisart NML 주사기 필터 Sartorius16555-K일회용 필터 유닛, 0.45 μ M
CASY 세포 계수기 및 분석기Roche
류

참고문헌

  1. Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
  2. Gerdle, B., et al. Prevalence of widesp....

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