여기 선물이 쥐에서 심장 관련 유전자 조작에 대 한 프로토콜. 마 취, 마우스 마음 4 있는 공간을 통해 externalized 했다. 그 후, adenoviruses 인코딩 특정 유전자 단백질 식 측정 뒤에 vivo에서 이미징 및 서 부를 통해 심근에 주사기로 주입 했다 분석 오 점.
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방법 논문
Intramyocardial 쥐에 주입 하 여 심장 관련 유전자 조작 비보에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
유전자 조작에 특별히 크게 심장 질병 pathomechanisms 및 그들의 치료 잠재력 조사 약효. 심장 관련 유전자 배달 vivo에서 체계 또는 로컬 배달에 의해 일반적으로 이루어집니다. 꼬리 정 맥을 통해 조직의 주입은 간단 하 고 효율적인 재조합 형 adeno 관련 바이러스 9 (AAV9)를 사용 하 여 심장 유전자 발현 조작에. 그러나,이 메서드는 효율적인 변환에 대 한 벡터의 상대적으로 높은 금액을 요구 하며 nontarget 기관 유전자 변환에서 발생할 수 있습니다. 여기, 우리는 간단한, 효율적, 시간 절약 방법을 intramyocardial 사출의 비보에 심장 관련 유전자 조작 생쥐에 대 한 설명. (환기) 없이 마 취, 가슴 중요 하 고 작은 근육은 퉁 명 스럽게 해 부, 그리고 마우스 심장 4 있는 공간에 작은 절 개를 통해 수동 외부화에 의해 신속 하 게 노출 되었다. 그 후, 아 데 노 바이러스 인코딩 luciferase (루크)와 비타민 D 수용 체 (VDR), 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 대상으로 VDR, 심근에 해밀턴 주사기와 주입 했다. 후속 vivo에서 영상 시연 그 luciferase 성공적으로 특별히 마음에에서 overexpressed 했다. 또한, 서쪽 오 점 분석은 성공적인 overexpression 또는 마우스 마음에 VDR의 입을 확인 했다. 일단 마스터, 셀 또는 마우스 마음에 nanogels 같은 다른 물자의 주입으로 유전자 조작,이 기술을 사용할 수 있습니다.
서론
심장 질환은 병 적 상태와 사망률 전세계1,2의 주요 원인. 심근 경색, 심장 마비 등 생명이 심장 상태에 대 한 효과적인 치료 전략의 부족에는 기본 pathomechanisms의 집중 탐구와 새로운 치료 옵션3의 붐 빕니다. 이러한 과학적인 탐험에 대 한 심장 관련 유전자 조작 널리4,5입니다. 심장 유전자 조작과 강력한 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nuclease (TALEN)를 사용 하 여 편집 하는 게놈에 의해 달성 될 수 있다 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) / CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 도구, 또는 소성 유전 물질 (예, 바이러스 벡터 관심사의 단백질을 부호화 하는 유전자를 나르는)의 전달6. 게놈 편집과 살아있는 생쥐에서 정확 하 고 spatiotemporal 게놈 수정 허용, 그것은 여전히 시간과 노동 집약 연습6. 또는, 바이러스 벡터 또는 작은 간섭 RNA (siRNA) 복잡 한 납품은 정기적으로 심장 관련 유전자 조작 수행6.
바이러스 벡터 배달 성인 마우스 마음에 대략 두 가지 전략에 의해 달성 된다: 조직 또는 지방 주입. Cardiotropic serotype AAVs AAV9 등의 조직의 주입은 심장 특정 유전자 조작7에 대 한 비 침 투. 그러나,이 메서드는 효율적인 변환 및 유전자 발현에 필요한 벡터의 상대적으로 높은 금액을 요구 하며 근육과 간7같은 nontarget 기관의 중요 한 변환에서 발생할 수 있습니다. 로컬 바이러스 주입 intramyocardial 주입 또는 intracoronary 배달7에 의해 이루어집니다. Intracoronary 납품 intramyocardial 주입에 비해 심장 내에서 바이러스의 더 동등한 배급에 지도 한다. 그러나,이 기술의 불리는 전신 순환과 nontarget 기관8, 그리고 작업 중 압력 측정 장치의 그 요구에 변환에 바이러스 성 벡터의 밖으로 빠른 세척. 대조적으로, intramyocardial 주입 하면 심근으로 사이트 특정 배달, 하지만 그것은 더 나은 바이러스 유지 실패 균일 하 게 배포 바이러스 성 벡터7. 작은 동물에 대 한 intracoronary 납품은 기술적으로 수행, 조직 AAV9 주입 intramyocardial 주입은 더 일반적으로 연습된4,,57어렵다. 조직의 주입은 실행 하기 쉬운, 기존의 intramyocardial 주입 기계 환기 및 thoracotomy, 광범위 한 조직 손상, 원인과 많은 시간이 소요 됩니다.
이 보고서에서 우리는 intramyocardial 주입에 대 한, 시간-절약, 쉽고 효율적인 방법 설명. 아 데 노비 루스 인코딩 luciferase와 VDR, 또는 shRNA 대상으로 VDR, 심장 유전자 발현 조작에 주입 했다. 일단 마스터, 셀 또는 마우스 마음에 다른 재료의 사출으로 서 유전자 조작,이 메서드를 사용할 수 있습니다.
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프로토콜
모든 동물 실험 실험 동물의 사용에 건강 지침의 국가 학회에 따르면 실행 했다 하 고 연구소의 동물 윤리 위원회에 의해 승인 했다. (8-10 주 세) 남성 C57BL/6J 마우스는 모든 실험에 사용 되었다. 마우스는 24 ° C ± 4 ℃, 12 h 명암 주기, 물과 음식에 대 한 무료 액세스 아래에서 병원 체 자유로운 조건에서 보관 되어 있었다.
1입니다. 아 데 노비 루스 솔루션의 준비
- 순화 된 아 데 노 바이러스 솔루션의 도착-80 ° C 냉동 고에서 솔루션을 저장 합니다.
참고: 아 데 노 바이러스 주입 가능한 쥐에서 수행 되었다. 아 데 노 바이러스 벡터의 무 균을 보장 하기 위해, 아 데 노 바이러스 (인코딩 luciferase, VDR, 또는 대상으로 VDR shRNA) 준비 했다 고 정화 상업적으로9,10. - 작업 일에-80 ° C 냉동 고에서 순화 된 아 데 노 바이러스 솔루션 (3 x 1010 플 라크 형성 단위 [pfu] /mL) 밖으로 하 고 아 데 노 바이러스 벡터 솔루션 얼음에 녹여.
- 안 면, 멸 균 장갑, 멸 균 가운에 넣어.
- 50 µ L를 준비 작업 전날 소독 된 해밀턴 주사기.
참고: 살 균, 해밀턴 주사기는 거 즈에 싸서 및 높은 온도/높은 압력 소독 기에 배치. "고체에 대 한 살 균"의 모드를 선택 하 고 살 균 "시작" 버튼을 누르면 시작 했다. - 순화 된 아 데 노 바이러스 솔루션의 완전 한 녹고 후 75% 에탄올, 아 데 노 바이러스 솔루션을 포함 하는 튜브를 스프레이 하 고 층 류 살 균 후드에 아 데 노 바이러스 솔루션을 이동 합니다.
- 층 류 살 균 후드, 30 G의 바늘의 첨부 파일 다음에 해밀턴 주사기, 바늘 없는 해밀턴 주사기를 사용 하 여 50 µ L 아 데 노 바이러스 솔루션 발음.
- 30g 바늘 위쪽으로, 주사기를 누른 바늘 (바늘 끝에서 첫 번째 솔루션 상품의 외관에 의해 확인) 아 데 노 바이러스 솔루션으로 채워질 때까지 부드럽게 주사기의 플런저를 밀어.
참고: 30g 바늘을 채우기 위해 약 45 µ L 솔루션 걸립니다 그래서 지금은 거의 없는 솔루션 주사기에 표시 됩니다. - 위의 준비 된 주사기를 사용 하 여 신중 하 게 또 다른 30 µ L 아 데 노 바이러스 솔루션, 발음 하 고 사용에 대 한 얼음에 느슨하게 출장된 주사기를 놓습니다.
2. 마 취와 수술 준비
- 20 mL isoflurane isoflurane 기화 기에 추가 하 고 산소 탱크 isoflurane 기화를 연결.
- 밸브를 열고 고 산소 isoflurane 기화 기에 산소 탱크에서 흐름. 2 L/분 isoflurane 기화 기에 산소 흐름 모니터를 통해 산소 유량을 유지 합니다.
- 플라스틱 케이지 isoflurane 기화 기에 연결 된에서 2 분 100% 산소 (2 L/min)에서 4 %isoflurane 마우스의 마 취를 유도.
- 플라스틱 케이지에서 마 취 마우스를 꺼내 고 층 류 살 균 후드에서 발생 하기 쉬운 위치에 플라스틱 플랫폼에 보안을 코 콘을 통해 100% 산소 (2 L/min)에서 2 %isoflurane 마 취를 유지.
- 발가락 핀치 응답의 부재에 의해 적절 한 마 취를 확인 합니다.
- 건조에서 각 막을 보호 하기 위해 각 눈에 메 마른 눈 크림을 적용 합니다.
- 가슴 및 위 복 부를 면도. Depilatory 크림을 제거 하는 1 분에 대 한 면도 사이트에 상용 depilatory 크림을 적용 하 고 남은 젖은 gauzes와 모피.
- 기반으로 요오드 액체 살 균 (예: entoiodine)의 3 스크럽으로 외과 사이트 (가슴의 왼쪽된 아래 부분)을 소독. 무 균 드 레이프와 수술 부위의 커버.
3. Intramyocardial 마우스 마음에 아 데 노 바이러스의 주입
- 장갑에서 고 멸 균 장갑 한 켤레를 입었다.
- 집게, 마이크로-모기 hemostat, 수술가 위를 소독 하 고 높은 작업 전에 하루에 바늘 홀더 온도/높은 압력 소독 기 (단계 1.4 참고 참조).
- 칼과 겨드랑이 연결 하는 선 따라 0.5 cm 피부 절 개를 확인 합니다. 퉁 명 스럽게 가슴 주요와 집게와 마이크로-모기 hemostat 가슴 작은 근육 해 부.
- 큰 가슴 및 가슴 작은 근육을 제거 하 여 있는 공간을 노출 합니다. 통해 피어스 하 고 마이크로-모기 hemostat로 4 번째 있는 공간 (또는 관찰 하 여 넓은 있는 공간)을 엽니다.
- 가슴 벽의 오른쪽에 부드럽게 눌러 비 지배적인 손 검지 손가락으로 하트를 외부화 하 절 개를 향해 마음을 밀어.
- 부드럽게 검지 손가락과 엄지손가락의 비 지배적인 손 가진 외부화 심장 보호.
- 지배적인 손을 가진 총 30 µ L 아 데 노 바이러스 솔루션 아 데 노 바이러스 (그림 1C)로 채워진 해밀턴 주사기를 통해 3 개의 사이트 (좌 심 실의 복 부, 등, 그리고 측면 벽)에 좌 심 실 심근으로 주사.
- 주입의 완료 후 즉시 intrathoracic 공간으로 다시 마음을 놓습니다.
- 수동으로 부드럽게 피부 절 개 사이트 쪽으로 가슴 벽을 누르면 intrathoracic 공간에서 공기를 철수.
참고: 성공적인 공기 피난 가슴 큰 가슴 작은 근육 퇴 학된 공기에 의해 발생의 펄 럭 여 명시 될 수 있다. - 수평 매트리스 5-0 비단 봉합 사로 봉합 하 여 피부를 닫습니다.
참고: 주요 가슴 및 가슴 작은 근육 해야 하지 수 봉합, 때문에 그들은 단지 솔직 해 부 그들의 해 부 구조는 작업을 통해 그대로.
4. 수술 후 관리
- 관리 buprenorphine (3 mg/kg) 두번 매일 작업11후 첫 번째 48 h에 대 한 수술 후 통증을 줄이기 위해 피하 주사를 통해.
- 수술 후, 완전히 복구 될 때까지 즉시 열 패드 (37 ° C)에 마우스를 유지. 그것은 완벽 하 게 복구 후 다시 감 금 소에 마우스를 놓습니다.
- 해밀턴 주사기 사용된 및 높은 온도/높은 압력 소독 기에 30 G 주사기 바늘 소독 (1.4 단계 참고). 소독된 30 G 주사기 바늘은 sharps 용기에 수집 합니다.
5. 심장 Luciferase 식 측정에 대 한 Vivo에서 이미징
- 아 데 노 바이러스 주입 후 5 일에 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS)에 15 mg/mL에서 소의 신선한 재고 솔루션을 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
- Intra-peritoneally 150mg/kg 몸 무게에서 소 솔루션 깨어 쥐를 주사.
- 이미징 시스템을 켭니다.
- 자동 이미징 시스템의 자체 검사 후 "발광"으로 영상 모드를 선택 하 고 다음 설정을: 노출: 자동; Binning: 8; FStop: 1; 여기: 블록; 방출: 오픈.
- 소 주사 후 10 분 chloral 하이드 레이트 주입 (300 밀리 그램/kg 체중) 쥐를 anesthetize. 발가락 핀치 응답의 부재에 의해 적절 한 마 취를 확인 합니다.
- 카메라를 향해 이동 하는 가슴으로 발생 하기 쉬운 위치에 온수 이미징 단계에 마 취 쥐 보안.
- 이미지 (1 이미지 각 마우스에 대 한)를 수집 하 고 신호 강도 가슴 주위 관심 (ROI) 동일한 원형 측정 영역을 그려서 계량.
- 이미지의 컬렉션 후 쥐를 희생 하 고 다음 섹션에서 설명 했 듯이 조직을 수집 합니다.
6. 수확 조직
- 다른 시간 지점에서 바이러스 주사 (그림 1B) 후, 4 %isoflurane 쥐 anesthetize 및 코 콘을 통해 2 %isoflurane 마 취를 유지 하 고 경향이 위치에 플라스틱 플랫폼에 보안.
- 앞쪽 목에 중간 복 부 절 개를 확인 합니다. Omohyoid 및 sternocleidomastoid 근육을 제거 하 여 바로 일반적인 경 동맥을 노출 합니다.
- 바로 일반적인 경 동맥을 transecting 하 고 혈액을 배출 하 여 쥐를 희생.
- 복 부에 중간 복 부 절 개를 확인 합니다. Midclavicular 라인을 따라 흉 곽의 양쪽에서 갈비뼈를 잘라내어 transect 횡 경 막.
- 심장에 칼을 해제 하 여 노출. 오름차순 대동맥 찾아서 혈관 주위 지방 조직 제거.
- 대동맥을 cannulate 하 고 retrogradely 30 G 바늘 4 ° C 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS)의 0.5 mL 가득 1 mL 주사기에 부착 된 마음을 perfuse.
- 관류, 후 심장, 소비 세 그리고 왼쪽 및 오른쪽 심 나눕니다. 간, 폐, 그리고 비장을 삭제할.
- 차가운 PBS (4 ° C)에 두 세척 후 액체 질소에 극저온 튜브에 수집 된 모든 조직을 별도로 저장 합니다.
7입니다. 단백질 식의 결정
- 프로 테아 제 억제 물 칵테일 1: 100의 비율에서 상업적으로 사용 가능한 세포의 용 해 버퍼에 추가 하 여 균질 버퍼를 준비 합니다. 샘플 처리 수의 수에 따라 총 볼륨을 계산 합니다. 이후 사용에 대 한 4 ° C에서 준비 균질 버퍼를 유지.
- 액체 질소 탱크에서 조직을 꺼내 주세요. 조직 높은-정밀 저울 (직물의 각 조각 위한 약 60 mg)에 무게.
- 새로운 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송 조직. Microcentrifuge 튜브에 200 µ L 균질 버퍼 및 precooled 1.5 m m 강철 공 (4 ° C) 즉시 추가 합니다.
- Precooled (4 ° C)에서 microcentrifuge 튜브 금속 홀더 연 삭 기, 자동 조직에 고 다음 설정을 사용 하 여 컴퓨터를 시작 하 여 균질을 개시: 주파수: 70hz; 시간: 120 s.
- 균질, 후 원심 (16000 × g, 4 ° C), homogenate 하 고는 상쾌한 100 µ L 피펫으로 새로운 1.5 mL 튜브에 신중 하 게 전송 합니다.
- 추가 로드 1: 4의 비율로 단백질 표면에 뜨는 솔루션 (5 배)를 버퍼링 하 고 5 분 동안 100 ° C에서 단백질을 변성.
- 심장 및 기타 장기 조직에서 단백질 식 레벨은 더 서쪽 오 점 분석 (대표 결과 그림 2C 와 그림 3에 표시 됩니다)에 의해 모니터링 프로토콜에 따라 앞에서 설명한12.
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결과
실험 프로토콜 및 보고 방법에 대 한 주요 단계 중 일부는 그림 1에 표시 됩니다. 아 데 노비 루스 인코딩 luciferase (전진-루크)의 intramyocardial 주입 후 5 일, vivo에서 전진-뤽 주입 마우스에서 이미지 표시 했다 (그림 2A, B), 마음에 특별히 luciferase의 강력한 overexpression 서쪽 오 점 분석 (그림 2C), 제안 nontarget 장기 변환의 부재에 의해 확인. 대조적으로, 아무 luciferase 식 통제 쥐에 있는 발견 되었습니다. Luciferase의 성공적인 overexpression와 일치, 서양 분석 제안된 크게 증가 VDR 식 좌 심 실에 쥐의 VDR (전진-VDR) (
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토론
현재 보고서가 오 외. 심근 경색 유도 하는 방법에서 수정한 심장 유전자 조작에 대 한 바이러스 성 벡터의 intramyocardial 주입에 대 한 수정된 기술을 보여줍니다. 13 현재, vivo에서 특성의 특정 유전자 기능 대부분 포함 녹아웃 또는 유전자 변형 쥐3,,1415,16,17 세대 , 비싼, 시간이 걸리는, 및 노동 집약. 또는 유전자 벡터 또는 조직 또는 지방 주입 하 여 siRNA의 전달 또한 널리 심장 혈관 연구4,,5
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품 고유 영 학자 (81625002), 국립 자연 과학 재단의 중국 (81470389, 81270282, 81601238), 프로그램의 상하이 학술 연구 지도자 (18XD1402400), 상하이 시 국립 과학 기금에 의해 지원 되었다 교육 위원회 Gaofeng 임상 의학 보조금 지원 (20152209), 상하이 Shenkang 병원 개발 센터 (16CR3034A), 상해 Jiao 집게 대학 (YG2013MS42), 상해 Jiao 집게 대학 대학원 의학 (15ZH1003 및 14XJ10019), 상하이 항해 프로그램 (18YF1413000), 그리고 Bengbu 의학 대학 (Byycx1722)의 대학원 혁신 프로그램. 우리는 우리 실험실에서 그의 이전 도움 박사 Erhe가 오를 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (중국 수초우) | FS-CJ-2F | |
| 원심분리기 | Thermo Scientific (미국 월섬) | 75005282 | |
| 티슈 그라인딩 머신 | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (중국 닝보) | Scientz-48 | |
| 고온/고압 살균기 | 히라야마 (일본 사이타마) | HVE-50 | |
| 이소플루란 기화기 | 매트릭스 (미국 오차드 파크) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III 이미징 시스템 | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision 밸런스 | 싸토리우스 (Gö ttingen, Germany)28091873 | ||
| Instruments | |||
| Eppendorf 피펫(100 &마이크로; L) | Eppendorf (미국 웨스트버리) | ||
| Eppendorf 피펫(10 &마이크로; L) | Eppendorf (미국 웨스트버리) | ||
| 겸자 | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | 곡선 팁 |
| 해밀턴 주사기 | 해밀턴 (네바다, 미국) | 80501 | 볼륨 50 μ L |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | 곡선, 팁 너비 1.3mm |
| 바늘 홀더 | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (중국 상하이) | J32110 | |
| 수술용 가위 | F.S.T (미국 포스터 시티) | 14002-12 | |
| 1-mL 주사기 | WeiGao Group Medical Polymer Co., Ltd. (중국 상하이) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, 미국) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (영국 케임브리지) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| 탈모 크림 | Veet (상하이, 중국) | ||
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수 | Gibco (그랜드 아일랜드, 미국) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (상하이, 중국) | 310132 | |
| EP 튜브 | Sarstedt (Newton, 미국) | PCR001 | |
| 필터 | Millipore (Bedford, 미국) | 기공 크기 0.2 µ 엠 | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (중국 허베이성) | ||
| Luciferin | Promega (미국 매디슨) | P1041 | |
| 서부용 용해 완충액 Blot | Beyotime (중국 상하이) | P0013J | 억제제 없음 |
| 안과 크림 | Apex Laboratories (호주 멜버른))PBS | ||
| Gibco (Grand Island, 미국) | 10010023 | ||
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | 폭 1.5 mm | |
| 주사기 바늘 | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 게이지 | |
| 따뜻한 매트 | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (중국 광동) | NF-GNCW |
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재인쇄 및 허가
