방법 논문

Intramyocardial 쥐에 주입 하 여 심장 관련 유전자 조작 비보에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법

DOI:

10.3791/57074

⸱

2018년 4월 16일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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여기 선물이 쥐에서 심장 관련 유전자 조작에 대 한 프로토콜. 마 취, 마우스 마음 4 있는 공간을 통해 externalized 했다. 그 후, adenoviruses 인코딩 특정 유전자 단백질 식 측정 뒤에 vivo에서 이미징 및 서 부를 통해 심근에 주사기로 주입 했다 분석 오 점.

초록

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유전자 조작에 특별히 크게 심장 질병 pathomechanisms 및 그들의 치료 잠재력 조사 약효. 심장 관련 유전자 배달 vivo에서 체계 또는 로컬 배달에 의해 일반적으로 이루어집니다. 꼬리 정 맥을 통해 조직의 주입은 간단 하 고 효율적인 재조합 형 adeno 관련 바이러스 9 (AAV9)를 사용 하 여 심장 유전자 발현 조작에. 그러나,이 메서드는 효율적인 변환에 대 한 벡터의 상대적으로 높은 금액을 요구 하며 nontarget 기관 유전자 변환에서 발생할 수 있습니다. 여기, 우리는 간단한, 효율적, 시간 절약 방법을 intramyocardial 사출의 비보에 심장 관련 유전자 조작 생쥐에 대 한 설명. (환기) 없이 마 취, 가슴 중요 하 고 작은 근육은 퉁 명 스럽게 해 부, 그리고 마우스 심장 4 있는 공간에 작은 절 개를 통해 수동 외부화에 의해 신속 하 게 노출 되었다. 그 후, 아 데 노 바이러스 인코딩 luciferase (루크)와 비타민 D 수용 체 (VDR), 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 대상으로 VDR, 심근에 해밀턴 주사기와 주입 했다. 후속 vivo에서 영상 시연 그 luciferase 성공적으로 특별히 마음에에서 overexpressed 했다. 또한, 서쪽 오 점 분석은 성공적인 overexpression 또는 마우스 마음에 VDR의 입을 확인 했다. 일단 마스터, 셀 또는 마우스 마음에 nanogels 같은 다른 물자의 주입으로 유전자 조작,이 기술을 사용할 수 있습니다.

서론

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심장 질환은 병 적 상태와 사망률 전세계1,2의 주요 원인. 심근 경색, 심장 마비 등 생명이 심장 상태에 대 한 효과적인 치료 전략의 부족에는 기본 pathomechanisms의 집중 탐구와 새로운 치료 옵션3의 붐 빕니다. 이러한 과학적인 탐험에 대 한 심장 관련 유전자 조작 널리4,5입니다. 심장 유전자 조작과 강력한 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nuclease (TALEN)를 사용 하 여 편집 하는 게놈에 의해 달성 될 수 있다 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) / CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 도구, 또는 소성 유전 물질 (예, 바이러스 벡터 관심사의 단백질을 부호화 하는 유전자를 나르는)의 전달6. 게놈 편집과 살아있는 생쥐에서 정확 하 고 spatiotemporal 게놈 수정 허용, 그것은 여전히 시간과 노동 집약 연습6. 또는, 바이러스 벡터 또는 작은 간섭 RNA (siRN....

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프로토콜

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모든 동물 실험 실험 동물의 사용에 건강 지침의 국가 학회에 따르면 실행 했다 하 고 연구소의 동물 윤리 위원회에 의해 승인 했다. (8-10 주 세) 남성 C57BL/6J 마우스는 모든 실험에 사용 되었다. 마우스는 24 ° C ± 4 ℃, 12 h 명암 주기, 물과 음식에 대 한 무료 액세스 아래에서 병원 체 자유로운 조건에서 보관 되어 있었다.

1입니다. 아 데 노비 루스 솔루션의 준비

  1. 순화 된 아 데 노 바이러스 솔루션의 도착-80 ° C 냉동 고에서 솔루션을 저장 합니다.
    참고: 아 데 노 바이러스 주입 가능한 쥐에서 수행 되었다. 아 데 노 바이러스 벡터의 무 균을 보장 하기 위해, 아 데 노 바이러스 (인코딩 luciferase, VDR, 또는 대상으로 VDR shRNA) 준비 했다 고 정화 상업적으로9,10.
  2. 작업 일에-80 ° C 냉동 고에서 순화 된 아 데 노 바이러스 솔루션 (3 x 1010 플 라크 형성 단위 [pfu] /mL) 밖으로 하 고 아 데 노 바이러스 벡터 솔루션 얼음에 녹여.
  3. 안 면, 멸 균 장갑, 멸 균 가운에 넣어.
    4. ....

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결과

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실험 프로토콜 및 보고 방법에 대 한 주요 단계 중 일부는 그림 1에 표시 됩니다. 아 데 노비 루스 인코딩 luciferase (전진-루크)의 intramyocardial 주입 후 5 일, vivo에서 전진-뤽 주입 마우스에서 이미지 표시 했다 (그림 2A, B), 마음에 특별히 luciferase의 강력한 overexpression 서쪽 오 점 분석 (그림 2C), 제안 nontarget 장기 변환의 부재에 의해 확인. 대조적으로, 아무 luciferase 식 통제 쥐에 있는 발견 되었습니다. Luciferase의 성공적인 overexpression와 일치, 서양 분석 제안된 크게 증가 VDR 식 좌 심 실에 쥐의 VDR (전진-VDR) (

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토론

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현재 보고서가 오 외. 심근 경색 유도 하는 방법에서 수정한 심장 유전자 조작에 대 한 바이러스 성 벡터의 intramyocardial 주입에 대 한 수정된 기술을 보여줍니다. 13 현재, vivo에서 특성의 특정 유전자 기능 대부분 포함 녹아웃 또는 유전자 변형 쥐3,,1415,16,17 세대 , 비싼, 시간이 걸리는, 및 노동 집약. 또는 유전자 벡터 또는 조직 또는 지방 주입 하 여 siRNA의 전달 또한 널리 심장 혈관 연구4,,5

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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이 작품 고유 영 학자 (81625002), 국립 자연 과학 재단의 중국 (81470389, 81270282, 81601238), 프로그램의 상하이 학술 연구 지도자 (18XD1402400), 상하이 시 국립 과학 기금에 의해 지원 되었다 교육 위원회 Gaofeng 임상 의학 보조금 지원 (20152209), 상하이 Shenkang 병원 개발 센터 (16CR3034A), 상해 Jiao 집게 대학 (YG2013MS42), 상해 Jiao 집게 대학 대학원 의학 (15ZH1003 및 14XJ10019), 상하이 항해 프로그램 (18YF1413000), 그리고 Bengbu 의학 대학 (Byycx1722)의 대학원 혁신 프로그램. 우리는 우리 실험실에서 그의 이전 도움 박사 Erhe가 오를 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Equipments
Laminar flow sterile hoodFengshi Animal Experimental  Equipment Techonology Co., Ltd. (중국 수초우)FS-CJ-2F
원심분리기Thermo Scientific (미국 월섬)75005282
티슈 그라인딩 머신Scientz Biotechnology Co., Ltd. (중국 닝보)Scientz-48
고온/고압 살균기히라야마 (일본 사이타마)HVE-50
이소플루란 기화기 매트릭스 (미국 오차드 파크)VIP3000
IVIS  Lumina III 이미징 시스템PerkinElmer (Waltham, USA)CLS136334
Precision  밸런스싸토리우스 (Gö ttingen, Germany)28091873
Instruments 
Eppendorf 피펫(100 &마이크로; L)Eppendorf (미국 웨스트버리) 
Eppendorf 피펫(10 &마이크로; L)Eppendorf (미국 웨스트버리) 
겸자Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. JD4020곡선 팁
해밀턴 주사기해밀턴 (네바다, 미국)80501볼륨 50 μ L
Micro-mosquito hemostatF.S.T (Foster City, USA)13011-12곡선, 팁 너비 1.3mm
바늘 홀더 Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (중국 상하이)J32110
수술용 가위F.S.T (미국 포스터 시티)14002-12
1-mL 주사기WeiGao Group Medical Polymer Co., Ltd. (중국 상하이)
Materials and reagents
Anti-GAPDH antibodyCST (Danvers,  USA)#2118
Anti-Luciferase antibodyAbcam (Cambridge, UK)ab187340
Anti-rabbit IgGCST (Danvers,  미국) #7074
Anti-VDR antibodyAbcam (영국 케임브리지)  ab109234
BuprenorphineThermo Scientific (Waltham, USA)PA175056
Chloralic hydrasLingFeng Chemical (ShangHai, China)
Cryogenic VialsThermo Scientific (Waltham, USA)3754181.8 mL 
탈모 크림Veet (상하이, 중국)
Dulbecco의 인산염 완충 식염수 Gibco (그랜드 아일랜드,  미국)14040133
EntoiodineLiKang (상하이, 중국)310132
EP 튜브Sarstedt (Newton, 미국)PCR001
필터Millipore (Bedford, 미국)기공 크기 0.2 µ 엠 
IsofluraneYipin Pharmaceutical Company (중국 허베이성)
LuciferinPromega (미국 매디슨)P1041
서부용 용해 완충액  BlotBeyotime (중국 상하이)P0013J억제제 없음
안과 크림Apex Laboratories (호주 멜버른))PBS
Gibco (Grand Island,  미국)10010023
프로테아제 억제제 칵테일Thermo Scientific (Waltham, USA)78438
5-0 silk sutureShanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)
Steel ballScientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)폭 1.5 mm
주사기 바늘Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)30 게이지 
따뜻한 매트Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (중국 광동)NF-GNCW
49200000594920000113

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fa....

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