사기 질 기관 이용과 환경에 노출 된 쥐의 악의 니에서의 마이크로 해 부

요약

에 나 멜 형성과 가능한 변경 이해 ameloblast 활동의 연구가 필요 합니다. 여기, 마이크로 해 부 분 비 및 성숙 단계 ameloblasts 추가 양적 및 질적 실험 절차에 대 한 사용할 수 있는 포함 하는 나 멜 장기 하는 안정적이 고 일관 된 방법을 설명 합니다.

초록

환경 상태와 생활의 방법에서 발생 하는 나 멜 결함은 그들의 높은 보급 때문에 공중 보건 우려. 이러한 결함 세포 라는 ameloblasts, 사기 질 기관에에 나 멜 합성에 대 한 책임의 변경 된 활동에서 발생할. Amelogenesis, 동안 ameloblasts 확산, 차별화, 그리고 죽음의 이벤트의 구체적이 고 정확한 시퀀스를 따릅니다. 지속적으로 성장 하는 앞 니 쥐 생리 및 병 적인 조건에 ameloblast 활동 및 분화 단계를 공부 하 적당 한 실험 모델입니다. 여기, 마이크로 해 부 이용과 환경에 노출 된 쥐의 사기 질 기관에 안정적이 고 일관 된 방법을 설명 합니다. 마이크로 해 부 치과 epithelia 포함 분 비 및 성숙 단계 ameloblasts 질적 실험 immunohistochemistry 분석 등 현장에서 교 잡, 뿐만 아니라와 같은 정량 분석에 대 한 사용할 수 있는 실시간 정량 Pcr, RNA-seq, 그리고 서 부 럽.

서론

많은 발달에 나 멜 결함 환경 유독 또는 부적 절 한 생활 스타일^1,2,,34에서 발생할 수 있습니다. 이벤트 및 현재 설명한 절차를 사용 하 여 amelogenesis의 분자의 여러 유독 노출의 조기 표식으로 결과 나 멜 결함의 사용을 촉진 것입니다 그리고 건강의 역사를 다시 구성 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 때에 나 멜은 synthetized^1,2주 기간 동안 각 환자. 에 나 멜 합성 ameloblast 활동⁵에 따라 네 가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다. 첫 번째 단계 regroups 전조 세포 및 pre-ameloblast 확산. 두 번째 단계 동안 차별화 된 ameloblasts에 나 멜 매트릭스 단백질 (EMPs), 주로 amelogenin, enamelin 및 ameloblastin, 마지막에 나 멜의 두께 결정 하는 분 비. 따라서, EMP 합성의 중단에 나 멜의 정량적 결함 이끌어 낸다. 전체에 나 멜 두께의 증 착 후 성숙 단계는 시작 됩니다. 이 단계 동안, 인회석 crystallite 성장 폭과 두께에 최대 96% 무게에 의해 생물 학적 조직에 높은 강화 비율을 도달 하는 나 멜을 수 있습니다. 질적 성숙 단계 이어질 동안 발생 하는 방해 이벤트 결함 사기 질. 마지막으로, ameloblasts 설치류, 염색 라고도 후 성숙의 단계를 입력 하 고 돌이킬 수 없는, 돌이킬 수 없는 (있을 경우)에 나 멜 결함을 만드는 치아 분화 동안 apoptosis를 받 다, 따라서 결함의 잠재적인 회고전 기록 제공 ameloblast 고 강조입니다. 설치류, amelogenesis 그들 amelogenesis의 일반적인 과정을 공부 하기 적합 한 모델을 만드는 그들의 앞 니는 지속적으로 성장 하 고, 까다로움과 이벤트의 유사한 순서를 따른다. 따라서, amelogenesis의 중단에 나 멜 품질 및 수량, 방해 이벤트의 기간에 따라 변경 발생합니다. 그런 의미에서 다이옥신, 납, 그리고 내 분 비 방해 화학 물질 (EDCs) 비스 페 놀 A (BPA), genistein, vinclozolin, 등에 노출에 나 멜 hypomineralizations^{,12,3 생성 하기 위해 표시 되었습니다. ,6,,78}. 비대칭 흰색 불투명 반점이 쥐 태아 기간 출생¹후 첫 달 동안 낮은 복용량 BPA 복용량에 노출의 앞 니에 확인 되었다. 이 나 멜 결함 쥐, 그리고 인간 어 금 니 니 hypomineralization (MIH)의 그에 유사한 임상, 구조, 및 생 화 확 적인 특성을 공유합니다. MIH는 최근 설명된 치과 나 멜 병 병 인 아직도 남아 있는 많은 인과 요인에도 불구 하 고 불분명^9,10 에^{9,10,11 가상 데 ,12}.

환경 요인으로 인해 또 다른 중요 한에 나 멜 hypomineralization 병리학은 치과 fluorosis (DF), 과도 한 불 소 흡수의 결과 이다 (> 0.1 m g/k g/일)^13,14. 불 소의 주요 소스는 식 수를 보충 하거나 자연스럽 게 불 소 강화입니다. 불 소는 또한 종종 치과 카 리에 스를 방지 하기 위해 처방 이지만 예방 복용량만 50% 보다 낮은 독성 하나 (0.05 mg/kg/day). MIH와 DF, 환경 요인에 노출에서 결과로 두 자주 pathologies EDCs² 등 다른 유독 함께 하는 불 소의 hypomineralizing 효과의 potentiation 인해 특성화 하는 데 필요한 공통 기능을 제공할 수 있습니다. 또는 amoxicillin¹⁵.

쥐 사기 질 기관의 ameloblasts 다른 분화 단계에서 포함 된 마이크로 해 부는 ameloblast 활동을 방해 하 고에 나 멜 치아 분화 후 진단 결함을 일으킬 수 있는 분자의 행동의 메커니즘을 이해 하는 데 도움이 됩니다. 즉,에 나 멜 진 식과에 나 멜 매트릭스 구성 환경 유독 때문의 변화 특성에 유독, 노출의 역사의 재구성 있으며 공개에 대 한 환경 안전 모니터링을 용이 하 게 건강입니다.

프로토콜

현재 연구에 사용 된 모든 동물 관리 및 농업 (A-75-06-12)의 프랑스 내각에서 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 유지 되었다.

1. 동물 유독 노출

1. 이 프로토콜을 수행 하기 전에 필요한 기관 승인을 하 고 모든 동물 보호 지침을 준수 해야 합니다.
2. Ameloblast 분 비 단계 및 ameloblast 성숙 단계에 조사 하는 molecule(s)의 영향을 테스트 하기 위해 다른 실험 그룹의 헌법을 수 있도록 연구 프로토콜의 디자인을 적용 합니다. 여기, 남성 Wistar 쥐의 4 개 그룹 불 (NaF) 조합에서 또는 하지 BPA (그림 1A)²에 그들의 노출에 따라 구성 되었다. 모든 동물 관찰 하 고 하루 65 (그림 1B)에 해 부 했다.

2. Hemi-Mandibles 성인 쥐에서의 해 부

1. CO₂ 질, 선택적으로 시체의 나머지 부분에서 별도 머리를 잘린 다음으로 쥐를 안락사. CO₂ 전용된 상자¹⁶에서 5 분에 쥐를 노출 합니다.
2. #11 메스를 사용 하 여 더 낮은 앞 니에 쉽게 접근할 낮은 입술에서 모든 피부를 제거 합니다.
3. 같은 메스와 약간의 압력 두 더 낮은 앞 니 사이 절 개 하 고는 mandible 두 개의 반쪽으로 분할 됩니다.
4. 턱, 분리를 메스로 일시적인 악의 공동 잘라내어 hemi mandible 정밀한 핀셋으로 잡고.
5. 메스와 주변 부드러운 조직 고 모든 근육, 힘 줄, 인 대는 뼈가 완전히 깨끗 한 때까지 스 크레이 퍼를 사용 하 여 제거.

3. 니^17,18 의 격리

1. 신중 하 게 블레이드는 니의 주요 종 축에 평행 하 게 배치 하 여 뼈 떨어져 면도. 자 궁 경부 루프 근처 니 끝까지 니 (근 끝)의 끝 근처 뼈 능선에서 시작 합니다. 절 개 모션 원심 방향에 인접에서 진행 됩니다.
2. 에 게 첫 번째 컷 distally hemi mandible의 gonion를 제거 하 고 쉽게 자 궁 경부 루프 또는 ameloblasts ( 그림 2에서 레드 라인)의 분 비 단계 손상 없이 니 이륙 허가를 메스로 자 궁 경관 루프.
3. 어 금 니, 두 번째 아래 두 번째 컷을 확인 하 고 뼈와 고 니의 중간 표면 사이 메스를 삽입. 모든 기저 뼈를 들어올리면는 니 바깥쪽으로 회전 하 고에 나 멜을 피하기 위해 그것을 신중 하 게 벗어 기관 조직 손상 정밀한 핀셋을 사용 하 여.

4. 마이크로-의 해 부 눈 렌즈 아래에 나 멜 기관

1. 피 펫을 사용 하 여 니에 염 인산 염 버퍼 (PBS 1x)의 200 µ L을 드롭. 고급 핀셋으로 니 위로 향하도록 입술 표면 가져가 라. 메스는 무색 조직의 주황색 부분 사이 표시를 확인 합니다. 이 마크는 나중에 볼 (그림 2)는 기본 백색 반점에 해당 합니다.
2. 굴 삭 기 또는 해당 도구와 분 비 단계 (무색) ameloblasts, 그리고 성숙 단계 (오렌지) ameloblasts 대 니의 끝을 메스 마크에서에 해당 하는 꼭대기 끝을 메스 마크에서 세포 표면을 다쳤어요.
3. 이전 설명된¹⁹로 전환 단계로 해당 2 mm 조직을 제거 합니다. 사기 질 기관 절 개는 mesenchyme 하 여 오염을 방지 하는 동안에 고 니를 열지 마십시오.
4. 앞에서 설명한²⁰로 니 (그림 2)의 꼭대기 부분에 바로 위치한 자 궁 경부 루프를 잘라.
5. 추가 조사 ( 재료의 표참조)에 대 한 10% 포 르 말린 또는 세포 솔루션에 그것을 수집 합니다.

5. 추가 조사에 대 한 분리 된 사기 질 기관 직물의 수집

1. 200 µ L PBS 1 X 버퍼는 니에 드롭.
2. #11 메스 블레이드, 신중 하 게 분리, 버퍼에 점차적으로 치과 상피 세포 별도로 이전 메스 마크의 도움으로 각 단계에 대 한.
3. 셀 RNA 및 단백질 추출, 단백질 및 RNAs ( 재료의 표참조)의 적 출을 허용 하는 세포 해결책을 사용 하 여 조직을 넣어.
   참고: 조직-굴 삭 기는 튜브에 하 고 다음 셀 균질 혼합물을 얻기까지 연 삭 하 여 고품질 RNAs를 준비 합니다. 혼합물은 앞에서 설명한^2,,817제조업체의 절차에 따라 RNA 및 단백질 추출에 대 한 준비. 일반적으로, 약 5-10 µ g 총 RNAs 및 150 µ g 총 단백질 각 준비를 획득 했다.
4. 조직학 분석에 대 한 immunohistochemistry (IHC), 그리고 현장에서 교 잡 (ISH)는 2 h, 그 후에 PBS 1 X에서에서 4 ° C에서 저장소에 대 한 10% 포 르 말린에 셀 레이어를 넣어. 조직 수 포함할 수 왁 스/파라핀 또는 조직에 10 월 냉동된 섹션에 대 한.
5. EMP 기사는 니 고급 핀셋으로 걸릴. 공기 (약간의 탈수)에 짧은 노출 후 하얀 점이 사기 질 강화 작용의 개시를 나타내는 니 입술의 가운데 부분 주위에 표시 됩니다. 이 백색 반점 / 해당 하는 전환-초기 성숙 단계의 ameloblasts, 그래서 그것을 사용 표시기로 EMPs²¹의 추출.

결과

많은 치과 fluorosis^12,13, 과도 한 불 소 흡수 때문 환경 조건에서 발생할 수 있습니다 또는 사기 질 hypomineralization와 유사한 MIH 일부 EDCs^1, 에 노출 때문에 결함에 나 멜 ^7,22. 이러한 발달에 나 멜 결함 쥐 (그림 1)^1,2,7,,23

토론

변경 된 ameloblast 활동 또는 방해 ameloblast 확산, 차별화, 그리고 성숙 프로세스 리드 돌이킬 수 없는 사기 질 결함을, 차례로,에 나 멜 결함의 특성은 변경의 이해 도움이 될 수 있습니다. amelogenesis 중 ameloblast 활동입니다. 따라서, 고립 된 사기 질 기관에 학문은 사기 질 결점 든 그들의 근원, 환경 또는 유전을 선도 병 적인 이벤트를 명료 하 게 하는 결정.

이 기술은 원래 Hiller 그 외 여러분 에 의해 설명 하 고 ¹⁷ 와 로빈슨 외. ¹⁸에 나 멜 기관 분화의 각 단계에 특정 효과 입증 하는 데 사용 됩니다. 다음 EMP 기사^19,,2425에...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
비스페놀 A	시그마 알드리치, 세인트루이스 미주리	239658
포르말린 10%	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리	HT5012
트라이 시약	Euromedex, 프랑스	TR118
RLT 버퍼	Qiagen, Les Ulis, France	74126	RNeasy Protect Mini Kit
Androgen receptor 항체	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)	sc-816	토끼 다클론 항체
PBS 10x	EUOMEDEX	ET330. 불
화나트륨 (NaF)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO	S-1504
파라플라스트 레귤러	라이카 마이크로시스템, 낭테르 세덱스,  France	39601006	텍스트 조직에서 was/parafin이라고 함
OCT	VWR, Fontenay-sous-Bois, France	411243
Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cm	PHYMEP , Paris, France	14084-08
메스 블레이드 핸들 - 12.5 cm	PHYMEP, Paris, France	10035-12
곡선 메스 블레이드	PHYMEP , Paris, France	10035-20
해부 나이프 - 세밀한/직선 팁	PHYMEP, 파리, 프랑스	10055-12
원형 나이프	PHYMEP, 파리, 프랑스	10059-15
메스 블레이드 n° 11 Swann-Morton	VWR, Fontenay-sous-Bois, France	233-0024
쌍안경	Leica biosystems, Nanterre cedex,  프랑스	MZFLIII