샘플 저장소 암 바이오 마커의 평가를 위한 유용한 툴으로 말린 혈액 및 혈 청 관광 명소

요약

이 프로토콜 주변 혈액 및 혈 청/플라즈마 다운스트림 분석 단일 염기 다형성 (SNP) 평가 및 ELISA 분석 결과 등을 저장 하는 간단 하 고 유용한 방법을 설명 합니다.

초록

혈액 샘플 품질은 실시간 PCR 또는 ELISA 등 정확한 다운스트림 분석을 위해 중요 합니다. 생물 재료의 올바른 보관 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 결과 달성 하기 위해 출발점입니다. 모든 샘플 저장소 혈액 컬렉션에서 같은 방식으로 취급 한다. 수행을 분석에 따라 전체 혈액 및 혈 청 샘플 저장 되어야 한다-20 ° C 또는-80 ° C에서 사용까지. 혈액/혈 청 샘플을 피하기 위해 여러 동결-해 동 aliquoted 해야 합니다. 또 다른 중요 한 문제는 다른 한 실험실에서 운송 중 샘플 조건입니다. 드라이 아이스는 사용할 수 없습니다 또는 운송 몇 일 보다 더 오래 걸립니다, 대안 필요 합니다. 한 옵션 혈액 컬렉션에 대 한 필터 종이 사용 하는 것입니다. 여기, 우리 혈액에 대 한 방법을 제안 및 활용 하는 혈 청 샘플 컬렉션 핏 자국 (DBS)을 건조 혈 청 반점 (DSS)를 건조. 우리는 실시간 PCR에 의해 몇몇 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp)의 다운스트림 평가 위한 DBS에서 DNA를 추출 하는 절차를 개발 했다. 우리는 또한 DSS에서 eluted 단백질에서 시작 하는 ELISA 분석 결과 최적화. 이 메서드는 다른 ELISA 분석 실험 또는 단백질을 평가 하는 절차와 함께 사용할 수 있습니다.

서론

암 바이오 마커를 연구의 주요 목표는 새로운 생물 학적 진단, 예측 환자의 예 후 및 환자는 특정 치료에 응답 여부를 확인 하기 위해 사용할 수 있는 매개 변수 id입니다. 이 연구 분야는 혁신적인 암 치료의 발견에 대 한 기본 이며 맞춤형된 치료에 중요 한 역할.

바이오 마커 식별 및 유효성 검사의 각 단계 동안 수행 하는 절차는 안정적이 고 재현 되어야 합니다. 변환 연구의 성공 위한 초석 혈액 및 혈 청 등 생물 샘플의 올바른 스토리지입니다. 이것은 분자 생물학 실험 또는 단백질 분석 실험을 수행 하는 데 사용할 수 있는 고품질 생물 학적 자료를 얻기 향한 첫 번째 단계입니다.

강력한 데이터를 얻기 위해 충분 한 환자를 모집 하 되 연구 필요는 합니다. 모든 학회-80 ° C에서 샘플을 저장할 수 또는 드라이 아이스에 다른 국제 센터에 샘플을 보낼 수 있습니다. 혈액 컬렉션에 대 한 필터 종이 사용 하 여 혈액 및 혈 청을 저장 하기 위한 간단한 방법 이며 샘플^1,2의 즉시 동결을 요구 하지 않는다. 종이, 건조 하룻밤 왼쪽 및 실내 온도¹<....

프로토콜

말 초 혈액 및 혈 청 수집 하 고 건강 한 기증자와 환자는 연구에 참여를 서 면된 동의 준에서 저장 했다. 연구 프로토콜 1964 헬싱키 선언에서 윤리적인 표준 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. DBS에서 혈액 저장

1. 혈액 샘플 컬렉션
   1. Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 5.4 mg와 3 mL 튜브에 주변 혈액 샘플의 3 mL를 수집 합니다.
      참고: 가능 한 한 빨리 DBS로 및 8 h 내 주변 혈액을 저장 합니다.
   2. 보호기 카드의 하단 오른쪽 모서리에 환자 번호를 작성 합니다.
   3. 신중 하 게 혈액 5 mL 피 펫으로 resuspend.
2. DBS에 혈액
   1. 플라스틱 및 50-200 µ L 팁 보호기 카드 (자료 테이블)에 혈액 (50 µ L)의 한 자리를 전달.
   2. 1.2.1 단계를 반복 합니다. 총 3-5 핏 자국을 하십시오. 오래 된 팁 삭제 하 고 각 혈액에 대 한 새 aliquot.
   3. 오픈 비 흡수 성 표면에 직접적인 햇빛을 피하는 DBS는....

결과

우리는 생물 학적 재료의 품질에 영향을 주지 않고 혈액 및 혈 청 실내 온도에서 저장 하 DBS 및 DSS 절차의 이용을 했다. 그림 1 단백질 카드 보호기 없이 혈액 및 혈액 수집 후의 예가 나와 있습니다. 확인 필터 종이에 저장 및 혈액을 elute 절차 샘플 품질 방해 하지 않습니다, 우리는 표준 저장 방법으로 비교를 수행 합니다. 우리는 프로토콜 섹션에서 보고 2 mL 튜브에 수집 또는 DBS로 저장 된 전 혈의 3 일치 샘플에서 DNA를 추출. 5 개의 Snp 실시간 PCR에 의해 분석 되었다. 데이터 일치 샘플에 대 한 얻은 100% 조화 된 했다.

ELISA 분석, 관련 우리 2 mL 튜브에 수집 된 혈 청의 8 샘플 저장 (그리고-80 ° C에서 즉시 저장) 및 DSS (-20 ° C에서 그리고 .......

토론

이 프로토콜은 실험실 직원 또는 혈액 샘플의 정확한 처리를 위해 필요한 인프라 없는 경우 필터 종이에 혈액 및 혈 청을 저장 하기 위한 잠재력을 조사 합니다. 특히, 전체 혈액 또는 혈 청 표준 튜브 또는 손가락 찌 르 기에 의해 수집 된이 메서드를 사용 하 여 저장할 수 있습니다 그리고 혈액 컬렉션 직후-20 ° C 또는-80 ° C에서 샘플을 동결 필요가 없습니다. DBS/DSS/혈 무결성에 어떤 변화 없이 최대 14 일 동안 실내 온도에 유지 수 있습니다. 저장소에 대 한 중요 한 문제가 온도 보다 더 많은 생물 학적 재료의 특성에 영향을 미치는 수 분의 존재 이다. 방 습 제와 함께 비닐 봉지를 사용 하 여이 문제를 방지할 수 있습니다. 카드 비닐 봉지 안에 수 분이 저장 동안 문제가 된다. 미 립 자 공기/방울/먼지 또는 습기에서에서 발생 하는 문제 되지 야간 보육¹⁰동안 관찰 되었다. 우리는 이전 사용 필터 종이를 이탈리아와 아프리카 동료^11<.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Whatman 단백질 절약 카드 903 단백질 절약 카드, 100/pk‎	Sigma	Z761575	다운스트림 분석을 위해 실온에서 시료를 보관하는 데 유용
Falcon Serological Pipettes, 5 mL	Stem cell	#38003
50-200 µ L 팁	Star-Lab	S1120-8810
1.5 mL 원심분리 튜브	Eppendorf	4036-3204
QIAamp DNA 마이크로키트	Qiagen	56304	이것은 소량의 DNA를 분리하도록 설계된 DNA 추출 키트입니다
Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit)	Qiagen		This is report as Lysis Buffer 1 in the
text Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit)	Qiagen		This is report as Lysis Buffer 2 in the
text QIAamp mini elute column	Qiagen		This is report as column in the text
AW1  (QIAamp DNA microkit에 포함)	Qiagen		텍스트에서 Wash Buffer 1로 보고됩니다
. (QIAamp DNA microkit에 포함)	Qiagen		텍스트에서 Wash Buffer 2로 보고됩니다
	. D 시스템	DVDBP0

이것은 AW2  이것은 Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit R&