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방법 논문

토끼에서 다이어트 유발 된 변화 증후군의 실험 모델: 방법론 고려 사항, 개발 및 평가

10.5K 조회수

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DOI:

10.3791/57117

⸱

2018년 4월 20일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CIBERCV, Instituto de Salud Carlos III, 2Department of Physiology, Universitat de València, 3INCLIVA, 4Department of Electronic Engineering, Universidad Politécnica de Valencia, 5UCIM, Universitat de València, 6Department of Physiotherapy, Universitat de València

이 논문에서

요약

높은 지방, 높은 자당 다이어트를 사용 하 여 토끼에서 다이어트 유발 된 변화 증후군 (메츠)의 실험 모델을 개발 하는 방법을 설명 합니다. 동물 개발 중앙 비만, 가벼운 고혈압, 사전 당뇨병, 그리고 dyslipidemia, 따라서 인간의 메츠의 주요 구성 요소를 재현. 이 만성 모델 질병 진행의 지식 기본 메커니즘의 인수를 수 있습니다.

초록

최근 몇 년 동안, 비만 및 변화 증후군 (메츠) 공중 보건 및 임상 연습, 주어진 정 주의 라이프 스타일과 건강에 해로운 식습관의 상승으로 인해 그들의 증가 보급에 대 한 성장 문제가 되었다. 동물 모델 덕분에 기초 연구는 메츠 등 병 적인 프로세스를 기본 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 여기, 다이어트 유발 메츠와 평가의 실험 토끼 모델을 개발 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 새 환경 순응의 기간이 지난 후 동물 28 주 동안 높은 지방 (소화 10% 코코넛 오일과 5% 라 드), 높은 자당 (물에 녹아 15% 자당) 다이어트 먹인 다. 이 기간 동안 몇 가지 실험 절차는 메츠의 다양 한 구성 요소를 평가 하 수행 했다: 형태학 및 혈압 측정, 포도 당 허용 오차 결정, 그리고 여러 개의 플라즈마 마커 분석. 실험 기간, 동물 개발 중앙 비만, 가벼운 고혈압, 사전 당뇨병, 그리고 dyslipidemia triglyceride (TG) 레벨의 증가와 낮은 HDL, 높은 LDL의 끝에, 따라서 인간의 메츠의 주요 구성 요소를 재현. 이 만성 모델 위험 환자의 식별 또는 심지어는 테스트의 새로운 전 임상 및 임상 마커의 검출, 질병의 진행에 근본적인 메커니즘을 이해 하기 위한 새로운 관점에서는 치료 이 복잡 한 병 리 치료에 대 한 접근입니다.

서론

비만 및 변화 증후군 (메츠) 공중 보건 및 임상 연습, 주어진 정 주의 라이프 스타일과 건강 하지 못한 식사 습관1의 상승으로 인해 그들의 증가 보급에 대 한 성장 문제가 되 고 있습니다. 메츠의 여러 정의가 있다 하지만 그들의 대부분의 복 부 비만, 감소 HDL과 LDL 콜레스테롤, 상승 된 트리 글리세라이드, 포도 당 옹 졸, 고혈압2 등 심혈 관 및 대사 변경 클러스터로 그것을 설명합니다 ,,34. 진단이 5 가지 기준 중 3 개는 존재 해야 합니다.

때문에 동물 모델, 기초 연구 메츠 등 병 적인 프로세스를 기본 메커니즘을 조사를 수 있다. 여러 동물 모델 사용 되었습니다, 하지만 그것은 중요 한 중요성의 선택 모델 (그림 1) 인간의 병 리의 주요 임상 발현을 재현. 이 목표와 유사한, 주로 개 인간과 돼지, 것으로 간주 하는 동물 모델 (Verkest5 및 검토를 위해 장 & Lerman6 참조) 개발 되었습니다. 그러나, 경화 또는 다이어트에 의하여 개에 혈당의 개발은 수상한5개 모델 메츠의 모든 구성 요소를 표시 되지 않습니다. 돼지 모델 인간, 가장 해 부와 생리 적인 유사성을 제시 하 고 따라서 elucidating 메츠, 기본 메커니즘에 대 한 중요 한 예측 파워를 제공 하지만 그들의 유지 보수 및 실험 절차의 복잡성은 사용 이 매우 노동 집중 하 고 비용이 많이 드는6모델.

다른 한편으로, 설치류 모델 (마우스 및 쥐), 다이어트 유발 된 자연과 유전자 변형, 광범위 하 게 사용 된 문학에서 비만, 고혈압, 고 메츠, 그리고 다른 장기 및 시스템 (참조 왕에 그 병 적인 결과의 연구에 대 한 외. 7 검토를 위해)입니다. 이러한 모델의 사용은 개 또는 돼지 보다 더 저렴 한, 하지만 그들은 중요 한 단점이 있다. 실제로, 긴장, 따라 동물 개발 메츠의 일부 구성 요소 반면 고혈압, 혈당, hyperinsulinemia 등 다른7결 석. 또한, 메츠, 비만, 일부 유전자 변형된 종자의 주요 구성 요소 중 하나만 다이어트와 관련 된 요인에 의존 하지 않는, 오히려 그것은 보였다 일부 동물 정상 또는 심지어 감소 된 음식 섭취 량8비만 될. 마지막으로, 쥐 및 쥐 cholesteryl 에스테 르 이동 단백질 (CETP) 자연 결핍을 표시 하 고 HDL 콜레스테롤 수송, 동맥 경화 증의 발전에 상대적으로 강한 게의 주요 수단으로 사용 하 여. 이것은 인간, CETP를 표현 하 고 그들의 콜레스테롤 LDL9에서 주로 수송 지질 물질 대사에 중요 한 차이 이다.

반대로, 실험실 토끼 큰 동물과 설치류 실험 모델 사이의 중간 단계를 나타냅니다. 따라서, 토끼는 직원 및 유지 보수, 실험 절차에 큰 동물 모델 보다 더 쉽게 처리 되 고의 최소한의 요구 사항을 프로토콜의 종류를 쉽게 제출하실 수 있습니다. 또한, 토끼 먹이 높은 지방 다이어트로 비만 인간8,,1011로 비슷한 hemodynamic 및 neurohumoral 변화는 보고 되었습니다. 지질 대사에 관한 참고의 토끼 풍부한 CETP 플라즈마에 있으며 그들의 단백 프로 파일은 LDL이 풍부한12를 또한 인 간에 게 유사한. 또한, 토끼 개발 혈 아주 급속 하 게 주어진 것, herbivores로 그들은 매우 민감한 식이 지방13.

figure-introduction-1
그림 1: 메츠 동물 모델의 비교. Verkest5,6장 및 Lerman 및 왕 외. 참조 검토를 위해 7 . "figure-introduction-2" 이점을 나타냅니다 및 "figure-introduction-3" 단점을 나타냅니다. *논쟁, 캐롤 그 외 여러분 에 의해 밖으로 연구, *지적에 따라 8, 일부 유전자 변형된 종자 식품 섭취 량에 상관 없이 비만 될. CEPT: cholesteryl 에스테 르 이동 단백질입니다. GTT: 포도 당 내성 검사 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

밑에 병 적인 개장에 다른 장기와 시스템, 메츠에 의해 생성 하는 기본 메커니즘을 명료 하 게 고이 복잡 한 병 리의 주요 구성 요소를 재현 하는 실험 모델의 선택의 이해를 얻기 위해 인간의 메츠 필수적 이다입니다. 토끼는 인간의 생리와 만성 프로토콜 및 측정에 사용의 경제성의 유사성을 주어진 많은 장점을 제공할 수 있습니다. 이 라인에서 높은 지방와 높은 자당 다이어트를 사용 하 여 몇 가지 다이어트 유발 된 토끼 모델 되었습니다 사용14,15,,1617,18,19 (표 1), 그리고 메츠의 다른 성분의 특성은 매우 중요 때 개장 하는 기관으로 표현 형 관련. 따라서,이 문서의 주요 목적은 병 태 생리학의 연구를 수 토끼에서 다이어트 유발 메츠와 개장 하는 기관에 미치는 영향의 모델을 개발 하는 방법을 설명 하.

연구다이어트기간번 식메츠의 구성 요소
산부인과HTHGDl
음과 외. (2002)14·    10%의 지방24 주·      남성 NZWfigure-introduction-4-figure-introduction-5figure-introduction-6
·    37% 자당·      2 kg
조 외. (2007 년)15·    10%의 지방36 주·      남성 JWfigure-introduction-7figure-introduction-8figure-introduction-9figure-introduction-10
·    30% 자당·      16 주
Helfestein 그 외 여러분 (2011 년)16·    10%의 지방24 주·      남성 NZWfigure-introduction-11-figure-introduction-12figure-introduction-13
·    40% 자당·      12 주
·    0.5-0.1 콜레스테롤
닝 외. (2015)17·    10%의 지방8-16 주·      남성 WHHLfigure-introduction-14-figure-introduction-15figure-introduction-16
·    30%과 당 *·      12 주
리 우 외. (2016)18·    10%의 지방48 주·      남성 NZWfigure-introduction-17-figure-introduction-18figure-introduction-19
·    30% 자당·      12 주
아리아-Mutis 외. (2017)19·    15% 지방28 주·      남성 NZWfigure-introduction-20figure-introduction-21figure-introduction-22figure-introduction-23

표 1: 다이어트 유발 메츠 토끼 높은 지방, 높은 자당 다이어트를 사용 하 여 모델. 상징 "figure-introduction-24"나타냅니다 부재,"figure-introduction-25" 존재, 및 "-" 평가 되지 않습니다. * 제한. WHHL, 와타나베 상속 hiperlipidemic 토끼 JW, 일본어 흰 토끼. 산부인과, 비만 HT, 고혈압입니다. HG, 혈당입니다. Dl, dyslipidemia

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프로토콜

동물 보호 그리고이 연구에 사용 된 실험 프로토콜 준수 과학적인 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 EU 지침 2010/63 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (2015/VSC/완두콩/00049)에 의해 승인 했다.

참고: 프로토콜은 28 주 동안 높은 지방, 높은 자당 다이어트의 만성 관리와 메츠의 주요 구성 요소 평가의 구성 됩니다. 11 성인 남성 뉴질랜드 화이트 (NZW) 토끼 4.39 ± 0.14 (사 우 스 다코타)를 무게를 사용 하는 우리 k g, 20-22 주 실험 프로토콜의 시작 부분에 이전 했다. 그들은 습도 (50 ± 5%)와 한 방에서 지 내게 했다 및 12-h 빛 온도 (20 ± 1.5 ° C) 제어 조건을 주기 있습니다. 단어 "차 우"와 "다이어트" 프로토콜 단계에서 교대로 사용할 수 있습니다.

1. 다이어트 관리

  1. 다이어트를 준비 하거나
    1. 추가 수소 코코넛 오일 (10%)와 상업적으로 사용 가능한 높은 지방 다이어트 를 라 드 (5%)19. 이 다이어트는 3.7 kcal·g-1을 제공 합니다.
    2. 멸 균된 물 (예를 들어, 15% 자당 해결책 2 L 재고 사용 300 g 자당)에 자당의 적절 한 금액을 용 해 하 여 5 ~ 15%의 자당 솔루션 을 준비 합니다. 15% 솔루션 0.6 kcal·mL-1을 제공 합니다.
    3. 상용 컨트롤 다이어트19, 2.7 kcal·g-1을 제공 얻을.
  2. 동물 4 주 대 한 적응
    1. 각 동물 피드 제어 다이어트의 제어 그룹 120 g에서에서 매일. 물 광고 libitum제공 합니다.
    2. 메츠에서 동물 그룹 250 g 차 50% 제어와 4 주 말까지 100% 높은 지방 차 우를 점차적으로 증가 하는 50% 높은 지방 차 시작 피드.
      참고: 목표 달성 될 것 이다: (i) 35% 제어 및 주 1; 말까지 65% 높은 지방 차 우 (ii) 25% 제어 및 주 2; 말까지 75% 높은 지방 차 우 (iii) 15% 제어 및 85% 고 지방 차 우 주 3 말까지. (4) 100% 높은 지방 차 우 4 주 말까지.
    3. 메츠에서 동물 5% 자당 시작에, 그룹 물 주고 4번째 주 말까지 15% 자당 농도 증가.
    4. 1.1.1에 제공 된 값에 따라 칼로리 섭취 량을 계산 하 차 우와 자당 솔루션의 일일 섭취 량을 등록 합니다. 그리고 1.1.2입니다.
  3. 유도 메츠 (28 주)
    1. 피드 제어의 제어 그룹 120 g에 있는 각 동물 차 우와 매일 광고 libitum 물.
    2. 물에 높은 지방 차 우와 15% 자당의 메츠 그룹 250 g에서에서 동물을 먹이. 매일 차 및 자당 솔루션 3 매일 교체 합니다.
    3. 나머지 차 우와 물을 매일 섭취 량 추정 무게.

2. 형태 평가

  1. 동물 bodyweight 주간 단위로 측정 합니다.
  2. 높이, 길이, 복 부 윤곽및 tibial 길이측정 하 고 관리 실험 다이어트와 14-마 취 동물에 28 주 전에 BMI 를 추정.
    1. Cannulate 살 균 일회용 카 테 터 (18-22 G)와 오른쪽 귀 가장자리 정 맥 그리고 propofol (8 mgkg-1) 뒤에 0.9 %NaCl 용액의 1.5 mL를 주입. 마 취 토끼에서 이후 단계에 나열 된 측정을 수행 합니다.
    2. 측정 높이 길이. 측정 테이프, 측정 및 기록 발뒤꿈치에 코에서 거리 옆 decubitus 위치 (길이)에 사용 하 여. 같은 위치에서 발 (높이)의 끝에 어깨에 acromion에서 거리를 가져가 라.
    3. 신체 질량 지 수 (BMI)20 · 체중 (kg)으로 계산 [몸 길이 (m) × 높이 (m)] -1.
    4. 부드럽게 복 부 컨투어 주위 측정 하는 테이프를 배치 고 동물 측정 부정사 위치에.
    5. 아 킬 레 스 힘 줄의 삽입에 무릎 관절의 아래 부분에서 tibial 길이 측정 합니다.

3. 금식 Glycemia 및 정 맥 포도 당 내성 검사 (IVGTT)

참고:이 절차 (즉, 오후 2-3) 하루 중 같은 시간을 시작 하는 것이 좋습니다.

  1. 포도 당 0.9 %NaCl 용액 100 mL에 60 g 포도 당 재고 솔루션 (60%)을 준비 합니다.
  2. 빠른 7 h (식품을 제거 하 고 물 유지), 동물 다음 의식 토끼 restrainer 경향이 위치에 놓습니다. 포도 당 미터 (미터에 새로운 스트립 삽입)을 준비 하 고 가장자리 정 맥이 피 한 방울을 랜 싯을 사용 하 여 왼쪽된 귀에서 첫 번째 샘플을가지고. 다음 테스트 스트립 및 측정 혈액 포도 당 수준을 단식 glycemia을 혈당 측정기를 사용 하 여와 혈액 방울을 터치 합니다.
  3. 일회용 카 테 터 (18-22 G)와 오른쪽 귀 가장자리 정 맥 cannulate 하 고 60% 포도 당 용액 (0.6 g·kg-1) bolus 주사.
    참고: 준비는 bolus, 추가 1 mL/kg의 포도 당.
  4. 포도 당 주입 후 15, 30, 60, 90, 120, 및 180 분에 이르렀다 (한 방울의 피)를 사용 하 여 혈액 샘플을 받아 그리고 3.2에서 포도 당 미터와 분석.
  5. 일회용 카 테 터를 제거 하 고 꼬 집는 거 즈와 카 테 터 삽입의 사이트. 혈액 응고가 되 면 거 즈를 제거 하 고 동물의 상태를 확인 하십시오.

4입니다. 혈압

  1. 압력 트랜스듀서, 0.9와 10 mL 주사기를 포함 한 수집 시스템 준비 %NaCl, 3 방향 자 지, 증폭기, 그리고 (혈압 기록)에 대 한 수집 소프트웨어와 PC/노트북.
  2. 장비를 설정 합니다. 먼저, 3 방향 자 지와 주사기 압력 트랜스듀서는 변환기와 카 테 터, 사이 놓고 압력 변환기 증폭기에 연결 합니다. 다음 PC/노트북에 앰프를 연결 합니다.
  3. 압력 변환기 교정 제조 업체의 권장 사항에 따라 수행 합니다.
  4. 경향이 위치에서 토끼 restrainer에 의식이 있는 동물을 배치 합니다. Cannulation, 전에 귀를 데 우 십시오 다음 붙이기 삽입 사이트 귀에 로컬 마 취 (2.5 %lidocaine / prilocaine)를 적용 합니다. 부드럽게 혈관 패키지 동맥을 쉽게 식별 하기 위해 실행 하는 영역을 누릅니다. 다음 왼쪽된 귀 중앙 동맥에서 (18-22 G) 멸 균 카 테 터를 삽입 합니다. 속박을 느슨하게 하 고 30 분 동안 조용히에 동물 허용.
  5. 직접 동맥 카 테 터, 심장 수준에서 동물 옆에 위치 하는 압력 트랜스듀서 배치에서 20 분 동안 지속적으로 혈압을 기록 (샘플링 주파수: 1khz 그림 5B참조).
    참고: 혈압 (BP) 혈액 응고 간섭에서 무료로 녹음 계속 (BP 신호 진폭 잃거나 사라집니다), NaCl (0.9%) 주사 하 여야 한다. 3-방법으로 자 지를 사용 하 여 카 테 터를 변환기에서 카 테 터, 주사기에서가 회로 열고 1-2 mL를 주사가 회로 닫습니다. 이 카 테 터에 혈전을 형성 수 있습니다을 제거 합니다. 그런 다음 변환기와 카 테 터, 사이 회로 열고 신호 복구 되었습니다 일단 녹음을 계속 합니다.
  6. 녹음 완료 되 면 카 테 터를 제거 하 고 혈액 손실을 중지를 카 테 터 삽입의 사이트에 거 즈와 대 타. 혈액 응고가 되 면 거 즈를 제거 하 고 동물의 상태를 확인 하십시오.

5. 플라즈마 측정

참고:이 절차 (즉, 오후 2-3) 하루 중 같은 시간을 시작 하는 것이 좋습니다.

  1. 빠른 7 h (식품을 제거 하 고 물 유지), 동물 다음 의식 동물 restrainer 경향이 위치에 놓고 왼쪽된 귀 가장자리 정 맥에서 살 균 21 G 바늘을 삽입 합니다. 한 번 혈액 물방울, 첫 번째 드롭 다운 삭제 하 고 EDTA 튜브는 튜브에 표시 된 수준에서 혈액 샘플을 수집 하기 시작 합니다. 얼음에는 샘플을 저장 합니다.
  2. G, 15 분, 4 ° C x 1500에서 혈액 샘플을 원심 원심, 후 한 피 펫을 사용 하 여 플라즈마를 흡입 하 고 250 µ L의 aliquots를 준비 합니다.
  3. 즉시 신선한 샘플을 분석 합니다. 기본 제어 매개 변수는 다음과 같습니다: 중성 지방, 총 콜레스테롤, HDL, LDL 콜레스테롤.
    참고: 샘플 분석 하지 갓-80 ° C 냉장고에 즉시 저장 되어야 합니다. 플라즈마의 샘플에서 혈액 포도 당 분석에 관심이, 혈액 포도 당 시험 EDTA 대신 불 소 수 산 염과 튜브를 사용 해야 합니다.

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결과

메츠의 신진 대사 및 심혈 관계 이상이 그의 연구 실험 모델의 사용에 의해 촉진 될 수 있는 클러스터를 나타냅니다. 실제로, 병 적인 개장 메츠 제작한 기본 메커니즘, 명료 하는 실험 모델을 적절 하 게 인간의 상태를 닮 고, 연구에 적합의 선택은 중요 한 중요성의. 여기, 우리는 토끼의 평가 대 한 다이어트 높은 포화 지방과 자당, 및 자세한 특성을 사용 하 여에서 메츠를 유도 하는 방법을 제시. 유전자 변형된 동물 모델 대신 다이어트의 사용은 매우 중요 때문에 다이어트에 영향을 미치는 전신 대사19, 따라서 닮은 밀접 하 게 인간의 메츠에서 일어나. 우리는 계승 (혼합된 모델)을 사용 ANOVA 두 가지 요소, 하나의 반복된 측정 또는 "내" 요소 (시간: 예약, 14 주, 주 28, 분석에 따라) 한 "사이" 요소 (그룹: 제어와 메츠) 통계 분석을 위해. 의미 받아들여졌다 때 p < 0.05.

...

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토론

적절 한 실험 모델의 설립, 메츠의 개발 연구를 보다 일관 되 고 신뢰할 수 있는 메서드를 제공할 수 있습니다 그리고 그것은 또한 장기 및 리 모델링 하는 시스템의 기반이 되는 기본 메커니즘을 이해 하는 데 필요한. 여기, 다이어트 유발 된 메츠와 신진 대사 및 심혈 관계 이상이이 모델 특징의이 클러스터의 주요 구성 요소를 평가 하는 방법의 관련 실험 모델을 개발 하는 데 사용 하는 방법을 설명: 중앙 비만, 고혈압, 포도 당 옹 졸 그리고 dyslipidemia 낮은 HDL, 높은 LDL와 TG 레벨의 증가.

모델의 큰 힘 앞에 병 리의 임상 발현 상태를 공부 하는 기능입니다. 사실, 신진 대사 변화에 대하여 28 주에 동물 2 형 당뇨병을 개발 하지 않았다 고 prediabetes (그림 4)의 상태에 있었다. 마찬가지로, 플라즈마 생화학 마커 총 콜레스테롤은 동맥 경화 증의 발전에 중요 한 요소는 (표 3<...

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공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

이 작품 Generalitat 발렌시아 (GV2015-062), MZ Universitat 드 València (UV-INV-PRECOMP14-206372), Generalitat 발렌시아 (PROMETEOII/2014/037) 및 기관 드 건배 카를로스 III-페더 자금 (CIBERCV CB16/11/0486) FJC 지원 했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
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