방법 논문

소설 수동 전체 CNS 조직에 광학 투명도의 급속 한 생산을 위한 방법 삭제

DOI:

10.3791/57123

⸱

2018년 5월 8일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3The Spine and Spinal Cord Institute, Biomedical Center, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, 4Columbia University College of Physicians and Surgeons

이 논문에서

요약

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여기, 선물이 두 소설 방법론, psPACT 및 최대 광학 투명성과 조직 맥 관 구조에 그대로 설치류의 후속 현미경 분석을 달성 하기 위한 mPACT 전체 CNS.

초록

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선명도의 개발 이후 기술 삭제 bioelectrochemical 수 있는 3 차원 표현 형 매핑 투명 한 조직 내의 다양 한 큐빅 (명확 하 고 가리지 뇌 이미징 등 새로운 개간 방법론에 대 한 칵테일 및 전산 분석), 스위치 (상호 작용 시간의 시스템 제어) 및 화학 제품의 활동, 지도 (확대는 프로테옴의 분석), 및 협정 (수동 선명도 기술)에 대 한 기존의 툴킷 확대 설립 되었습니다 생물학 직물의 현미경 분석입니다. 현재 향상 하 고 전체 중앙 신경 시스템 (CNS), 신장, 비장, 그리고 전체 마우스 배아를 포함 하 여 그대로 설치류 조직의 배열에 대 한 원래 협정 절차를 최적화 하는 것을 목표로 공부 합니다. PsPACT (프로세스 별도 협정) 및 mPACT (수정 된 협정) 되 나, 이러한 소설 기법 셀 회로 고 그대로 정상 및 병 적인 조직에서 subcellular 구조 시각화의 높은 효능 수단을 제공 합니다. 다음 프로토콜에서 우리는 psPACT 및 mPACT 통해 그들의 구조적 무결성의 최소한의 침공으로 최대한 조직 허가 달성 하는 방법에 세부, 단계별 개요를 제공 합니다.

서론

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과학 및 임상 조회의 근본적인 목적은 관련 기관의 구조와 기능;의 완벽 한 이해를 달성 그러나, 포유류 장기의 상당히 복잡 한 자연 완전히이 목표1을 달성 하는 방 벽으로 수시로 제공 합니다. 명확성 (명확한 지질 교환 아크릴 때 교배 엄밀한 이미징 호환 Tisssue-하이드로 겔)2,3,4, 건물 그대로 조직에서 히드로 아크릴 기반 하이브리드 포함, 달성 다양 한 기관, 뇌, 간, 그리고 비장를 포함 하 여5그들의 구조적 무결성 유지 하면서 광학 정리. 선명도 시각화 뿐만 아니라 복잡 한 셀룰러 네트워크 및 단면 필요 없이 조직 형태학을 정밀 하 게 해 부를 기회에 따라서 사용할 수 있습니다.

조직 허가 달성 하기 위해 선명도 샘플의 지질 콘텐츠 제거 하 전기 이동 방법을 사용 합니다. 물리적으로 안정적인 조직-히드로 하이브리드 생산에 대 한 선명도 지적 하는 동안 연구 전기 이동 조직 개간 (등) 방법의 사용 조직 품질, 브라우닝, epitope 손상을 포함 한 변수 결과 산출 하 고 단백질 손실5,6. 이러한 문제를 해결 하려면 수동, 이온-세제 기반된 delipidation 기술 등 치료를 대체 하는 협정 (수동 선명도 기술) 등 수정된 프로토콜 개발된7,,89되었습니다. 그러나 결과에 더 일관성을 달성에 불구 하 고, 협정 최대한 정리를 얻기 위해 더 많은 시간이 필요 합니다. 또한, 이러한 기술의 아무도 아직 적용 되었을 전체 CNS 양식 또는 쥐 및 기니 피그와 같은 큰 설치류 모델.

현재 연구는 psPACT (프로세스 별도 협정) 및 mPACT (수정 된 협정), 전체 CNS와 마우스와 쥐 모델10에 내부 장기의 빠른 통관을 촉진을 위한 새로운 방법론을 제안 하 여 이러한 한계를 해결 하고자 합니다. 특히, psPACT 처리 조직 4% 아크릴에 0.25% 하이드로 겔 형성; 하는 동안 두 개의 별도 단계에서 버지니아-044 mPACT는 기본적으로 동일한 단계를 수행 하지만 키 시 약으로 서 0.5% α-thioglycerol와 개간 SDS 기반 솔루션을 보완. 두 기술을 마구 크게 광학 클리어런스를 생산 하는 데 필요한 시간을 줄이기 위해 내 생 적인 조직 및 cerebrospinal 순환 시스템. 원리의 증거로, 허가 조직10혈관 패턴 분석에 confocal 현미경 검사 법의 사용을 설명 합니다.

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프로토콜

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모든 절차는 연 세 대학 의과대학에서 적절 한 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 연 세 대학 대학의과 대학에 실험실 동물 관리 위원회의 지침에 따라 모든 실험 동물을 희생 한다.

1입니다. 시 약의 준비

주의: Paraformaldehyde (PFA), 아크릴 및 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 독성 irritants 이며 따라서 적절 한 개인 보호 장비 (PPE; 실험실 외 투, 장갑, 보호 안경)와 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.

  1. 4% 아크릴 (금주 모임) 솔루션 (A4P0): 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 180 ml 40% 아크릴 솔루션의 20 mL를 추가.
  2. 0.25% 버지니아-044 솔루션: 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane의 0.5 g 추가] dihydrochloride (VA-044) 파우더 200 mL의 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를. 버지니아-044 분말은 실내 온도에 저장 될 수, 그러나 PBS에 가용 화 시 4 ° C에 저장 되어야 합니다. 최상의 결과 얻으려면 솔루션 실험에 필요한 만큼만 준비 합니다.
  3. 협정 칵테일 솔루션: 4 %paraformaldehyde (PFA) 솔루션의 225 mL에 아크릴의 10 g를 추가 하 고 4%와 200 mL에 양을 맞추십시오 PFA. 사용 전에 40 ml 50 mL 원뿔 튜브에 혼합물의 버지니아-044 분말의 100 mg을 추가 합니다.
  4. 협정 솔루션 버퍼 지우기: 0.1 M PBS의 350 mL에 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)의 40 g을 추가 하 고 0.1 M PBS 가진 500 mL에 양을 맞추십시오. MPACT 삭제 솔루션, 솔루션 버퍼를 삭제 하는 협정에 0.5% α-thioglycerol를 추가 합니다.
  5. 이 연구에 사용 된 마우스 했다 2 주 된 BALB 남성 쥐; 이 연구에 사용 된 쥐 2 주 오래 된 남성 SD-쥐 했다.

2. 마 취와 관류 수술

주의: PFA와 아크릴 독성 irritants 이며 따라서 적절 한 보호구와 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.

  1. 26-게이지 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여 zoletil의 30 mg/kg으로 병원 체 무료 객실에 동물 anesthetize 5 동물 모니터링-10 분.
  2. 동물 마 취의 수술 평면에 도달 했습니다, 일단 마 취의 깊이 결정 하는 발가락 핀치 응답 메서드를 사용 합니다. 응답을 확인 합니다.
    주: 마우스와 쥐 수술을 포함 하는 다음 단계 이전 연구11에 사용 되는 유사한 프로토콜을 따릅니다.
  3. 5-6 cm 절 개 외피와 복 벽을 통해 흉 곽 아래를 확인 합니다.
  4. 곡선, 무딘가 위를 사용 하 여 미리 절 개의 사이트를 찾으려고 흉부 지역 palpating 횡 경 막에 절 개를 만들기 위해.
  5. 절 개 흉 흉 막 캐비티를 폭로 전체 길이 걸쳐 확장.
  6. 조심 스럽게 폐 치환. 쇄 골까지 흉 곽을 통해 상처를 확인 합니다. 아이리스가 위를 사용 하 여, 좌 심 실의 후부 끝에 작은 절 개를 확인 합니다. 오름차순 대동맥, 컷된 심 통과에 무뚝뚝한 또는 올리브 밀고 관류 18 게이지 바늘을 삽입 합니다.
  7. 바늘을 장악 하 고는 hemostat로 마음을 클램핑 하 여 누설을 방지. 또는, 수정된 hemostat 사용 하 여 바늘 팁 주위 대동맥을 클램프.
  8. 오른쪽 아 트리 움, 하강 대동맥에 최소한의 피해를 보장 하기 위해 돌에 큰 절 개를 확인 합니다. 쥐 관류에 대 한 준비가 지금 이다.

3. 전체 관류와 쥐의 해 부

주의: PFA와 아크릴 독성 irritants 이며 따라서 적절 한 보호구와 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.

참고: 다음 전체 관류 단계는 비슷합니다 우 외에 의해 이전 연구에서 사용 되는 프로토콜. (2016) 10 , 11.

  1. 심장의 오른쪽 아 트리 움 어떤 기포를 소개 하지를 돌보는 18 게이지 주사 바늘에 연결 합니다.
  2. 50 mL 주사기를 사용 하 여, 신속 하 고 균일 하 게 감기 0.1 M PBS 솔루션 포함 하는 헤 파 린 (10 단위/mL)의 50 mL 펌프.
  3. 연동 펌프 튜브에 18-게이지 바늘을 연결 합니다.
  4. 10 mL/min의 순환 속도에 헤 파 린 (10 단위/mL)에 포함 된 감기 0.1 M PBS 솔루션의 200 mL와 함께 씻으십시오.
  5. 10 mL/min의 순환 속도에 찬 4 %PFA 솔루션의 250 mL와 함께 수정. 쥐가이 단계에서 뻣 뻣 한 되어야 합니다.
  6. 수집 하 고 처리를 위한 나머지 PFA 솔루션을 저장 합니다.
  7. 협정, 4 %PFA, 4% 아크릴, 및 0.25% 버지니아-044 분말의 냉장 협정 칵테일 솔루션 조직 18 게이지 바늘, perfuse 및 머리와 척추를 제거. 코에는 목에서 정중 선 절 개 하 여 두개골을 노출 합니다. 이 추가 관류 단계 psPACT와 mPACT 방법;에 대 한 필요 하지 않습니다. 고정, 후 즉시 머리와 척추를 분리 하 고 두개골을 노출.
  8. 어떤 잔여 목과 척추 근육을 제거 하 여 두개골의 기지를 노출 합니다.
  9. 벗 겨 두개골을 rongeurs와가 위를 사용 합니다. 뇌와 척수를 제거 합니다.
  10. 4%에서 조직 저장 PFA 4 ° c; 조직 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다.

4. 하이드로 겔 단위체 주입 및 쥐 및 마우스 CNS의 중 합

주의: 아크릴, SDS, α-thioglycerol 및 PFA irritants 있으며 따라서 처리 연기 후드와 적절 한 오 줌.

  1. 협정 (패시브 기술 삭제)
    1. 분리 하 고 전체 CNS (뇌와 척수) 고정된 쥐 및 쥐에서 냉장된 협정 칵테일 4 %PFA, 4% 아크릴, 및 0.25% 버지니아-044 분말 및 24 h. 확인 조직 s에 완전히 몰입은 4 ° C에서 스토어의 솔루션을 포함 하는 50 mL 튜브에 문화 olution입니다.
    2. 10 분 휴지를 사용 하 여 젤 질소 탱크에 연결 된 하이브리드 시스템에 대 한 질소 가스에 샘플을 포함: 37 ° c 시스템 설정 신선한 냉 (4 ° C) 협정을 포함 하는 50 mL 튜브에 조직 전송 칵테일 솔루션 관 모자, 연결한 다음 진공에 설정.
    3. 유해는 하이드로 겔, 3 h, 또는 중 합 완료 될 때까지 떨고 인큐베이터 (150 rpm, 37 ° C)에서 샘플을 포함 하는 튜브를 배치 합니다.
    4. 압 지를 사용 하 여 (참조 테이블의 자료), 제거 나머지 polymerized 히드로 조직을 둘러싼.
    5. 50 mL 튜브 청소 솔루션 (0.1 m M PBS, pH 8.0에서에서 8 %SDS)를 포함 하는 조직 전송.
    6. 조직 삭제 되었습니다 때까지 37 ℃, 150 rpm으로 설정 떨고 인큐베이터에서 샘플을 놓습니다. 평균적으로, 그것은 전체 선명도 달성 마우스 CNS 약 20 일 걸립니다.
  2. psPACT (별도 수동 삭제 기술 처리)
    1. 뼈 절단기와 PFA-고정 마우스와 깨끗 한 벤치에 쥐가 위 전체 CNS (뇌와 척수)를 격리 합니다.
    2. 조직 전송 50 mL 튜브 4% 포함 된 PFA, 및 24 h. 4 ° C에서 저장소 확인 조직은 정착 액에 완전히 잠기 다.
    3. 0.1 m M PBS에서 1 시간에 대 한 고정된 조직을 세척 하 고 A4P0 솔루션 (0.1 m M PBS에 4% 아크릴)을 전송. 24 h에 대 한 37 ° C에서 저장소.
    4. 0.1 m M PBS에 씻어 5 분에 대 한 조직.
    5. 0.25%에서 조직 담가 0.1 M PBS에 버지니아-044. 6-24 h, 37 ° C에서 저장 하 고 신선한 0.25% 버지니아-044/PBS 솔루션을 전송.
    6. 10 분 휴지를 사용 하 여 젤 교 잡에 대 한 질소 가스에 샘플을 포함 질소 탱크에 연결 ( 테이블의 자료를 참조) 시스템: 조직 신선한 감기 (4 ° C)를 포함 하는 50 mL 튜브에 전송 0.25% 버지니아-044/PBS 솔루션, 튜브 캡과 연결. 진공을 켭니다.
    7. 전송 하는 조직 솔루션 (0.1 m M PBS, pH 8.0에서에서 8 %SDS) 삭제.
    8. 조직 삭제 되었습니다 때까지 37 ℃, 150 rpm으로 설정 떨고 인큐베이터에서 샘플을 품 어. 평균적으로, 그것은 마우스 전체 선명도 달성 하는 CNS에 대 한 약 17 일 걸립니다.
  3. mPACT (수정된 수동 삭제 하는 기법)
    1. 뼈 절단기와 PFA-고정 마우스와 깨끗 한 벤치에 쥐가 위 전체 CNS (뇌와 척수)를 격리 합니다.
    2. 단계-4.2.2 4.2.8 psPACT 프로토콜의 수행 합니다.
    3. 전송 하는 조직 솔루션을 지우기. 협정 및 psPACT 프로토콜 달리 mPACT 0.5% α-thioglycerol 0.1 M PBS, pH 8.0에서에서 8 %SDS 이외에 구성 된 개간 솔루션이 필요한 note. Α-thioglycerol는 더 신속 하 고 효과적으로 조직을 취소 하는 데 도움이 유엔 브라우닝 에이전트. 조직의 솔루션에 완전히 포장 되어 있는지 확인 합니다.
    4. 조직 삭제 되었습니다 때까지 37 ℃, 150 rpm으로 설정 떨고 인큐베이터에서 샘플을 놓습니다. 평균적으로, 그것은 마우스 전체 선명도 달성 하는 CNS에 대 한 약 2 주 걸립니다.

5. 굴절률 매칭과 허가 CNS의 Immunostaining

참고: n바퀴 (Nycodenz 기반 굴절률 매칭 솔루션) 0.8 g/mL Nycodenz 분말 30 mL 기본 버퍼 (0.01% 나트륨 아 지 드와 0.1 m M PBS, pH 8.0에서에서 트윈-20)에 녹아 있는 이루어져 있다. 솔루션 파우더의 적절 한 solvation 수 있도록 인큐베이터 떨고 37 ° C에 배치 하는 것이 좋습니다.

  1. 0.1%에서 조직 품 어 2 h, 0.1 m M PBS에 Triton X-100 다음 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 0.1 m M h 6에 대 한 PBS에와 차단.
  2. PBST에 세 번 섹션을 세척 (0.1 %0.1 M PBS에 트윈-20) 2 헤에 대 한 일에 대 한 섹션 주요 항 체 (이 경우, 혈관 얼룩는 반대로 토끼 PECAM CD31 항 체)에 얼룩.
  3. 2 일에 대 한 2 차 항 체 (이 경우는 염소-토끼 IgG Cy3 형광 공액)에 2 %BSA 섹션을 얼룩.
  4. 워시 분류 2 h, PBST에 세 번 조직 및 저장소 15 ml에서 n바퀴 2-10 일.
  5. 이미징, 전에 35 또는 60 m m 조직 문화 접시에 레이블이 조직 n바퀴의 작은 금액을 이동 합니다. 접시의 아래쪽 가장자리 주위 실리콘 수정.
  6. 신선한 n바퀴의 1.5-2 mL를 추가 합니다.

6. 이미지 처리

  1. 타일 confocal 레이저 스캐닝 microscopewith 10 배 확대를 사용 하 여 검색 이미지 삭제 조직의 취득 ( 재료의 표참조). 조직 Cy3 표시의 사용 하 여 550-600 nm의 파장.

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결과

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최적화 된 수동 청소 기술을 사용 하 여 전체 CNS의 투명 한 모델의 생성

마우스와 쥐 전체 CNS 조직의 광 정리 빠른 속도로 다양 한 수동 개간 기법 (그림 1)를 사용 하 여 달성 되었다. 조직 시간이 지남에 비운의 회로도 그림 2A에 표시 됩니다. 원래 협정 메서드와 달리 psPACT (프로세스 별도 협정) 히드로 하이브리드를 형성 하기 위하여 4% 아크릴 아 미드 (A4P0)와 0.25% 버지니아-044 초기자 솔루션 샘플을 두 개의 별도 단계에서 치료 포함 됩니다. mPACT (수정 된 협정) psPACT 8 %SDS 지우기 0.5% α-thioglycerol 솔루션을 보완 하 여 더욱 향상 시켰습니다. 협정, ps...

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토론

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수동, 전기 이동 비 추출 방법에 고용 하는 동안 협정 크게 이전 조직 삭제 선명도2,3,,47 같은 방법으로 달성 일관성 향상 , 8, 기술은 여전히 가장 눌러 최대한 조직 선명도12를 달성 하는 데 필요한 시간의 길이 여러 가지 단점을 맺는 다. 현재 연구에서 선물이 조직 조직 무결성 및 구조6,10유지 하면서 지우기에 필요한 시간을 크게 줄일 수정된 협정 프로토콜. 또한, 처음으로 우리 조직의 전체 CNS 조직 및 더 높은 순서 설치류 모델 쥐10...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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이 작품은 두뇌 한국 21 플러스 프로젝트 의료 과학, 연세대에 지원 됩니다. 또한,이 작품은 국립 연구 재단의 한국 (NRF-2017R1D1A1B03030315)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)Affymetrix, Inc.75819클리어링 솔루션
NycodenzAxia-Shield1002424nRIMS 솔루션
40% 아크릴아미드 솔루션Bio Rad Laboratories, Inc.161-0140중합 (A4P0)
2,2´ -Azobis [2- (2- 이미다 졸린 -2- 일) 프로판] 디 하이드로 클로라이드Wako Pure Chemical Industries, Ltd.017-19362중합 (VA-044)
1-ThioglycerolSigma-AldrichM1753-100ML세정 용액 (mPACT)
Tween-20Georgiachem9005-64-5nRIMS 용액
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ML면역 염색
소 혈청 알부민 (BSA)BovogenBSA100면역 염색
헤파린Merck, Millipore, 375095Perfusion (PBS)
Sodium azide, Sigma-AldrichS2002-25GnRIMS solution
PECAM-CD31 항체Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-28188면역 염색
염소 항 토끼 -IgG Cy3 형광 접합체Jackson ImmunoResearch Inc.111-165-003면역 염색
4% 파라포름알데히드Tech & 혁신BPP-9004관류, 중합
20X 인산염 완충 식염수(pH 7.4)기술 및 혁신BPB-9121관류, 버퍼
10mL 스트라이프렛Coatar4488용액 전송
50mL 튜브Falcon352070투명 튜브
35mm 세포 배양 접시SPL20035이미징
컨포칼 접시SPL211350이미징
1mL 주사기한국 백신 (주26G 1/2마취 
50mL 주사기Korea vaccine Co., Ltd21G1 1/4관류
아크릴아미드Sigma-AldrichA3553중합(A4P0)
Whatman 3MM 종이Sigma-AldrichZ270849젤 제거용 블로팅 페이
컨포칼 현미경ZeissLSM780이미징
ZEN lite 소프트웨어ZeissZEN 2012이미징
연동 펌프LongerpumpBT100-1FPerfusion
EasyGel LifecanvasTechnologiesEasyGelTissue gel hybridization system
, , , , ) 퍼

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  11. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  12. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
  13. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  14. Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Exp Mol Med. 46, 75(2014).
  15. Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53(2013).
  16. Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
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