방법 논문

심사에 생체 외에서 국물 Microdilution: 새로운 항진균 성 화합물을 감지 하는 쉽고 빠른 방법

DOI:

10.3791/57127

⸱

2018년 2월 14일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Biology, Department of Cellular Biology, Institute of Biological Sciences, University of Brasília, 2Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 4Faculty of Ceilândia, University of Brasília

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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항진균 성 화합물 및 추출 물 심사는 간단 하 고 융통성 있는 국물 microdilution 방법입니다.

초록

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곰 팡이 감염 마지막 십 년간에 중요 한 의료 상태 되 있지만 사용 가능한 항진균 약물의 수는 제한. 이 시나리오에서는 새로운 항진균 약물에 대 한 검색이 필요 합니다. 여기 보고 프로토콜 화면 펩 티 드 그들의 항진균 속성에 대 한 방법을 자세히 설명 합니다. 그것은 잠재적인 새로운 antifungals로 항균 성 펩 티 드의 연구에 맞게 수정 임상 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침에서 국물 microdilution 자화 율 시험을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 항진균 성 화합물의 활동을 평가 하는 기능 분석 결과 설명 하 고 조사 분자의 특정 클래스에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다. 분석 실험 96 잘 접시 작은 볼륨을 사용 하 여 수행 됩니다, 이후 대규모 심사 자동화 환경에서 실시 하는 경우에 특히 시간, 짧은 시간에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 표준화 되 고 조정 가능한 임상 프로토콜 곰 팡이 질병의 치료를 개선 하기 위해 새로운 분자의 벤치 작업 추구를 도울 수 있는 방법를 보여 줍니다.

서론

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곰 팡이 감염 되는 중요 한 의료 우려 최근 수십 년간, 상당히 immunocompromised 개인 등 암 치료 및 HIV/에이즈와 함께 사는 사람들의 숫자에 있는 상승 때문에 주로 증가 하는 데 또는 이식 장기1,2. 그러나, 매우 제한 된 배열 사용 가능한 항진균 약물의과 그들에 게 곰 팡이 저항에 대 한 보고서의 증가 조직의 사상 균 병3의 치료제에 관한 주요 문제에 기여.

새로운 항진균 성 화합물의 항균 성 펩 티 드 (암페어), 작은 양이온 펩 티 드 감염4그들의 타고 난 면역 반응의 일환으로 많은 유기 체에 의해 생산 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 심사 방법 곰 팡이 병원 균에 대 한 이러한 화합물을 테스트 하는 표준화 되지. 다른 절차 때때로 동일한 모델 미생물5,,67에 대 한 앰프의 항진균 활동을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 차이 부족의 일부 프로토콜 세부....

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프로토콜

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1. 솔루션 및 미디어

  1. 2 X 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), Sabouraud 포도 당 국물, 및 표 1에 의하여 Sabouraud 포도 당 한 천 준비.

2. 균 Inoculum 성장 조건

  1. 필요할 때까지-80 ° C에서 35% 글리세롤에 냉동된 주식으로 모든 곰 팡이 긴장을 저장 합니다.
  2. 각 실험 하기 전에 다음 단계를 수행 합니다.
    1. Candida albicans 종자에 대 한:
      1. 재고 유리병을 해 동 하 고 동요 (200 rpm)와 30 ° C에서 하룻밤 문화와 모자 살 균 50ml 폴 리 프로필 렌 튜브에 Sabouraud 포도 당 국물의 10 mL를 200 µ L를 전송. 튜브를 경사 하 고 열어두고 뚜껑 약간 문화의 더 나은 통 기 통풍을 기억 하십시오.
    2. 대 한 Cryptococcus neoformans 긴장:
      1. 재고 유리병의 얼어붙은 표면 다쳤어요. 플레이트 Sabouraud 포도 당 한 천 배지 위에 셀 및 48 h 30 ° c.에 대 한 품 어 고립 된 식민지의 성....

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결과

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마이크는 완전히 잠복기의 끝에 보이는 곰 팡이 성장을 억제 하는 최저 항균 화합물 농도로 정의 됩니다. 반면 탁도 부정/성장 제어 웰 스에 유사한 어떤 잘 분명 미디어 빈 우물에 유사한 어떤 잘 긍정적인 결과 여겨진다이 프로토콜의 목적은 화면 잠재적인 antifungals 빠른 방법 이므로, 부정적인 것으로 간주. 그러나, 주어진된 앰프 fungistatic 또는 살 진 균 인지 알고에 관심이 있는 경우에, 긍정적인 우물에서 미디어 또한 수 Sabouraud 포도 당 한 천에 도금 하거나 또 다른 생존 능력 테스트로 확인.

주어진 소설 화합물의 행동의 메커니즘은 알려진, 그것 따라서 필수적입니다 경우 참조 항진균 이루어졌고 예상된 범위는 곰 팡이 분리 (확인 공식 지침, 테이블, 또는 문학에서 데이터)을 검사 하기 전에 대 한 확인 하는 (이 경우, 앰프;에 화합.......

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토론

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Microdilution 테스트는 화합물, 화합물의 소량을 사용 하 여 대상의 잠재적인 항진균 성 활동을 분석 하 고 동시에 농도의 범위에서 테스트 수 있습니다. 이 따라,이 프로토콜은 잠재적인 새로운 항진균 성 화합물에 대 한 심사의 첫 번째 단계도 권장 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 처음 클리닉, 항진균 치료의 선택에 도움을 설계 되었습니다 M27-A3 프로토콜에 기반은 그리고 새로운 항진균 성 화합물의 다양 한 적응 수 있습니다. 전반적으로,이 프로토콜은 추출 물 또는 화합물의 물리 화학적 기능에 집중할 수 있습니다. 예를 들어 분석 결과에서 잠재적인 후보 나타날 수 있습니다 잘못 효과 미디어에서 화합물 Histatin 514RPMI의 효과 같은 곰 팡이 세포와의 상호 작용을 차단할 수 있습니다. 이 경우에 RPMI 방해 하는 경우에 대 한 대체 매체 MOPS pH 715효 질소 기지 (YNB) 버퍼입니다.

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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우리는 망 토-브라질, CNPq-브라질, FAP/DF 재정 지원에 대 한 감사합니다. 우리는 수정 원고에 대 한 박사 휴고 코스타 Paes에 감사입니다.

....

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재료

장비 및 기타 재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Media and Reagents
RPMI 1640 medium, with l-glutamine, without sodium bicarbonateThermo Fisher31800-022
3-(N-morpholino) 프로판 설폰산 (MOPS) (o que a gente usa tem um só DIO, Completa o Nome Dele Please)Sigma-Aldrich2X RPMI 중간
염화나트륨 (NaCl)Dinâ를 버퍼링하는 데 사용; 운모1528-1인산염 완충 식염수(PBS)용 137mM,
염화칼륨(KCl)J.T.Baker3040-01인산염 완충 식염수(PBS)용 2.7mM,
인산나트륨 이염기성(Na2HPO4),인산염 완충 식염수(PBS)V000129 10mM, 인산
수소 인산칼륨(KH2PO4),Sigma-Aldrich602302mM
BD Difco Sabouraud 포도당 육수BD238230
BD Difco Sabouraud 포도당 한천BD210950
글리세롤시그마-알드리치V00012335% for (soluç &물결표; o de estoque? 크리오프레세르바ç &물결표; o?)
메마른 물Para diluiç &물결표; o das drogas na diluiç &물결표; o seriada
항진균제
Amphotericin BSigma-AldrichA2942
FluconazoleSigma-AldrichF8929
CaspofunginSigma-AldrichPHR1160
Plastics
50 mL 원뿔형 튜브Sarstedt62.547.254
접시 페트리J.Prolab0304-5
96 웰 플레이트Corning3595
멸균 용액 저장소KASVIK30-208
광학 현미경Nikon을 사용하여 용액을 파이펫하는 데 사용E200MV
원심Thermo FisherMegaFuge 16R
인큐베이터Ethik Technology403-3D는 37°C로 설정합니다. C
셰이커뉴브런즈윅 사이언티픽엑셀라 E2537°C로 설정; C, 200 RPM
셀 계수 챔버, NeubauerBOECO GermanyBOE 13
멀티채널 피펫HTL5123
이 인산염 완충 식염수(PBS)용 다중 채널 피펫분리기

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
  2. Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
  3. Pfaller, M. A.

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재인쇄 및 허가

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허가 요청

태그

CLSI M27 A396

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