심사에 생체 외에서 국물 Microdilution: 새로운 항진균 성 화합물을 감지 하는 쉽고 빠른 방법

요약

항진균 성 화합물 및 추출 물 심사는 간단 하 고 융통성 있는 국물 microdilution 방법입니다.

초록

곰 팡이 감염 마지막 십 년간에 중요 한 의료 상태 되 있지만 사용 가능한 항진균 약물의 수는 제한. 이 시나리오에서는 새로운 항진균 약물에 대 한 검색이 필요 합니다. 여기 보고 프로토콜 화면 펩 티 드 그들의 항진균 속성에 대 한 방법을 자세히 설명 합니다. 그것은 잠재적인 새로운 antifungals로 항균 성 펩 티 드의 연구에 맞게 수정 임상 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침에서 국물 microdilution 자화 율 시험을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 항진균 성 화합물의 활동을 평가 하는 기능 분석 결과 설명 하 고 조사 분자의 특정 클래스에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다. 분석 실험 96 잘 접시 작은 볼륨을 사용 하 여 수행 됩니다, 이후 대규모 심사 자동화 환경에서 실시 하는 경우에 특히 시간, 짧은 시간에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 표준화 되 고 조정 가능한 임상 프로토콜 곰 팡이 질병의 치료를 개선 하기 위해 새로운 분자의 벤치 작업 추구를 도울 수 있는 방법를 보여 줍니다.

서론

곰 팡이 감염 되는 중요 한 의료 우려 최근 수십 년간, 상당히 immunocompromised 개인 등 암 치료 및 HIV/에이즈와 함께 사는 사람들의 숫자에 있는 상승 때문에 주로 증가 하는 데 또는 이식 장기^1,2. 그러나, 매우 제한 된 배열 사용 가능한 항진균 약물의과 그들에 게 곰 팡이 저항에 대 한 보고서의 증가 조직의 사상 균 병³의 치료제에 관한 주요 문제에 기여.

새로운 항진균 성 화합물의 항균 성 펩 티 드 (암페어), 작은 양이온 펩 티 드 감염⁴그들의 타고 난 면역 반응의 일환으로 많은 유기 체에 의해 생산 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 심사 방법 곰 팡이 병원 균에 대 한 이러한 화합물을 테스트 하는 표준화 되지. 다른 절차 때때로 동일한 모델 미생물^5,,67에 대 한 앰프의 항진균 활동을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 차이 부족의 일부 프로토콜 세부 화합물 및 저해 재현성 사이 비교를 복잡 하 게.

새로운 약 후보자의 테스트를 표준화 하기 위한 한 가지 방법은 항진균 민감성은 임상 등 임상 설정에서 정의 하는 데 사용 하는 지침 및 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침입니다. 그러나, 이러한 antifungal 감도 테스트 너무 제한적 그리고 받지 않습니다 고려 대사에서 변화에 종에 걸쳐 그들은 단지 몇 가지 선택 에이전트에 대 한 설립 했다. 예를 들어 그들은 할 고려 하지 계정 비 발효 효 모에의 대사 요구.

이 프로토콜 잠재 항진균 성 화합물의 활동의 평가 허용 하 고 항진균 펩 티 드에 대 한 검색에 대 한 여기에 구현 됩니다. 그것은 국물 microdilution 새로운 화합물^8,9의 심사를 최적화 하는 수정 CLSI M27-A3 지침에서 시험 기반으로 합니다. 이러한 변경 내용은 컨트롤로 참조 antifungals 사용 하 여 결과 표준화 하는 동안 최적의 사전 테스트 성장 위한 소량의 화합물, 온도 또는 초기 inoculum와 다른 미디어를 사용 하 여 허용 합니다. 다 잘 배양 배지를 사용 하 여이 방법을 신속 하 고 안정적으로 화면 화합물의 많은 수를 가능 하 게.

그것의 고유의 유연성으로 인해이 프로토콜 및 몇 가지 각 색으로 다른 미생물에 대 한 화합물의 다른 화학 클래스와 함께 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 솔루션 및 미디어

1. 2 X 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), Sabouraud 포도 당 국물, 및 표 1에 의하여 Sabouraud 포도 당 한 천 준비.

2. 균 Inoculum 성장 조건

1. 필요할 때까지-80 ° C에서 35% 글리세롤에 냉동된 주식으로 모든 곰 팡이 긴장을 저장 합니다.
2. 각 실험 하기 전에 다음 단계를 수행 합니다.
   1. Candida albicans 종자에 대 한:
      1. 재고 유리병을 해 동 하 고 동요 (200 rpm)와 30 ° C에서 하룻밤 문화와 모자 살 균 50ml 폴 리 프로필 렌 튜브에 Sabouraud 포도 당 국물의 10 mL를 200 µ L를 전송. 튜브를 경사 하 고 열어두고 뚜껑 약간 문화의 더 나은 통 기 통풍을 기억 하십시오.
   2. 대 한 Cryptococcus neoformans 긴장:
      1. 재고 유리병의 얼어붙은 표면 다쳤어요. 플레이트 Sabouraud 포도 당 한 천 배지 위에 셀 및 48 h 30 ° c.에 대 한 품 어 고립 된 식민지의 성장을 볼 수, 후 최대 15 일 동안 파라핀 필름으로 밀봉 냉장고 (4 ° C)에 번호판을 유지.
      2. 메 마른이 쑤 시 게 또는 살 균 접종 루프를 사용 하 여 접시에서 중간 크기의 고립 된 식민지를 수집 하 고 살 균 50 mL 원뿔 튜브에서 Sabouraud 포도 당 국물의 10 mL를 접종. 동요 (200 rpm)에서 30 ° C에서 약 24 h에 대 한 품 어.
      3. 24 시간 보육을 초과 하지 마십시오. 튜브를 경사 하 고 열어두고 뚜껑 약간 더 나은 통 기 통풍을 기억 하십시오. 그것은 항상 좋은 항균 성 저항에 영향을 미치는 중요 한 요소 이므로 각 테스트 전에 세포의 성장 단계를 표준화.
         참고: 두 균 급속 한 전파, 우리의 실험에서 30 ° C에서 성장 했다 하지만 온도 예 임상 치료 (37 ° C) 연구의 목적에 맞게 변경할 수 있습니다. 가장 중요 한 것은,이 초기 보육 시간 미리 각 균 분리 설립 한다 고 재현성을 보장 하기 위해 모든 테스트를 통해 유지.
3. 곰 팡이 성장 후 실 온에서 5 분 동안 1200 x g에서 원뿔 관 centrifuging 여 세포를 수집 합니다. 삭제는 상쾌한 고 PBS의 10 mL를 추가 합니다.
4. 실 온에서 5 분 동안 1200 x g에서 세포와 원심 분리기 다시 resuspend.
5. PBS 세척 및 원심 분리 두 번 더 반복 합니다. 3 세척 후 2 X RPMI-1640 매체의 (에 따라 펠 릿 크기) 5 mL에 셀 resuspend.
6. Microcentrifuge 튜브 (에 따라 세포 현 탁 액의 탁도)에서 1: 100 또는 1:1,000 희석의 1 mL를 준비 합니다.
7. 이 희석의 aliquot 10 µ L 그것 hemocytometer 챔버에 놓고 현미경은 4 개의 코너 사분면에 셀의 총 수를 계산 합니다. 농도 계산 하는 수식으로: (총 셀 수/4) x 희석 요인 x 10⁴ (챔버 희석 상수).
   1. 가능성 조사 및 성장 조건을 체계적으로 공부 되 고 격리에 대 한 상관 되었다 있다 100% 생존 능력을 고려 합니다.
      참고: 표준화 및 품질 관리의 생존 할 수 효 모^{10에 대 한 항균 성 자화 율 테스트 (EUCAST) 항진균 최소 억제 농도 (MIC) 방법에 유럽 위원회에 따라에서 다시 도금} .
   2. 성장/생존 상관 관계 연구 분리에 대 한 설립 되지 않았습니다, phloxine B¹¹, trypan 블루 ^{등 죽은 세포를 선택적으로 색상 염료의 도움으로 hemocytometer 라이브 셀을 계산 하 여 곰 팡이 생존 능력을 측정 12}, 야누스 그린¹³또는. 이 프로토콜에 대 한 곰 팡이 세포를 사용 하 여 경우에이 시점에서 인구의 생존 능력은 90% 이상.
      참고: 죽은 살아 있는 염료 선택의 균 류와 함께 잘 작동 하지 않을 수 있습니다. 제발 그들을 사용 하기 전에 테스트 합니다. 예를 들어 trypan blue 염료 C. neoformans와 함께 잘 작동 하지 않습니다.
8. 그 후, 2 X RPMI-1640 중간에 셀 정지 준비 (2 X 조정 inoculum RPMI 1640 매체에서). 96 잘 접시 각 접시 5 mL의 볼륨을 고려 하십시오.
   1. 모든 C. albicans 변종에 대 한 4 x 10³ 셀/mL의 재고 세포 현 탁 액을 준비 합니다. 이 농도 각 음 (2 x 10³ 셀/mL)에서 최종 셀 농도의 2 배입니다.
   2. C. neoformans 변종에 대 한 셀 2 × 10⁴ 셀/mL의 사진 문화를 준비 합니다. 이 농도 각 잘 (1 x 10⁴ 셀/mL)에서 최종 셀 농도 두 번.
   3. 다른 버섯에 대 한 어떤 농도 부 화 시간에 관하여 특정 연구에 대 한 이상적인 것 알려진된 항진균 테스트. 곰 팡이의 물질 대사 및 복제 시간 고려해 서.

3입니다. 펩 티 드 (알 수 없는 에이전트)

1. -20 ° C에서 동결 건조 된 펩 티 드를 저장 하 고 각 실험 전에 이온된 수에 그들을 분해. 최대 저장 시간 한 번 물속에에서 녹아 있는 각 펩 티 드의 성격에 따라 달라 집니다.
2. 두 번 분석 결과 (2 배)에 테스트 높은 최종 농도의 aliquots을 준비 합니다. 이상적으로, freeze-thaw 주기를 피하기 위해 사용 하는 한 시간에 대 한 충분 한 펩 티 드와 aliquots의 작은 수를 준비 합니다.
   참고: 농도 문학 및 펩 티 드의 속성에 근거 한다. 직렬 희석, 펩 티 드의 약 100 µ M와 함께 시작 하 고 다음 줄이거나 얻은 결과 따라이 농도 범위를 증가 하는 것이 좋습니다.

4. 참조 Antifungals (긍정적인 컨트롤)

1. 그 물에 희석: 분석의 높은 농도의 2 배 솔루션 준비 (섹션 5 참조: 희석 단계에 대 한 항진균 분석 결과).
   1. C. albicans 변종에 대 한 fluconazole의 128 µ g/mL 또는 caspofungin의 128 µ g/mL의 솔루션을 준비 합니다. 모두 접시 농도 64 µ g/mL를 될 것입니다.
   2. C. neoformans 변종에 대 한 암포 B (수용 성 솔루션)의 32 µ g/mL의 솔루션을 준비 합니다. 플레이트 농도 16 µ g/mL를 될 것입니다.
      참고: 일반적으로 암포 B는 희석 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 이후이 항진균 저조한 물에 용 해. 그러나, 상업적으로 이용 가능한 수용 성 암포 B 준비 있습니다.
2. Antifungals 유기 용 매에 희석에 대 한: DMSO, 재고 솔루션 X 100을 준비 다음에 사용 하기 위해 물에 10 배 희석.
   참고: 이렇게, 잘, DMSO의 최종 농도 초과 하지 않습니다 1%. 곰 팡이 컨트롤은 필요한 일부 버섯 용납 하지 않습니다 잘 솔벤트의이 농도 1 %DMSO 포함 하는 미디어에서 성장할 것입니다 우물. DMSO는 감광, 그래서 호 일 접시 커버 또는 잠복기 동안 어두운 챔버에 배치.

5. 항진균 분석 결과

참고: 항진균 분석 실험 체 외에 는 국물 microdilution 임상 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침 일부 수정에서 시험에 따라 수행 됩니다.

1. 각 펩 티 드의 두 배 직렬 희석을 준비 하 고 항진균 50 µ L의 최종 볼륨을 96 잘 폴리스 티 렌 microplates에서 제어.
   1. 100 µ L의 최고 2 배 농도에서 항진균/펩 티 드의 원하는 열에 최종 농도 1-3, 시내 행 대답 하는 것을 추가 피 펫을 사용 하 여
   2. H. B 행에, 다른 우물으로 살 균 물의 50 µ L을 추가 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여,
   3. 최고 농도 (A 행)와 우물의 50 µ L을 제거 하 고 농도 (B 행)의 다음에 전송 균질.
   4. 최저 농도와 잘 때까지 위의 단계를 반복 하 고이 잘 (행 H) 50 µ L를 삭제. 빈 컨트롤 또는 네거티브/성장 제어에 대 한만 물에 두고 열 11 및 12 (행 A, B, C).
   5. 추가할 조정된 inoculum X 2의 50 µ L RPMI 1640 매체에 각 음 (열 1-3 플러스 열 11 (네거티브/성장 제어)); C. albicans 에 대 한 최종 농도 2 x 10³ 셀/mL, 그리고 최종 농도 C. neoformans 변종 10⁴ 셀/mL에 될 것입니다 될 것입니다.
   6. 빈 컨트롤을 준비 (50 µ L 물 + 50 µ L 2 셀 없이 X RPMI-1640 매체) 및 부정/성장 제어 (50 µ L 물 + 항진균 없이 50 µ L 조정 inoculum 2 X RPMI-1640 매체), 그리고 위의 설명 대로 잘 플레이트에 부하.
2. 테스트할 각 화합물에 대 한 절차 및 선택한 항진균 제어 (열 4-10)를 반복 합니다.
   참고: 직렬 희석 할 수 있습니다 세로로 또는 가로로 (즉, 테스트 하는 주어진된 화합물/추출의 희석 수는 8 개 이상의 경우) 접시에 아래, 실험으로.
   1. 화합물, 참조 하는 경우 약물, 또는 그 구성 요소 중 하나는 감광, 감소 빛에 분석 결과 수행, 호, 플레이트 커버 또는 외피 동안 어두운 챔버에 배치.
3. 다음 옵션 권장 사항을 고려 하십시오.
   1. 로이 증발 감소 가스 교환을 허용 하는 명확한 커버 플레이트 플레이트를 봉인.
   2. 습 한 챔버;에 접시를 놓으십시오 그것은 또한 증발 줄일 것 이다.
4. C. neoformans를 흔들어 200 rpm으로 24 시간 또는 48 h 모든 C. albicans 긴장, 및 48 h 37 ° C에서 번호판을 품 어. 낮은 최종 볼륨 (100 µ L) 아무 일 좀 발생 하는 것을 보장 합니다.
   참고: 24 시간에 마이크 읽기와 C. albicans 긴장에 대 한 48 h 사이 상당한 차이가 관찰 되었다. 그럼에도 불구 하 고, 48 h 수치는 시각화 하기 쉽습니다.
5. 형태 또한 오염의 흔적을 확인으로 변경 사항을 확인 하려면 잠복기 전후 반전된 광학 현미경의 도움으로 모든 우물을 관찰 합니다.
   참고: 읽기 시각적으로 수행 및 실험의 끝에 촬영 될 수 있습니다. 각 읽기 전에 접시 약간 균질. 600의 OD를 측정 하 여 읽기를 수행할 수 있습니다, 셀 묶습니다 경우 또는 filamentation 하지 관찰 된다.
6. 별도 날짜에 세 번 이상 실험을 수행 합니다.

결과

마이크는 완전히 잠복기의 끝에 보이는 곰 팡이 성장을 억제 하는 최저 항균 화합물 농도로 정의 됩니다. 반면 탁도 부정/성장 제어 웰 스에 유사한 어떤 잘 분명 미디어 빈 우물에 유사한 어떤 잘 긍정적인 결과 여겨진다이 프로토콜의 목적은 화면 잠재적인 antifungals 빠른 방법 이므로, 부정적인 것으로 간주. 그러나, 주어진된 앰프 fungistatic 또는 살 진 균 인지 알고에 관심이 있는 경우에, 긍정적인 우물에서 미디어 또한 수 Sabouraud 포도 당 한 천에 도금 하거나 또 다른 생존 능력 테스트로 확인.

주어진 소설 화합물의 행동의 메커니즘은 알려진, 그것 따라서 필수적입니다 경우 참조 항진균 이루어졌고 예상된 범위는 곰 팡이 분리 (확인 공식 지침, 테이블, 또는 문학에서 데이터)을 검사 하기 전에 대 한 확인 하는 (이 경우, 앰프;에 화합...

토론

Microdilution 테스트는 화합물, 화합물의 소량을 사용 하 여 대상의 잠재적인 항진균 성 활동을 분석 하 고 동시에 농도의 범위에서 테스트 수 있습니다. 이 따라,이 프로토콜은 잠재적인 새로운 항진균 성 화합물에 대 한 심사의 첫 번째 단계도 권장 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 처음 클리닉, 항진균 치료의 선택에 도움을 설계 되었습니다 M27-A3 프로토콜에 기반은 그리고 새로운 항진균 성 화합물의 다양 한 적응 수 있습니다. 전반적으로,이 프로토콜은 추출 물 또는 화합물의 물리 화학적 기능에 집중할 수 있습니다. 예를 들어 분석 결과에서 잠재적인 후보 나타날 수 있습니다 잘못 효과 미디어에서 화합물 Histatin 5¹⁴RPMI의 효과 같은 곰 팡이 세포와의 상호 작용을 차단할 수 있습니다. 이 경우에 RPMI 방해 하는 경우에 대 한 대체 매체 MOPS pH 7¹⁵효 질소 기지 (YNB) 버퍼입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Media and Reagents
RPMI 1640 medium, with l-glutamine, without sodium bicarbonate	Thermo Fisher	31800-022
3-(N-morpholino) 프로판 설폰산 (MOPS) (o que a gente usa tem um só DIO, Completa o Nome Dele Please)	Sigma-Aldrich		2X RPMI 중간
염화나트륨 (NaCl)	Dinâ를 버퍼링하는 데 사용; 운모	1528-1	인산염 완충 식염수(PBS)용 137mM,
염화칼륨(KCl)	J.T.Baker	3040-01	인산염 완충 식염수(PBS)용 2.7mM,
인산나트륨 이염기성(Na2HPO4),	인		산염 완충 식염수(PBS)V000129 10mM, 인산
수소 인산칼륨(KH2PO4),	Sigma-Aldrich	60230	2mM
BD Difco Sabouraud 포도당 육수	BD	238230
BD Difco Sabouraud 포도당 한천	BD	210950
글리세롤	시그마-알드리치	V000123	35% for (soluç &물결표; o de estoque? 크리오프레세르바ç &물결표; o?)
메마른 물			Para diluiç &물결표; o das drogas na diluiç &물결표; o seriada
항진균제
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942
Fluconazole	Sigma-Aldrich	F8929
Caspofungin	Sigma-Aldrich	PHR1160
Plastics
50 mL 원뿔형 튜브	Sarstedt	62.547.254
접시 페트리	J.Prolab	0304-5
96 웰 플레이트	Corning	3595
멸균 용액 저장소	KASVI	K30-208
광학 현미경	Nikon을 사용하여 용액을 파이펫하는 데 사용	E200MV
원심	Thermo Fisher	MegaFuge 16R
인큐베이터	Ethik Technology	403-3D	는 37°C로 설정합니다. C
셰이커	뉴브런즈윅 사이언티픽	엑셀라 E25	37°C로 설정; C, 200 RPM
셀 계수 챔버, Neubauer	BOECO Germany	BOE 13
멀티채널 피펫	HTL	5123