Method Article

초파리 에서 신경 돌기 Arborization 복잡성의 정량 분석

DOI:

10.3791/57139

⸱

January 7th, 2019

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Mass General Institute of Neurodegenerative Disease, 2Department of Geriatric Neurology, Nanlou Clinical Division, PLA General Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서 초파리, 수지상 morphogenesis의 연구를 위해 사용 될 수 있는 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC)의 정량 분석에 집중 한다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모 수석 신경의 분기 예측 이며 수지상 형태학 반영 시 냅 스 조직 신경 시스템의 개발. 초파리 애벌레 신경 돌기 arborization (다) 공부 morphogenesis dendrites 신경 및 신경 시스템의 개발에 유전자 기능에 대 한 이상적인 모델입니다. Da 뉴런의 4 개의 클래스가 있습니다. 클래스 IV는 거의 전체 면적 애벌레 몸 벽의 분기 패턴으로 가장 복잡 한입니다. 우리는 이전 클래스 IV 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC) 4 개의 매개 변수를 사용 하 여 SOX5 의 초파리 ortholog 침묵의 효과 특징: dendrites의 길이, 모 수석 검사의 표면적은 지점과 분기 구조의 총 수입니다. 이 프로토콜의 NDAC 정량 분석, 애벌레 해 부, confocal 현미경 검사 법 및 이미지 분석 절차 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 구성 된 워크플로 제공 합니다. 다 신경 개발 및 그것의 근본적인 메커니즘에 더 통찰력 신경 기능에 대 한 이해를 개선 하 고 신경의 근본적인 원인에 대 한 단서를 제공 및 neurodevelopmental 장애.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모 수석 신경의 분기 예상치는 다른 뉴런1,2에서 신경의 감각 및 시 냅 시스 입력을 포함 하는 필드를 커버. Dendrites 시 냅 스 형성의 중요 한 요소 이며, 시 냅 시스 입력의 통합 신경에 전기 자극을 전파에 중요 한 역할. 수지상 arborization (다)는 신경 형성 새로운 수지상 나무와 가지를 새로운 시 냅 스를 만드는 과정 이다. 개발 및 다 지점 밀도 및 그룹화 패턴 등의 형태 다단계 생물학 과정에서 발생 하 고 매우 신경 기능에 상관. 이 프로토콜의 목표 arborization 복잡 한 신경 dendritric의 정량 분석에 대 한 메서드를 제공 하는 초파리.

모 수석의 복잡 시 냅 스 종류, 연결 및 파트너 뉴런에서 입력을 결정합니다. 분기 패턴 및 모 수석의 밀도 수지상 필드3,4에 수렴 하는 신호 처리에서 포함 된다. 모 수석 개발 조정에 대 한 유연성 있습니다. 예를 들어, 발달 단계 somatosensory 신경 및 성숙한 신 경계5모 수석 조....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 실험 준비

  1. 다음 시 약 준비: Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS); 트라이 톤 X-100. 0.2 %PBST (PBS + 0.2% 트라이 톤 X-100); 32 %paraformaldehyde (PFA), 사용; 하기 전에 4%로 희석 실리콘 고무 베이스와 치료 대리인; antifade 장착 매체 (예를 들어, 연장 금); 그리고 손톱 폴란드어입니다.
  2. 다음 장비 준비: 해 부 현미경, 2 개의 날카로운 집게와가 위 서, 기정, 해 부 접시, 현미경 슬라이드 및 coverslips, confocal 현미경을 만들기 위한 배양 접시 핀의 수에 대 한 고 피지 ImageJ 소프트웨어가 설치 된 컴퓨터.

2. 애벌레 컬렉션

  1. 각각 UAS GFP, ppk 권총 GAL4 또는 W1118 야생 타입 파리, UAS-Sox102F-RNAi 파리 친구. 25 ° c.에 표준 조건에서 문화 파리
  2. 5 ~ 6 일, UAS-Sox102F-RNAi의 세 번째 탈피 애벌레를 수집 / ppk 권총 GAL4, UAS GFP 또는 UAS-GFP와 ppk 권총 GAL4 / + 집게 해 부에 대 한 신중 하 게 제어.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Da 뉴런의 dendrites 했다 공동 overexpressing GFP (UAS GFP, ppk 권총 GAL4) 다 신경 소마에 GFP 형광 이미징 분석에 대 한 수지상 아 버에 표시 됩니다. 다 신경 dendrites의 형태는 거꾸로 confocal 현미경 (그림 2)에 의해 몇 군데.

Da 뉴런의 dendrites 피지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 추적 했다. 파일 모 수석 길이 (그림 3) 추정에 사용 되었다. 다 신경 (N = 21) (UAS-Sox102F-RNAi/ppk 권총-GAL4;에서 Sox102F 의 입을 UAS-GFP) 컨트롤에 비해 단순한 구조와 모 수석 및 짧은 분기 길이 수에 있는 뜻깊은 감소를 주도 (N .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendrites 표 피를 자극 하는 뉴런의 입력된 영역 하 고 그들의 형태학 정보 접수 및 개별 뉴런에 의해 처리 방법을 결정 합니다. 개발 모 수석 형태 모 수석 조직의 유전자 변조를 반영합니다. 초파리 애벌레 다 신경의 말 초 신 경계는 모 수석 개발 때문에 공부에 대 한 중요 한 모델: 1) 포유류11,12; 기능적 유사성 모 수석 구조11,12;에 따라 2) 4 개의 클래스 구분 그리고 3) 규제 morphogenesis 유전 요인. 이 프로토콜에서 선물이 초파리 다 뉴런의 이미지 분석에 애벌레 준비에서 워크플로. 메서드는 dendrites, 표면적, 분 지의 총 숫자와 분기 구조 길이 세부 사항에, da 뉴런의 dendrites을 분석 하기 위한 4 개의 중요 한 매개 변수를 설.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 윌리엄 A. Eimer 이미징 기술 지원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 [하 R.E.T], 치료 질병의 기금에 의해 지원 되었다 국립 연구소의 건강 [R01AG014713 및 R01MH60009 R.E.T;에 R03AR063271 및 R15EB019704 앨 러 배 마에], 그리고 국립 과학 재단 [앨 러 배 마에 NSF1455613].

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
인산염 완충 식염수(PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
파라포름알데히드(PFA)전자 현미경 과학15714-S
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 염기 및 경화제Dow Corning Corportation3097366-0516; 3097358-1004
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36931
손톱 광택제 CVS72180
실체 현미경NikonSMZ800
컨포칼 현미경NikonEclipse Ti-E
페트리 디쉬팔콘353001
펜치Dumont11255-20
가위 Roboz 수술 기구 CoRS-5611
곤충 핀 Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
현미경 슬라이드 및 커버 슬립Fisher Scientific15-188-52

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
  2. MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
  3. Losonczy, A., Makara, J. K.,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dendritic ArborizationNeuronal MorphologyDrosophila LarvaeConfocal MicroscopyImageJ AnalysisDendrite Length MeasurementSurface Area CalculationBranching Structure AnalysisSOX5 Gene SilencingZ series Imaging

Related Articles