교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처

요약

이것은 후속 proteomic 분석에 대 한 가교 된 chromatin의 순서 특정 캡처에 의존 하는 특정 대상 loci에 새로운 상호 작용 하는 DNA 단백질을 식별 하는 방법. 잠재적인 바인딩 단백질도 세포 수정에 대 한 사전 지식이 요구 된다. 처음에 효 모에 대 한 개발, 기술은 지금 되었습니다 포유류 세포에 대 한 적응.

초록

단백질 (HyCCAPP) 기술에 대 한 단백질 chromatin 관련의 교 잡 캡처 효 모에 소설 DNA 단백질 상호 작용을 밝히기 위해 처음 개발 되었다. 분석을 대상 지역에 바인딩된 가능성이 단백질에 대 한 사전 지식 없이도 관심의 대상 영역을 수 있습니다. 이론에서 그러면 관심, 어떤 게놈 영역을 분석 하는 데 사용할 HyCCAPP 그리고 다른 세포 시스템에서 작동 하도록 충분 한 유연성을 제공 합니다. 이 방법은 알려진된 전사 인자, Chromatin Immunoprecipitation (칩) 및 칩 같은 방법에 대 한 더 적합 한 작업의 바인딩 사이트를 공부 하는 것은 아닙니다. HyCCAPP의 힘은 제한 된 DNA 영역을 탐구 하는 능력 또는 그것에 바인딩 단백질에 대 한 지식에 있다. 그것은 편견 (칩 같은 방법에 존재 하는) 단백질 기반 chromatin 농축 항 체를 사용 하 여 도입을 방지 하는 편리한 방법을 수 있습니다. 잠재적으로, HyCCAPP를 진정으로 새로운 DNA 단백질 상호 작용을 밝히기 위해 강력한 도구를 수 있습니다. 날짜 하려면, 기술은 주로 적용 된 효 모 세포 또는 포유류 세포에서 높은 복사 반복 시퀀스. 우리가 구상 하는 강력한 도구가 되었다, HyCCAPP 접근 포유류 세포에서 단일 복사 loci를 효율적으로 캡처를 최적화 해야 합니다. 여기, 선물이 우리의 적응 초기 효 HyCCAPP 프로토콜 인간의 세포 라인을 캡처하고 표시 단일 복사 chromatin 지역이 수정 프로토콜 효율적으로 격리 될 수 있습니다.

서론

지난 10 년 동안 많은 수의 샘플, 그리고 놀라운 해상도 다양 한 게놈의 연구를 수 있도록 시퀀싱 기술에 극적인 개선을 보았다. 백과 사전의 DNA 요소 (인코딩) 컨소시엄, 국가 인간 게놈 연구소는 건강의 국가 학회의 주도로 대규모 다 기관 노력 개별 녹음 방송 요인에 대 한 통찰력을 제공 하고있다 그리고 다른 규제 단백질 바인딩할 게놈 상호 작용. 초기 노력 Chromatin immunoprecipitation (칩)에 의해 100 개 이상의 알려진된 DNA 묶는 단백질¹에 대 한 평가 특정 DNA 단백질 상호 작용, 특징. 등 DNase 프린팅² 포름알데히드 규제 요소 (시 키)³ 의 보조 절연 단백질, 하지만 분명 한 제한으로 작용 하는 게놈의 특정 영역을 찾을 사용 되었습니다 또한 다른 방법에 실험 방법 팬 들은 상호 작용 단백질의 정보를 식별 하지 않습니다. 지난 년 동안 광범위 한 노력에도 불구 하 고 아무 기술 염색 질, 그리고 식별에 단백질 DNA 상호 작용의 포괄적인 특성화 및 정량화 chromatin 관련 단백질의 효율적으로 있도록 떠오르고 있다.

이 필요를 해결 하기 위해 우리는 우리가 Hyb....

프로토콜

1. 캡처 Oligonucleotide 디자인

1. 대상 지역/s의 하이브리드 캡처 동안 사용할 oligonucleotides의 패널 디자인.
   1. 4-8 oligonucleotides 대상 지역, 그러나 최소한 디자인, 하나 이상의 oligonucleotide 대상 영역의 각 끝을 대상으로 디자인을 목표로 합니다.
   2. 대상 시퀀스는 긴 경우 (> 500의 기본적인 쌍), 전체 대상 지역 chromatin의 효과적인 농축을 최대한 밖으로 보기로 oligonucleotides 디자인.
      참고: 우리는 4-8 oligonucleotides와 최적의 캡처 관찰. 이 프로세스는 더 많은 oligonucleotides 잘 사용할 수 있습니다, 하지만 너무 많은 oligonucleotides 사용 하는 경우 농축 수율의 감소를 관찰 하는 것은 드물지 않다.
2. 유사한 녹는 온도, oligonucleotides 디자인 하 고는 그들이 하지 강한 헤어핀을 형성 않으며 강한 상호 작용 (고려 내 42 ᵒC에서 실시 될 것입니다)를가지고 있는지 확인 하십시오.
   참고: 발 차입 (4.12.3)을 선택 하는 경우는 추가적인 외부 8 기준 시퀀스는 oligonucleotide에 추가 되어야 합니다....

결과

때문에 성공 하려면 HyCCAPP chromatin의 대용량 입력된에 대 한 필요성, 세포 confluency의 상대적으로 높은 수준에 성장 된다. Trypan 세포 사망률은 보통 확인 하는 데 사용은 블루 얼룩 (< 10%). 단일 복사본 실험, chromatin 콘텐츠 교 잡 캡처 해야 femtomolar 범위에서 이전에 보통 시작 물자로 적어도 10⁹ 셀을 필요 합니다. 전체 규모 실험, 이전에 더 작은 일괄 처리 캡처 oligonucleotide 성능을 테스트 하는 것이 좋습니다. 교 잡 캡처 oligonucleotides의 적정을 사용 하 여 그림 1에 표시 됩니다. 캡처 oligonucleotides의 수는 총 농도 일정 하 게 유지 하는 동안에 점차적으로 증가 했다. 이 실험은 명확 하 게 세 가지 주요 측면을 보여준다. 첫째, 그것은 얼마나 많은 oligonucleotides 최.......

토론

여기서 설명 하는 HyCCAPP 메서드는 그것에 게 밝히기 애매 남아 것 이다 DNA 상호 작용 하는 강력한 접근 방식을 많은 독특한 기능이 있습니다. 과정의 성격 HyCCAPP 다른 유기 체와 게놈의 지역에서 작동 하도록 유연성을 제공 합니다. 그러나 그것은 방법,, 그는 몇 가지 제한이 간주.

HyCCAPP 일차 전지, 세포 배양 시스템, 또는 심지어 조직 샘플에서 잠재적으로 적용할 수 있도록 셀 수정 방지 하는 방법입니다. 그러나 그 때문에,, 그것은 요구 한다 가교 화, proteomic 분석에서 감도 감소 하 고 따라서 입력된 대용량을 필요로 하는 샘플을. CRISPR 및 주변 가교 반응^12,13,,1418없이 작동할 수 있는 단백질의 biot.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PrimerQuest 도구	IDT
OligoAnalyzer 3.1	IDT		분석 캡처 올리고뉴클레오티드
PairFold	UBC		분석 상호 작용
RPMI 1640 매체	Thermo Fisher	11875093
페니실린-스트렙토마이신	Thermo Fisher	15140122
L-글루타민	Thermo Fisher	25030081
태아 소 혈청	Thermo Fisher	26140079
Countess 자동 세포 카운터	Thermo Fisher
850 cm2 롤러 병	Greiner Bio-one	680058
롤러 시스템	Wheaton	22-288-525
37 % 포름알데히드	시그마-알드리치	F8775
글리신	시그마-알드리치
이게팔 CA-630	시그마-알드리치	I3021
프로테아제 억제제 칵테일	시그마-알드리치	P4380
HEPES	써모 피셔	15630080
브랜슨 디지털 초음파 SFX 150	에머슨
큐빗 3.0 형광측정기	Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR 분석 키트	Thermo Fisher	Q32850
Bioanalyzer 2100	Agilent
Agilent DNA 1000 kit	Agilent	5067-1504
MES sodium salt	Sigma-Aldrich	M3885
NaCl 5M	Thermo Fisher	AM9760G
EDTA	Sigma-Aldrich
DynaMag-2 자석	Thermo Fisher	12321D
DynaMag-15 자석	Thermo Fisher	12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin	Thermo Fisher	60210
저결합 튜브	Eppendorf	22431081
Hybridization Oven	SciGene
튜브 쉐이커 및 로테이터	Thermo Fisher	415110Q
DNase I (RNase-free)	New England BioLabs	M0303
SSC 버퍼 20× 농축	Sigma-Aldrich	S6639

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