Method Article

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

DOI:

10.3791/57149

⸱

March 22nd, 2018

 , 
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Japan Science and Technology Agency, PRESTO, 3Institute for Integrated Cell-Material Sciences, Kyoto University, 4Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Graduate School of Biostudies, Kyoto University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

셀은 일시적으로 셀 주변에서 다양 한 요인에 의해 영향을 환경 변화에 제대로 응답 해야 합니다. 노치 신호 전달 경로 같은 필수 분자 기계 셀 통신, 태아의 정상적인 발전에 핵심 역할 중 하나입니다. 이 통로 포함 ultradian 리듬, 진동 정보 셀을 전송 하지만 분자 생물학 기술에 있는 진도도 불구 하 고 그것은 되었습니다 도전 진동 유전자에 다세포 상호 작용의 영향을 명료 하 게 역학입니다. 여기, 우리는 optogenetic 제어 및 정확한 시간적으로 유전자 표현 패턴을 라이브 감시를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 메서드는 성공적으로 노치 신호의 세포내와 세포 주기 입력 기본 진동 주파수 튜닝 및 위상 단일 셀 해상도에서 이동 하 여 끌고가 다 밝혔다. 이 방식은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 하는 다양 한 신호 통로의 동적 특징의 분석에 적용 합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

셀 통신 발달 과정에서 배아 패턴에 중요 한 역할을 재생합니다. 척추 동물 배아 metameric 구조 somites 라는 세분화 시계1시간 유지 시계의 통제 정확한 시간 정확도 이전 후부 몸 축 형성 된다. 이 과정 presomitic mesoderm (PSM) 세포의 그룹 동기 방식에서 somites로 주기적으로 변환 됩니다. 이 프로세스 동기화 진동 유전자 발현 포함 하 고 단계에 진동 하는 PSM 셀 같은 somites 형성. 진동 유전자 발현의 기간은 약 2 ~ 3 h 쥐와 제 브라에서 약 30 분입니다. 해리, PSM 셀 손실 synchrony2,3, 하지만 그들은 다시 집계 하는 때, 그들은 자체 구성 하 고 인구 synchrony4, 셀 커플링 하자는 동기화에 대 한 키 복구 진동입니다.

광범위 한 노력 델타-노치 통로 신호 분자 세분화 시계 유전자의 동기화 된 진동에 단단히 연결 되어 있는지 밝혀. 약리학 억제제 또는 노치 신호의 유전자 변이 발진기의 인구 desynchronize. Zebrafish, 노치 신호 구성 요소, DeltaC,....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tol2 시스템으로 안정적인 셀 라인의 세대

  1. C2C12 셀에 transposase (Tol2) 식 벡터 (pCAGGS-mT2TP)와 Tol2 기반의 optogenetic 모듈의 플라스 미드 벡터 (그림 1A)를 transfect. 모든 단계, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 37 ° C (표 1), 5% CO2, 그렇지 않으면 표시의 존재에서 페니실린 스 보충 DMEM 매체와 문화 셀.
    1. 셀 카운터, trypsinized 세포와 당 12-잘 접시에 잘 플레이트 5 x 104 C2C12 세포 transfection 전에 1 일 계산.
    2. Lipofection 시 약을 사용 하 여 optogenetic Tol2 기반 벡터 (pAI177 또는 pAI218), 약물 선택 벡터 (pAI170)의 0.125 μ g과 pCAGGS mT2TP 벡터의 0.5 μ g의 0.375 μ g를 transfect 공동.
    3. Transfected 세포, trypsinize 그리고 그들을 transfection 후 1 일 100mm 문화 요리에 접시.
    4. 문화 매체 100 mg/mL hygromycin....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 LightOn 시스템11,12, 2-3 h 주기와 유전 발진기의 연구에 포유류 세포에 있는 사진 유도 유전자 발현을 가능 하 게 적응. 이 시스템은 두 부분: 사진 유도할 수 있는 transcriptional 활성 제 hGAVPO 및 드라이브의 임의 유전자의 전사를 UAS 발기인 카세트. 사진 유도 유전자 발현의 타악기 활동을 가속, UAS 발기인 카세트에 polyA 시퀀스 murine Hes1 3' UTR는 mRNA 반감기 murine fibroblasts에 20 분 단축에 의해 대체 되었다.

안정적인 셀 라인을 설정 하기 위해 Tol2 transposase 시스템에 따라 트라이 cistronic 벡터 사용된13

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 유전자 식 역학 2 ~ 3 h의 주기를 제어 하는 방법을 보였다. 이 시간 단위 Tet에 시스템 및 원래 LightOn 시스템을 포함 하 여 다른 기존 시스템에 있는 것 들 보다 훨씬 짧습니다. Ultradian 시간의 척도 도달 주요 매개 변수는 분자 제품 사진 유도, mRNAs 및 단백질의 반감기. 이러한 운동 매개 변수 세포 유형 및 종에 달려 있습니다. 활동을 조정에 대 한 다른 시퀀스 Hes1 3' UTR 대체 시퀀스 및 대상 단백질의 기능 변경 되지 않습니다 때문에 스트레이트-앞으로 방법입니다. 다른 3' Utr 바람직한 타악기 패턴 특히 관심사의 세포를, 추구에 대 한 라이브 셀 모니터링 dLuc 빛 유도 의해 좋은 출발점 및 사용 검사 및 유효성 검사에 대 한.

빛에 민감한 세포의 일일 처리에 대 한 가장 자주 묻는 질문 중 하나입니다. 노치 신호 보낸 사람 수신기 동적 분석 결과 경우 우리가 우리의 시스템 (사진 유도할 수 있는 dLuc 또는 Dll1 전지.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 진화 과학 및 기술 (JPMJCR12W2 (R.K.)), 과학 연구 혁신 분야 (교육, 문화, 스포츠, 과학, 및 기술 (MEXT), 일본에 대 한 특정 JST, 프레스 토 (A.I.), 핵심 연구에 의해 지원 되었다 26119708 (A.I.) 및 16 H 06480 (R.K.)), 과학 연구 (A) (일본 사회 과학 (JSP) 24240049의 승진에 대 한 (R.K.)), 그리고 젊은 과학자 (A) (JSP 15 H 05326 (A.I.)), 그리고 혁신적인 지역 "형광에 대 한 과학적 연구에 대 한 특정 라이브 이미지 "문 부 과학성, 일본, 그리고 플랫폼의 동적 접근에 대 한 생활 시스템을 문 부 과학성, 일본에서에서입니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FACSBecton, Dickinson and CompanyFACSAriaII SORP
카메라AndoriKon M-934
현미경OlympusIX-81 ZDC
PMT 장치Churitsu eletric corp.CL24B-LIC/B
블루 LED 조명기OptoCodeLEDB-SBOXH
DMEMNacalai08459-35
페니실린-스트렙토마이신Nacalai26253-84
소 태아 혈청시그마172012
KRYSTAL24(블랙 24웰 플레이트)하이테크303012
D-Luciferin 칼륨 SaltNacalai20028-24
조도계LI-COR BiosciencesLI-250A
항-HA-과산화효소 항체Roche클론 3F10
항-Actin-Peroxidase 항체Wako클론 2F3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
  2. Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells requi....

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Optogenetic ControlGene ExpressionCell to cell InteractionsNotch Signaling PathwayLive MonitoringBlue light IlluminationSingle cell ResolutionFluorescence ImagingLuciferase AssayTime lapse Recording

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