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방법 논문

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

6.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57149

⸱

2018년 3월 22일

 , 
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Japan Science and Technology Agency, PRESTO, 3Institute for Integrated Cell-Material Sciences, Kyoto University, 4Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Graduate School of Biostudies, Kyoto University

이 논문에서

요약

여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

초록

셀은 일시적으로 셀 주변에서 다양 한 요인에 의해 영향을 환경 변화에 제대로 응답 해야 합니다. 노치 신호 전달 경로 같은 필수 분자 기계 셀 통신, 태아의 정상적인 발전에 핵심 역할 중 하나입니다. 이 통로 포함 ultradian 리듬, 진동 정보 셀을 전송 하지만 분자 생물학 기술에 있는 진도도 불구 하 고 그것은 되었습니다 도전 진동 유전자에 다세포 상호 작용의 영향을 명료 하 게 역학입니다. 여기, 우리는 optogenetic 제어 및 정확한 시간적으로 유전자 표현 패턴을 라이브 감시를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 메서드는 성공적으로 노치 신호의 세포내와 세포 주기 입력 기본 진동 주파수 튜닝 및 위상 단일 셀 해상도에서 이동 하 여 끌고가 다 밝혔다. 이 방식은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 하는 다양 한 신호 통로의 동적 특징의 분석에 적용 합니다.

서론

셀 통신 발달 과정에서 배아 패턴에 중요 한 역할을 재생합니다. 척추 동물 배아 metameric 구조 somites 라는 세분화 시계1시간 유지 시계의 통제 정확한 시간 정확도 이전 후부 몸 축 형성 된다. 이 과정 presomitic mesoderm (PSM) 세포의 그룹 동기 방식에서 somites로 주기적으로 변환 됩니다. 이 프로세스 동기화 진동 유전자 발현 포함 하 고 단계에 진동 하는 PSM 셀 같은 somites 형성. 진동 유전자 발현의 기간은 약 2 ~ 3 h 쥐와 제 브라에서 약 30 분입니다. 해리, PSM 셀 손실 synchrony2,3, 하지만 그들은 다시 집계 하는 때, 그들은 자체 구성 하 고 인구 synchrony4, 셀 커플링 하자는 동기화에 대 한 키 복구 진동입니다.

광범위 한 노력 델타-노치 통로 신호 분자 세분화 시계 유전자의 동기화 된 진동에 단단히 연결 되어 있는지 밝혀. 약리학 억제제 또는 노치 신호의 유전자 변이 발진기의 인구 desynchronize. Zebrafish, 노치 신호 구성 요소, DeltaC, DeltaD, Notch1a, 등의 돌연변이 비동기 진동5,6표시 합니다. 여자 또는 마우스 배아에서 노치 ligand 델타-like1 (Dll1) 뿐만 아니라 노치 변조기 미치광이 프린지 (Lfng)는 동기화 된 진동7,,89필요 합니다. 그러나 유전자 규칙 역학의 기존의 섭 동의 시간적 해상도 조사 하는 데 충분 하지 않았기 때문에, 그것은 셀을 동적 정보 전송에 대 한 이러한 분자의 기능 기능을 테스트 하기 어려운 되었습니다는 2-3 h (ultradian 리듬)의 계획의 프로세스.

최근 포유류 세포10제어 및 모니터 유전자 표현 패턴을 통합된 방법을 개발 했습니다. 이 기술은 ultradian 시간의 척도에 주기적인 빛 조명에 의해 유도를 유전자 식 펄스의 수 있습니다. 이 프로토콜은 감광 세포 선 확립 및 라이브 셀 발광 셀 통신의 문맥에서 모니터링 하 여 기자 세포의 동적 응답을 관찰 하는 방법을 나타냅니다. 이 방법은 많은 다른 신호 통로의 분석에 적용 됩니다.

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프로토콜

1. Tol2 시스템으로 안정적인 셀 라인의 세대

  1. C2C12 셀에 transposase (Tol2) 식 벡터 (pCAGGS-mT2TP)와 Tol2 기반의 optogenetic 모듈의 플라스 미드 벡터 (그림 1A)를 transfect. 모든 단계, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 37 ° C (표 1), 5% CO2, 그렇지 않으면 표시의 존재에서 페니실린 스 보충 DMEM 매체와 문화 셀.
    1. 셀 카운터, trypsinized 세포와 당 12-잘 접시에 잘 플레이트 5 x 104 C2C12 세포 transfection 전에 1 일 계산.
    2. Lipofection 시 약을 사용 하 여 optogenetic Tol2 기반 벡터 (pAI177 또는 pAI218), 약물 선택 벡터 (pAI170)의 0.125 μ g과 pCAGGS mT2TP 벡터의 0.5 μ g의 0.375 μ g를 transfect 공동.
    3. Transfected 세포, trypsinize 그리고 그들을 transfection 후 1 일 100mm 문화 요리에 접시.
    4. 문화 매체 100 mg/mL hygromycin 보충 transfected 세포에 대 한 문화 매체를 교환 합니다.
    5. 3 일 취소 transfected 세포를 제거 하기 위한 문화 셀. 참고 중간 변경 필요 하지 않습니다.
  2. Trypsinize transfected 세포 고 정화 선택을 위해 형광 단백질을 표현 하는 세포의 인구. 수신기 세포 pAI177를 들고, 그린 PE 채널 mCherry-긍정적인 세포 인구의 정화에 대 한 정렬 게이트를 설정 합니다. 사진에 민감한 보낸 셀 pAI218 운반, 송출 채널 iRFP713-긍정적인 세포 인구의 정화에 대 한 정렬 게이트를 설정 합니다.
  3. (선택 사항) 표준 메서드를 제한 희석 또는 단일 셀 FACS에 의해 정렬 하 여 클론 세포 인구를 구축.

2. 사진-감도 인구 수준에서 설계 된 셀의 평가

참고:이 부분에서는 생 화 확 적인 분석 실험, 정량 등 서양 blotting에 의해 블루 빛 조명에 따라 Dll1 ligand 단백질의 동적 유도 확인 하려면 프로토콜을 설명 합니다.

  1. 각각 두 가지 유형의 광원 없이 incubators 빛 유도 조건 또는 어두운 상태에 대 한 설정. 설치는 파란 LED 트랜스-조명 기, 그림 1B와 같이 노출 계를 사용 하 여의 빛 강도. 프로그램 타이밍 및 조명 (그림 1C)에 대 한 프로그래밍 가능한 일정 수를 단일 보드 마이크로-컨트롤러 제어 스크립트를 로드 하 여 빛 조명 기간
  2. 셀 카운터 trypsinized 셀과 판 1.0 x 105 사진-민감한 보낸 셀 pAI218과 pAI170 35 m m 직경 플라스틱 문화 요리 (빛 조건에 대 한 이상 12 요리와 어두운 조건에 대 한 1 접시)에 고 요리를 설정 어둠/빛의 조건에 대 한 incubators 구분 합니다. 요리를 설정한 후 세포 lysates 수집까지 산부인과의 문을 유지.
  3. 도금, 후 하나 30 일 시작 빛 조명 (셀 80% 이상이 될 것으로 예상 된다 confluent). 셀을 바람직하지 않은 사진-자극을 피하기 위해 빛을 노출 하지 마십시오.
    참고: 일정 조명에 대 한 실험의 목적에 따라 달라 집니다. 지속적인된 조명 조건 (예. 1-분 기간 및 10 분 간격으로 40 µ / m2/s 빛 강도) 사진-유도, 그리고 그 강한 빛 조명에 대 한 간단한 검사는 셀에 대 한 충분 한가. 따라서, 조명에 대 한 무해 매개 변수 선택 되어 있는지 확인 합니다.
  4. 도금, 후에 2 일 약 30 분 간격으로 세포 lysate 준비. 얼음, 그리고 세포 lysates 추가 분석을 위해 준비 시작을 인큐베이터에서 샘플 요리를 이동 합니다.

3. 인구 수준에서 분석 결과 동적 발신자-수신자: PMT에 의해 광 자극에 세포질 응답의 실시간 모니터링

  1. Trypsinize 및 발신자와 수신기 셀의 숫자 표준 방법. 혼합 104 수신기와 1.25 x 10 x 2.5의5 보낸 셀 (1:5 비율)의 1 mL 전체 볼륨을 준비 합니다.
    참고: 2:1, 1:1 또는 1:2 보낸 사람 수신기 비율 또한 작동 1.5 x 10의 전체 휴대폰 번호5. 10
  2. 플레이트 1 m m의 소를 포함 하는 문화 매체와 셀에 24-잘 블랙 플레이트의 각 잘 혼합.
  3. 플레이트 리더 luciferase 분석 결과 대 한 셀을 분석 하 고 출력 신호 기록 시스템에 대 한 너무 높은 되는지 확인.
    참고: 출력 신호 1 x 106 광자 수/s 보다 더 높은 경우에, 그들은 수 수 포화. 이 경우, 출력 신호는 1 x 106 광자 수/s 보다 낮은 최적의 값으로 소의 농도 줄일.
  4. 기록 시스템에 접시를 설정 하 고 녹음 프로그램 (그림 1D) 시작. 예를 들어 녹음 후 18 h에서 빛 조명을 시작 합니다.
    참고: 임시 필터링와 같은 이동 평균 및 Savitzky Golay 필터링, 신호 트렌딩 웨이브 폼의 시각화를 위한 유용 피크 탐지.

4. 단일 셀 수준에서 분석 결과 동적 발신자-수신자: 실시간 Optogenetic 섭 동 통제 단일 세포 응답의 이미징

  1. 플레이트 0.5 x 105 수신기 그리고 2.5 x 27 mm 직경 유리 베이스 35 m m 직경 요리에 105 보낸 사람 세포. 그 혼합 비율 및 총 세포 수 (셀 밀도) 올바르게 조정 됩니다 확인 하십시오.
  2. 도금, 후에 1 일 교환 기록 매체의 2 mL와 매체 (페 놀 레드 무료 DMEM 매체 보충 5 %FBS, 페니실린-스와 1mm 소), 현미경에 유리-기본 요리를 설정. 필요한 경우, PBS (-)와 죽은 세포의 파편 세척 한다.
    참고: 그것은 어두운 상태에서이 단계를 수행 하는 것이 좋습니다.
  3. 37 ° C, 5% CO2환경 챔버를 장착 한 거꾸로 한 현미경을 설정 합니다.
  4. 냉각된 CCD 카메라를 설정 합니다. 대상 값 (일반적으로-90 ° C) CCD 센서의 온도 아래로 냉각은 확인 하십시오.
  5. 5 분 간격으로 이미지와 보다 더 288를 자동 수집 소프트웨어에 "다차원 Timelapse" 창에 대 한 매개 변수 설정 (하나 이상의 야간 녹화) 시간.
    1. "다차원 Timelapse" 창을 열고, 풀 다운 메뉴에서 발광 채널 및 느린 50 kHz 읽기 모드를 선택 하 고 4 × 4 4 민 노출 binning 설정. 읽기 모드 읽어 소리를 약하게 발광 발광 빛을 감지를 줄이기 위한 중요 한 느린 50 kHz 모드로 설정 되어 있는지 확인 하십시오.
    2. "다차원 Timelapse" 창을 열고, 풀 다운 메뉴에서 형광 채널 및 고속 1mhz 읽기 모드를 선택 하 고 2 x 2 400 ms 노출 binning 설정. 읽기 모드 형광 영상에 필요한 시간을 줄이기 위해 빠른 1 MHz 모드로 설정 되어 있는지 확인 합니다.
    3. 시간 경과 "취득" 버튼을 클릭 하 여 녹음 시작 합니다.
  6. 다음과 같이 이미지 분석 소프트웨어, 시간 경과 영화에서 발광 채널의 단일 셀 자취를 추출 합니다. 먼저, 이미지 분석 소프트웨어를 이미지 데이터를 가져와서 발광 및 형광 스택 이미지를 확인 합니다. 발광 이미지에 대 한 ("SpikeNoise 필터"로 구현), 이전 및 다음 프레임의 시간 평균을 픽셀 값으로 바꿔 일시적으로 인접 한 이미지에서 픽셀의 농도 비교 하 여 우주선에서 파생 된 핫 픽셀 제거 이러한 처리 이미지 공간 스무 딩 필터를 적용 하 고 각 프레임에서 out-field 뷰의 배경 픽셀 값을 뺍니다. 그런 다음, "관심 영역"을 결정 (투자 수익) 각 시간 지점에서 형광 이미지에 각 셀에 대 한 투자 수익 발광 이미지를 적용 하 고 각 투자 수익의 발광 강도 측정.

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결과

우리는 LightOn 시스템11,12, 2-3 h 주기와 유전 발진기의 연구에 포유류 세포에 있는 사진 유도 유전자 발현을 가능 하 게 적응. 이 시스템은 두 부분: 사진 유도할 수 있는 transcriptional 활성 제 hGAVPO 및 드라이브의 임의 유전자의 전사를 UAS 발기인 카세트. 사진 유도 유전자 발현의 타악기 활동을 가속, UAS 발기인 카세트에 polyA 시퀀스 murine Hes1 3' UTR는 mRNA 반감기 murine fibroblasts에 20 분 단축에 의해 대체 되었다.

안정적인 셀 라인을 설정 하기 위해 Tol2 transposase 시스템에 따라 트라이 cistronic 벡터 사용된13

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토론

우리는 유전자 식 역학 2 ~ 3 h의 주기를 제어 하는 방법을 보였다. 이 시간 단위 Tet에 시스템 및 원래 LightOn 시스템을 포함 하 여 다른 기존 시스템에 있는 것 들 보다 훨씬 짧습니다. Ultradian 시간의 척도 도달 주요 매개 변수는 분자 제품 사진 유도, mRNAs 및 단백질의 반감기. 이러한 운동 매개 변수 세포 유형 및 종에 달려 있습니다. 활동을 조정에 대 한 다른 시퀀스 Hes1 3' UTR 대체 시퀀스 및 대상 단백질의 기능 변경 되지 않습니다 때문에 스트레이트-앞으로 방법입니다. 다른 3' Utr 바람직한 타악기 패턴 특히 관심사의 세포를, 추구에 대 한 라이브 셀 모니터링 dLuc 빛 유도 의해 좋은 출발점 및 사용 검사 및 유효성 검사에 대 한.

빛에 민감한 세포의 일일 처리에 대 한 가장 자주 묻는 질문 중 하나입니다. 노치 신호 보낸 사람 수신기 동적 분석 결과 경우 우리가 우리의 시스템 (사진 유도할 수 있는 dLuc 또는 Dll1 전지...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 진화 과학 및 기술 (JPMJCR12W2 (R.K.)), 과학 연구 혁신 분야 (교육, 문화, 스포츠, 과학, 및 기술 (MEXT), 일본에 대 한 특정 JST, 프레스 토 (A.I.), 핵심 연구에 의해 지원 되었다 26119708 (A.I.) 및 16 H 06480 (R.K.)), 과학 연구 (A) (일본 사회 과학 (JSP) 24240049의 승진에 대 한 (R.K.)), 그리고 젊은 과학자 (A) (JSP 15 H 05326 (A.I.)), 그리고 혁신적인 지역 "형광에 대 한 과학적 연구에 대 한 특정 라이브 이미지 "문 부 과학성, 일본, 그리고 플랫폼의 동적 접근에 대 한 생활 시스템을 문 부 과학성, 일본에서에서입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
FACSBecton, Dickinson and CompanyFACSAriaII SORP
카메라AndoriKon M-934
현미경OlympusIX-81 ZDC
PMT 장치Churitsu eletric corp.CL24B-LIC/B
블루 LED 조명기OptoCodeLEDB-SBOXH
DMEMNacalai08459-35
페니실린-스트렙토마이신Nacalai26253-84
소 태아 혈청시그마172012
KRYSTAL24(블랙 24웰 플레이트)하이테크303012
D-Luciferin 칼륨 SaltNacalai20028-24
조도계LI-COR BiosciencesLI-250A
항-HA-과산화효소 항체Roche클론 3F10
항-Actin-Peroxidase 항체Wako클론 2F3

참고문헌

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  16. Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
  17. Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).

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